Name: Flujo de trabajo experimental y de análisis de datos para nanoindentación de materia blanda (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Aprende a medir la rigidez de hidrogeles y células mediante nanoindentación con un nanoindentador comercial y software Python de código abierto. Este protocolo simplifica el análisis mecánico de materiales blandos.

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GC y MAGO reconocen a todos los miembros del CeMi. MSS reconoce el apoyo a través de una subvención del programa EPSRC (EP/P001114/1).
GC: software (contribución al desarrollo de software y algoritmos), análisis formal (análisis de datos de nanoindentación), validación, investigación (experimentos de nanoindentación en geles de poliacrilamida), curación de datos, redacción (borrador original, revisión y edición), visualización (figuras y gráficos). MAGO: investigación (preparación de geles y muestras de células, experimentos de nanoindentación en células), redacción (borrador original, revisión y edición), visualización (figuras y gráficos). NA: validación, redacción (revisión y edición). IL: software (contribución al desarrollo de software y algoritmos), validación, escritura (revisión y edición); MV: conceptualización, software (diseño y desarrollo de software original y algoritmos), validación, recursos, redacción (borrador original, revisión y edición), supervisión, administración de proyectos, adquisición de fondos MSS: recursos, redacción (revisión y edición), supervisión, administración de proyectos, adquisición de fondos. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo muestra cómo adquirir de forma robusta datos de nanoindentación de espectroscopía de fuerza utilizando un nanoindentador superior de virola disponible comercialmente tanto en hidrogeles como en células individuales. Además, se proporcionan instrucciones para el uso de un software de código abierto programado en Python que comprende un flujo de trabajo preciso para el análisis de datos de nanoindentación.
Pasos críticos en el protocolo Se ha determinado que lo...

El papel fundamental de la mecánica en biología está hoy establecido 1,2. Desde tejidos enteros hasta células individuales, las propiedades mecánicas pueden informar sobre el estado fisiopatológico del biomaterial investigado 3,4. Por ejemplo, el tejido mamario afectado por el cáncer es más rígido que el tejido sano, un concepto que es la base de la popular prueba de palpación5. En particular, recientemente se ha demostrado que la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) causada por el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) está subrayada por cambios en las propiedades mecánicas de las células sanguíneas, incluida la disminución de la deformabilidad de los eritrocitos y la disminución de la rigidez de los linfocitos y neutrófilos en comparación con las células sanguíneas de individuos sin SARS-CoV-26.
En general, la mecánica de las células y los tejidos está inherentemente entrelazada: cada tejido tiene propiedades mecánicas específicas que influyen y dependen simultáneamente de las células constituyentes y de la matriz extracelular (MEC)5. Debido a esto, las estrategias para estudiar mecánica en biología a menudo implican sustratos de ingeniería con estímulos mecánicos fisiológicamente relevantes para dilucidar el comportamiento celular en respuesta a esos estímulos. Por ejemplo, el trabajo seminal de Engler y sus colegas demostró que el compromiso del linaje de células madre mesenquimales está controlado por la elasticidad de la matriz, como se estudió en hidrogeles de poliacrilamida bidimensional blanda y rígida (PAAm)7.
Existen muchas estrategias para caracterizar mecánicamente el biomaterial bajo investigación, variando en escala espacial (es decir, local a granel) y en el modo de deformación (por ejemplo, axial vs cizallamiento), lo que produce información diferente, lo que requiere una interpretación cuidadosa 3,8,9,10. La mecánica de los biomateriales blandos se expresa comúnmente en términos de rigidez. Sin embargo, la rigidez depende tanto de las propiedades del material como de la geometría, mientras que los módulos elásticos son propiedades fundamentales de un material y son independientes de la geometría del material11. Como tal, diferentes módulos elásticos están relacionados con la rigidez de una muestra dada, y cada módulo elástico abarca la resistencia del material a un modo específico de deformación (por ejemplo, axial vs cizallamiento) bajo diferentes condiciones de contorno (por ejemplo, expansión libre vs confinamiento)11,12. Los experimentos de nanoindentación permiten la cuantificación de propiedades mecánicas a través de la E que se asocia con deformación uniaxial (indentación) cuando el biomaterial no está confinado lateralmente10,11,12.
El método más popular para cuantificar E de sistemas biológicos a microescala es AFM13,14,15,16. AFM es una herramienta extremadamente poderosa con resolución de fuerza hasta el nivel de pN y resolución espacial hasta la escala sub-nm. Además, AFM ofrece una flexibilidad extrema en términos de acoplamiento con herramientas ópticas y mecánicas complementarias, ampliando sus capacidades para extraer una gran cantidad de información del biomaterial bajo investigación13. Esas características atractivas, sin embargo, vienen con una barrera de entrada representada por la complejidad de la configuración experimental. AFM requiere una amplia capacitación antes de que los usuarios puedan adquirir datos sólidos, y su uso para la caracterización mecánica diaria de materiales biológicos a menudo no está justificado, especialmente cuando no se requiere su fuerza única y resoluciones espaciales.
Debido a esto, una nueva clase de nanoindentadores ha ganado popularidad recientemente debido a su facilidad de uso, al tiempo que ofrece datos comparables con AFM con resolución de fuerza sub-nN y resolución espacial μm, reflejando las fuerzas ejercidas y percibidas por las células en escalas de longitud relevantes2. En particular, los dispositivos de nanoindentación de la parte superior de la virola basados en la tecnología de detección de fibra óptica17,18 han ganado popularidad entre los investigadores activos en el campo de la mecanobiología y más allá; y se han publicado una gran cantidad de trabajos que informan sobre las propiedades mecánicas de los biomateriales que utilizan estos dispositivos, incluidas las células19,20, los hidrogeles8,21 y los tejidos22,23. A pesar de las capacidades de estos sistemas para sondear las propiedades mecánicas dinámicas locales (es decir, el módulo de almacenamiento y pérdida), los experimentos cuasiestáticos que producen E siguen siendo la opción más popular 8,19,20,21. En resumen, los experimentos de nanoindentación cuasiestática consisten en sangrar la muestra con una velocidad constante hasta un punto de ajuste definido por un desplazamiento máximo, fuerza o profundidad de hendidura, y registrar tanto la fuerza como la posición vertical del voladizo en las llamadas curvas de fuerza-distancia (F-z). Las curvas F-z se convierten en curvas de fuerza-indentación (F-δ) a través de la identificación del punto de contacto (CP), y se ajustan con un modelo mecánico de contacto apropiado (generalmente el modelo de Hertz13) para calcular E.
Si bien el funcionamiento de los nanopenetradores superiores de virola se asemeja a las mediciones de AFM, hay especificidades que vale la pena considerar. En este trabajo, se proporciona una guía paso a paso para adquirir robustamente curvas F-z de células e hidrogeles que imitan tejidos utilizando un nanoindenter superior de virola disponible comercialmente, con el fin de fomentar la estandarización de procedimientos experimentales entre grupos de investigación que utilizan este y otros dispositivos similares. Además, se dan consejos sobre cómo preparar mejor las muestras y células de hidrogel para realizar experimentos de nanoindentación, junto con consejos de solución de problemas a lo largo de la vía experimental.
Además, gran parte de la variabilidad en los resultados de nanoindentación (es decir, E y su distribución) depende del procedimiento específico utilizado para analizar los datos, que no es trivial. Para abordar este problema, se proporcionan instrucciones para el uso de un software de código abierto recientemente desarrollado programado en Python y equipado con una interfaz gráfica de usuario (GUI) fácil de usar para el análisis por lotes de curvas F-z . El software permite una rápida selección de datos, filtrado de datos, cálculo del CP a través de diferentes procedimientos numéricos, el cálculo convencional de E, así como un análisis más avanzado llamado espectros de elasticidad24, lo que permite estimar el módulo de Young a granel de la célula, el módulo de Young de la corteza de actina y el grosor de la corteza de actina. El software se puede descargar libremente desde GitHub y se puede adaptar fácilmente para analizar datos procedentes de otros sistemas agregando un analizador de datos apropiado. Se enfatiza que este protocolo se puede usar para otros dispositivos de nanoindentación superior de virola, y otros dispositivos de nanoindentación en general, siempre que algunos pasos se adapten de acuerdo con las pautas específicas del instrumento. El protocolo se resume esquemáticamente en la figura 1.

<table><tbody><tr><td>Cubreobjetos de 12 mm</td><td>VWR</td><td>631-1577P</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo tratadas con células de 35 mm</td><td>Greiner CELLSTAR</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>Acrilsilano</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16400</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Merk</td><td>7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Bisacrilamida</td><td>Merk</td><td>110-26-9</td><td></td></tr><tr><td>Óptica de nanoindentador Chiaro</td><td>11 Life</td><td></td><td>&nbsp; sin número de católogo Etanol</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>general</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>DMEM de glucosa</td><td>alta Gibco</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td></td><td></td><td>general</td></tr><tr><td>Kimwipe Kimberly</td><td>Clark</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio para microscopio</td><td>VWR</td><td>631-1550P</td><td></td></tr><tr><td>Sistema MilliQ</td><td>Merk Millipore</td><td>ZR0Q008WW</td><td></td></tr><tr><td>OP1550 Interferómetro</td><td>Óptica11 Vida</td><td></td><td>sin número de catálogo</td></tr><tr><td>Óptica 11 Sonda de vida (k = 0,02-0,005 N/m, R = 3-3,5 mmm)</td><td>Óptica 11 Vida</td><td></td><td>sin número de católogo</td></tr><tr><td>Óptica 11 Sonda de vida (k = 0,46-0,5 N/m, R = 50-55 mmm)</td><td>Óptica 11 Vida</td><td></td><td>sin número de católogo</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RainX repelente a la lluvia</td><td>RainX</td><td>26012</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri estándar (90 mm)</td><td>Thermo Scientific</td><td>101RTIRR</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110-18-9</td><td></td></tr><tr><td>Desecador de vacío</td><td>Thermo Scientific</td><td>531-0250</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de adquisición de datos (v 3.4.1)</td><td>Optics 11 Life</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GitHub Desktop (opcional)</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Python 3</td><td>Python Software Foundation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visual Studio Code (opcional)</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

flujo de trabajo experimental y de análisis de datos para nanoindentación de materia blanda

Experimental and Data Analysis Workflow for Soft Matter Nanoindentation

La nanoindentación se refiere a una clase de técnicas experimentales en las que se utiliza una sonda de fuerza micrométrica para cuantificar las propiedades mecánicas locales de biomateriales blandos y células. Este enfoque ha ganado un papel central en los campos de la mecanobiología, el diseño de biomateriales y la ingeniería de tejidos, para obtener una caracterización mecánica adecuada de materiales blandos con una resolución comparable al tamaño de células individuales (μm). La estrategia más popular para adquirir tales datos experimentales es emplear un microscopio de fuerza atómica (AFM); Si bien este instrumento ofrece una resolución sin precedentes en fuerza (hasta pN) y espacio (sub-nm), su usabilidad a menudo está limitada por su complejidad que impide mediciones rutinarias de indicadores integrales de propiedades mecánicas, como el módulo de Young (E). Una nueva generación de nanoindentadores, como los basados en la tecnología de detección de fibra óptica, ha ganado popularidad recientemente por su facilidad de integración al tiempo que permite aplicar fuerzas sub-nN con resolución espacial μm, por lo que es adecuado para sondear las propiedades mecánicas locales de hidrogeles y células.
En este protocolo, se presenta una guía paso a paso que detalla el procedimiento experimental para adquirir datos de nanoindentación en hidrogeles y células utilizando un nanopenetrador de detección de fibra óptica en la parte superior de la virola disponible comercialmente. Mientras que algunos pasos son específicos para el instrumento utilizado en este documento, el protocolo propuesto se puede tomar como guía para otros dispositivos de nanoindentación, siempre que algunos pasos se adapten de acuerdo con las pautas del fabricante. Además, se presenta un nuevo software Python de código abierto equipado con una interfaz gráfica de usuario fácil de usar para el análisis de datos de nanoindentación, que permite la detección de curvas adquiridas incorrectamente, el filtrado de datos, el cálculo del punto de contacto a través de diferentes procedimientos numéricos, el cálculo convencional de E, así como un análisis más avanzado particularmente adecuado para datos de nanoindentación de células individuales.

Siguiendo el protocolo, se obtiene un conjunto de curvas F-z . Lo más probable es que el conjunto de datos contenga curvas buenas y curvas que se descartarán antes de continuar con el análisis. En general, las curvas deben descartarse si su forma es diferente de la que se muestra en la Figura 4A. La Figura 5AI muestra un conjunto de datos de ~100 curvas obtenidas en un hidrogel PAAm blando de E 0.8KPa 35 esperado cargado...

El protocolo presenta un flujo de trabajo completo para experimentos de nanoindentación de materiales blandos, incluidos hidrogeles y células. En primer lugar, se detallan los pasos experimentales para adquirir datos de espectroscopia de fuerza; luego, el análisis de dichos datos se detalla a través de un software Python de código abierto recientemente desarrollado, que se puede descargar gratis desde GitHub.

Flujo de trabajo experimental y de análisis de datos para nanoindentación de materia blanda

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft ...

Este protocolo muestra una guía paso a paso para medir la rigidez de hidrogeles y células utilizando un nanopenetrador disponible comercialmente y también presenta un software de código abierto para analizar de forma reproducible los datos adquiridos. Sin embargo, el protocolo nos permite obtener datos similares a la microscopía de fuerza atómica a una fracción de la complejidad. Por lo tanto, este protocolo será útil para los científicos interesados en estudiar las propiedades mecánicas de muestras sanas y enfermas, pero también creemos que será de mayor aplicabilidad en el contexto de la nanoindentación para materiales blandos.Después de encender el instrumento y montar la sonda seleccionada para el experimento, comience a calibrar la sonda. Haga clic en Inicializar en la ventana principal del software. En el menú Calibración que aparece, introduzca los detalles de la sonda en los cuadros de entrada.A continuación, llene una placa de Petri gruesa de vidrio con un fondo plano con el mismo medio que el plato de muestra, y haga coincidir la temperatura del medio con la de la muestra. Luego, coloque el plato de calibración debajo de la sonda. Para la calibración en líquido, humedezca previamente la sonda con una gota de etanol al 70% o isopropanol con el extremo de la pipeta en contacto ligero con la virola de vidrio, de modo que la gota se deslice sobre el voladizo y la punta esférica.Luego, deslice manualmente el brazo del nanoindentador hacia abajo hasta que la sonda esté completamente sumergida pero aún lejos del fondo de la placa de Petri. Espere cinco minutos para permitir que se alcancen las condiciones de equilibrio en el líquido. A continuación, en el menú Inicializar del software, haga clic en Longitud de onda de escaneo.La pantalla del interferómetro mostrará una barra de progreso. Compruebe si el escaneo óptico se realizó correctamente navegando hasta el panel Escaneo de longitud de onda en la caja del interferómetro. A continuación, en el menú Inicializar, haga clic en Buscar superficie para bajar progresivamente la sonda.La sonda deja de moverse cuando entra en contacto con la placa de Petri de vidrio. Una vez que la sonda esté en contacto con la superficie, mueva la sonda hacia abajo un micrómetro usando el botón de flecha y hacia abajo en la ventana principal del software. Observe la señal verde en la ventana en vivo para detectar cambios en la línea de base con cada paso de un micrómetro.A continuación, haga clic en Calibrar en el menú Inicializar. Cuando se complete la calibración, compruebe los factores de calibración antiguos y nuevos en la ventana emergente que se muestra. Si el nuevo factor de calibración está en el rango correcto, como se explica en el manuscrito, haga clic en Usar nuevo factor.A continuación, sube el piezo 500 micrómetros. A continuación, compruebe si el círculo de demodulación se ha calibrado correctamente navegando a la pestaña Demodulación en el escritorio del interferómetro. Golpee suavemente la mesa óptica o el nanopenetrador para inducir suficiente ruido.Un círculo blanco de puntos de datos discretos debe cubrir aproximadamente el círculo rojo. Cargue la placa de Petri que contiene la muestra en la etapa del microscopio y mueva manualmente la sonda del nanoindentador a la posición deseada sobre la muestra. Deslice la sonda en solución, teniendo cuidado de dejar uno o dos milímetros entre la sonda y la superficie de la muestra.Espere cinco minutos para que la sonda se equilibre en solución. Concéntrese en la sonda con el microscopio óptico. Para medir el módulo de Young de materiales blandos, haga clic en Configurar experimento.Agregue un paso Buscar superficie y una sola sangría en el control de desplazamiento para determinar los parámetros experimentales que se utilizarán posteriormente para el escaneo automático de matrices. Si la sangría única se realiza correctamente, configure una exploración matricial que contenga de 50 a 100 puntos espaciados de 10 a 100 micrómetros. Después de asegurarse de que la casilla Encontrar superficie automática esté marcada, haga clic en Usar posición de etapa para iniciar el escaneo de matriz desde la posición de etapa actual.Configure el perfil de escaneo de matriz en el control de desplazamiento. Deje el número de segmentos en cinco y utilice el perfil de desplazamiento predeterminado. Si es necesario, cambie el perfil de desplazamiento y el tiempo para cada segmento inclinado.No exceda las tasas de deformación superiores a 10 micrómetros por segundo. Guarde el experimento configurado en la ruta de acceso del experimento deseada. Haga clic en Ejecutar experimento y espere a que se complete.Cuando se adquieran todos los datos, limpie la sonda y apague el instrumento como se describe en el texto. Para la detección de curvas de desplazamiento de fuerza y la producción de conjuntos de datos limpios en formato JSON, inicie prepare. py desde la línea de comandos en el equipo del laboratorio.Seleccione el formato de datos Optics11 de la lista desplegable. Si los datos no se cargan correctamente, vuelva a iniciar la interfaz gráfica de usuario y seleccione Optics11 Old. Luego, haga clic en Cargar carpeta y seleccione una carpeta que contenga los datos a analizar.Limpie el conjunto de datos utilizando las pestañas presentes a la derecha de la interfaz gráfica de usuario. Luego, haga clic en Guardar JSON e ingrese un nombre apropiado para el conjunto de datos limpiado. Envíe el archivo JSON a la computadora donde se instaló el software NanoAnalysis, si es diferente de la computadora actual.Lanza el nano. py desde la línea de comandos. En la parte superior izquierda de la interfaz gráfica de usuario, haga clic en Cargar experimento y seleccione el archivo JSON.Esto rellenará la lista de archivos y el gráfico de curvas sin procesar que muestra el conjunto de datos en términos de curvas de desplazamiento de fuerza. En el cuadro Estadísticas, compruebe los valores de los tres parámetros, N activado, N fallido y N excluido. Para visualizar una curva específica con más detalle, haga clic en la curva.Esto lo resaltará en verde y lo mostrará en el gráfico de curva actual. Una vez que se ha seleccionado una sola curva, los parámetros R y k se rellenarán en el cuadro Estadísticas. Una vez que el conjunto de datos se haya limpiado aún más, filtre cualquier ruido en las curvas utilizando los filtros implementados en el cuadro Filtrado.A continuación, inspeccione las curvas filtradas en el gráfico de curvas actual. La curva filtrada está en negro, mientras que la versión no filtrada es verde. Para encontrar el punto de contacto, en el cuadro Punto de contacto, elija uno de una serie de procedimientos numéricos que se han implementado en el software.Ajuste los parámetros del algoritmo para adaptarse al conjunto de datos para que el punto de contacto se ubique correctamente, como se explica en el manuscrito. Para ver dónde se ha encontrado el punto de contacto en una sola curva, seleccione la curva haciendo clic en ella. A continuación, haga clic en Inspeccionar.Compruebe la ventana emergente que aparece para identificar dónde se ha ubicado el punto de contacto. A continuación, haga clic en Análisis de hercios. Esto generará tres gráficos.Compruebe los datos de sangría de fuerza para cada curva en el conjunto de datos, junto con el ajuste promedio de Hertz que se muestra en rojo. A continuación, compruebe la curva de indentación de fuerza media con una banda de error que muestre una desviación estándar, junto con el ajuste medio de Hertz que se muestra en rojo. A continuación, verifique el diagrama de dispersión del módulo de Young que se origina al ajustar el modelo de Hertz a cada curva individual.Inspeccione el cuadro Resultados para el módulo de Young medio calculado y su desviación estándar, y asegúrese de que sean razonables para el experimento dado. Luego, en el cuadro Guardar, haga clic en Hertz. En la ventana emergente, ingrese el nombre del archivo y el directorio, y haga clic en Guardar.Se creará un archivo tsv. Abra el archivo tsv en cualquier software adicional para el análisis estadístico y el trazado posterior. Para obtener datos de nanoindentación celular, haga clic en Análisis de espectros de elasticidad.Inspeccione las dos gráficas producidas, a saber, el módulo de Young en función de la profundidad de sangría para cada curva y el módulo de Young promedio en función de la sangría ajustada por un modelo bicapa. Una vez finalizado el análisis, haga clic en ES en el cuadro Guardar. Esto exportará un archivo tsv en el directorio especificado, que se puede abrir y trazar en cualquier otro software de su elección.Un experimento exitoso da como resultado el segmento de aproximación de una curva de desplazamiento de fuerza, que tiene una línea de base clara y plana, una región de transición y una región inclinada. Las curvas que muestran alteraciones de esta forma se eliminan fácilmente del conjunto de datos utilizando NanoPrepare. Aquí se muestran las curvas de fuerza-indentación promedio junto con el modelo de Hertz promedio para un hidrogel de poliacrilamida blanda y un hidrogel rígido.Al trazar los valores individuales del módulo de Young, se recuperó el módulo de Young promedio esperado para ambos hidrogeles. Para los experimentos de nanoindentación celular, la curva de fuerza-indentación promedio y el modelo de Hertz promedio correspondiente demuestran que el modelo de Hertz no captura completamente la evolución de la fuerza con el aumento de la profundidad de indentación para los experimentos de nanoindentación celular. Aquí se demuestran los espectros de elasticidad promedio ajustados hasta una hendidura de 200 nanómetros.Los espectros de elasticidad promedio comienzan a aumentar a una profundidad de indentación de 200 nanómetros, lo que indica la contribución de un sustrato al módulo de Young aparente sondeado. Debido a esto, se eligió 200 nanómetros como el rango de ajuste tanto para el modelo Hertz como para el modelo bicapa. El ajuste del modelo bicapa permite extraer más información sobre el estado mecánico de la célula, incluido el grosor de la corteza de actina celular, el módulo de la corteza de actina celular y el módulo de masa celular, como se explica en el texto principal.Una comparación directa entre el modelo de Hertz y el enfoque de espectros de elasticidad en términos de la distribución del módulo de Young revela distribuciones superpuestas con medias comparables, lo que demuestra la viabilidad del enfoque de espectros de elasticidad. Localizar con precisión el punto de contacto y mantener los parámetros del algoritmo elegidos consistentes entre los conjuntos de datos que se desean comparar es primordial para obtener comparaciones confiables entre muestras. El método es de aplicabilidad general para cuantificar las propiedades elásticas locales de muestras biológicas, incluyendo esferoides, organoides, tejidos y, en general, toda la materia blanda.

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