Estrategia eficiente de diagnóstico de saliva por PCR con transcriptasa inversa cuantitativa del SARS-CoV-2 utilizando robots pipeteadores de código abierto

Hemos desarrollado una prueba de diagnóstico y un flujo de trabajo de COVID 19 basados en saliva de bajo costo que son fáciles de implementar y escalar para aplicaciones de detección comunitaria a gran escala. Aquí utilizamos robots de manejo de líquidos de código abierto, termocicladores estándar y software para realizar pruebas directas de saliva sin extracción o tampones de estabilización, al tiempo que proporcionamos resultados de diagnóstico precisos. Debido a los simples flujos de trabajo paralelos automatizados, el sistema se puede escalar para realizar miles de pruebas diarias con requisitos mínimos de equipo, espacio y personal.

Además de Kylie King, Rachel Ham, nuestra supervisora de laboratorio clínico y Austin Smothers, nuestra coordinadora de educación, ayudarán a demostrar el procedimiento Comience descontaminando el exterior de los tubos de recolección de saliva con 70% de etanol y transfiriéndolos al laboratorio para su análisis. Registre la llegada de la muestra escaneando cada código de barras de muestra en la hoja de cálculo de ingesta diaria. Trate con calor las muestras de escaneo durante 30 minutos en un horno de 95 grados Celsius y luego retire las muestras con guantes resistentes al calor.

Abra las hojas de cálculo de carga de muestras diarias para cada robot de carga de muestras en la estación de asignación de muestras. Luego asigne 188 muestras a cada placa de 384 pozos. Etiquetas de bandejas con nombre de placa, fecha y número de cuarto.

Escanee las muestras en orden en la hoja de cálculo de carga de muestras. En la estación de carga de muestras, alinee dos juegos completos de ocho bastidores impresos en 3D, correspondientes a la ubicación de la cubierta en el robot. Desencapar los tubos del cuarto uno y colocarlos en bastidores impresos en 3D, comenzando con la posición A1 en el bastidor uno.

Llene cada estante de izquierda a derecha y de arriba a abajo. Continúe con este patrón de carga en el bastidor dos, luego proceda a los bastidores cuatro y cinco. Coloque los bastidores de muestra del cuarto uno cargados en las cubiertas uno, dos, cuatro, cinco, siete, ocho, 10, 11.

Coloque las puntas P20 en las cubiertas tres y nueve. Para simplificar el proceso de configuración, cargue materiales de atrás hacia adelante en el robot. Las placas de mezcla maestra se producen en un robot dedicado y se almacenan a cuatro grados centígrados.

Una placa se usa a la vez y está etiquetada con el nombre de la placa, y se usa una cuchilla afilada para cortar una línea en la lámina alrededor de los pozos de control. Coloque la placa de mezcla maestra en la cubierta seis y despegue la cubierta de la lámina, dejando atrás el pequeño rectángulo que cubre los pozos de control. Destapa las cajas de puntas y cierra el robot.

Inicialice el protocolo operativo python personalizado haciendo clic en iniciar ejecución a través de la aplicación de escritorio del robot. Cada trimestre tarda 24,5 minutos en cargarse en el plato. Establezca un temporizador como recordatorio.

Mientras el robot está funcionando, desencaje y cargue un cuarto de dos tubos de muestra en el segundo conjunto de bastidores impresos en 3D. Cuando el robot se detenga, retire los bastidores del cuarto uno y reemplácelos por los bastidores del cuarto dos, luego haga clic en reanudar ejecución en la aplicación de escritorio. Recapitule los tubos de muestra de un cuarto y guárdelos en un refrigerador de cuatro grados Celsius mientras espera los resultados.

Repita este proceso de carga durante los trimestres tres y cuatro. Transfiera la placa cargada a un gabinete de bioseguridad. Para minimizar la contaminación, mantenga la placa cubierta durante la transferencia.

Reúna las muestras repetidas y asígnelas como las últimas muestras en el cuarto trimestre. Numere las muestras, escanee los códigos de barras e ingrese la ubicación original de la muestra y el resultado en la hoja de cálculo de carga de muestras. Transfiera las muestras repetidas al gabinete de bioseguridad.

No cargue los tubos de muestra repetidos en los bastidores de carga del robot. Pipetee dos microlitros de cada muestra repetida a los pozos correctos. Use la pipeta designada para agregar muestras de pacientes.

Mantenga los pozos de control cubiertos con papel de aluminio mientras agrega muestras para minimizar la contaminación. Despegue la cubierta de papel de aluminio sobre los pozos de control con fórceps. Pipetear dos microlitros de muestras de pacientes positivos confirmados en los pozos M23 y M24.

Pipetear dos microlitros de agua libre de nucleasa a los pozos N23 a N24 y dos microlitros de 200 copias por microlitro de control positivo mixto a los pozos O23 a O24. Deje los pozos P23 a P24 vacíos para monitorear la calidad del lote de mezcla maestra. Cubra la placa con un sello ópticamente transparente y use el rodillo aplicador para adherir el sello a todos los pozos.

Vórtice la placa a 2, 500 RPM durante 30 segundos para mezclar bien, luego centrífuga la placa a 500 veces G durante un minuto. Seleccione el programa de protocolo en el software del termociclador y guarde el protocolo para futuras placas. Coloque la placa sellada en el termociclador y ejecute el protocolo.

Exporte los valores de CT y copie los valores en la hoja de cálculo de carga de muestra. Para el control positivo, verifique si al menos un pozo de control positivo produce valores de TC entre 22 y 28 para las sondas P1 y N1. Alternativamente, los pozos de muestra positivos conocidos producen valores de CT P1 y N1 inferiores a 33 en las sondas P1 y N1.

Para el control negativo, verifique que no haya valores de TC N1 o P1 en ninguno de los dos pozos de control negativos. Confirme que los valores de TC tienen curvas de amplificación válidas antes de invalidar la placa. Si P1 produce un resultado de TC inferior a 33, considere el pozo como válido y proceda a resultar de N1. Si P1 produce un resultado de CT mayor o igual a 33 o ningún valor de CT, considere el pozo como no válido.

Si N1 produce un resultado de TC inferior a 33, evalúe el pozo como sí. Si N1 no produce un valor de TC, evalúe el pozo como no. Si N1 produce un valor ct mayor o igual a 33, evalúe el pozo como ninguna estrella.

Confirme que todos los valores de N1 CT están asociados con una curva de amplificación real. Si un valor de TC para N1 no tiene curva de amplificación, el pozo es no. Identifique las muestras repetidas, etiquételas con un número de muestra interno y un tipo de muestra y devuélvalas al flujo de trabajo de carga.

Las imágenes representativas muestran la detección RTQ PCR de ARN sintético N1 o SARS CoV-2 y ADN sintético P1 o HSRPP30. Las curvas estándar se trazaron con desviaciones estándar para determinar el rango de detección precisa utilizando esta combinación de imprimación de sonda. Los valores medios de TC obtenidos en las respectivas diluciones se trazaron contra la cantidad estimada de ARN sintético y ADN sintético.

En ambos casos, las curvas lineales mostraron buenos coeficientes de correlación en una amplia gama de concentraciones de copias de genes. Los valores de TC N1 obtenidos de muestras únicas utilizando tanto el robot como la carga manual de muestras se transpusieron para determinar la variabilidad entre ensayos entre la carga manual y la del robot. La relación lineal entre los métodos manual y automatizado produjo un alto coeficiente de correlación que indica que ambos métodos son funcionalmente equivalentes.

La variabilidad intra ensayo también se determinó utilizando valores de TC N1 replicativos transpuestos obtenidos tanto del robot como de la carga manual de muestras. La evaluación de los métodos de tratamiento térmico para la reducción de la viscosidad en la saliva se muestra aquí. La saliva negativa para el SARS CoV-2 se recogió de una sola fuente y las alícuotas se trataron con calor durante cero minutos, 30 minutos o 60 minutos a 95 grados centígrados.

Los valores de TC P1 de réplicas técnicas de cada afección se trazaron para determinar la variabilidad entre los métodos de tratamiento. Los métodos de tratamiento térmico de 30 minutos y 60 minutos produjeron una disminución significativa de la variabilidad de la muestra en comparación con ningún control de tratamiento. No hubo diferencias significativas entre los tratamientos de 30 minutos y 60 minutos.

Por lo tanto, se implementó el método de tratamiento térmico de 30 minutos para reducir el tiempo de procesamiento. Utilice la técnica aséptica adecuada para minimizar la contaminación de las placas de prueba, particularmente al cargar muestras y controles manuales. Evite cruzar el plato con las manos o las mangas.

Después de que se producen los resultados clínicos, las muestras se pueden eliminar en desechos de riesgo biológico o se pueden guardar para un análisis posterior, como la secuenciación del genoma completo para determinar cepas específicas. Esta técnica permite realizar pruebas comunitarias a gran escala, lo que nos permite investigar los efectos de la cobertura de las pruebas y la propagación no sintomática de Covid 19.