Name: Eliminación de un sitio de inicio traslacional interno del ARNm mientras se conserva la expresión de la proteína de longitud completa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Aprende a genotipar mutaciones puntuales en modelos murinos mediante PCR y enzimas de restricción para identificar el alelo Gja1 M213L. Este protocolo eficiente permite distinguir genotipos por patrones de bandas en gel de agarosa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El proyecto fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R01HL152691, R01HL138577 y R01HL159983) a RMS.

"Todos los protocolos de cuidado y estudio de animales fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico Cedars-Sinai y la Universidad de Utah. Para los experimentos se utilizaron ratones hembra C57BL/6J obtenidos de fuentes comerciales a las 8-9 semanas de edad (ver Tabla de Materiales).
1. Preparación para la orientación genética
<ol><li>Seleccione la secuencia diana guía alrededor del sitio de mutación objetivo que codifica M213 utilizando el algoritmo web CRISPOR 4,9,10 (consulte la Tabla de materiales). NOTA: Se seleccionó una secuencia guía de 20 bases (ATTCAGAGCGAGAGACACCA), en la hebra opuesta a la secuencia codificante GJA1, con una puntuación MIT11 de 62 en la que el sitio de escisión potencial se encuentra después de 16 bases aguas abajo del codón a mutar (ATG) (Figura 1; toda la secuencia de CRRNA se muestra en la Tabla 1).</li>
	<li>Sintetizar el arncr y el arNtra que interactúan con Cas9 como ARNguía 12. NOTA: Aunque la puntuación del MIT del ARN guía es de 62, solo hay una posible mutación fuera del objetivo con cuatro desajustes a más de 12 bases del PAM. Por lo tanto, esta guía de ARN se considera segura.</li>
	<li>Diseñar un oligo donante complementario a la secuencia guía para introducir una única sustitución de aminoácidos (ATG a TTA; M213L) con brazos de homología de 60 y 48 bases en los lados 5' y 3', respectivamente. NOTA: Este oligo donante incluye una mutación puntual para la interrupción del PAM (AGG a ACG) mediante la introducción de una mutación silenciosa (TCC a TCG; S217S) para evitar la reedición después de la reparación dirigida por homología CRISPR (HDR)13 para la introducción de las mutaciones previstas (Figura 1 y Tabla 1).</li>
	<li>Use NaCl (concentración final de 200 mM) para precipitar 10 μg de oligos para minimizar el arrastre de sal al tampón de microinyección pronuclear (10 mM de Tris-HCl, pH 7.5; 0.1 mM de EDTA y 100 mM de NaCl sin espermina y espermidina14). NOTA: No lave el pellet de ADN con etanol al 70%, ya que el pellet se puede disolver en la solución.</li>
	<li>Mezclar 50 ng/μL de oligo donante, 60 ng/μL de mezcla de arncr/artracrRNA (relación molar 1:1) (a partir del paso 1.2) y 50 ng/μL de proteína eSpCas9 (ver Tabla de Materiales) para hacer mezcla CRISPR en volumen final 20 μL (Tabla 2). Disminuir la concentración del oligo donante si se observa una alta toxicidad (por ejemplo, 25 ng/μL).</li>
</ol>2. Inducción de superovulación, recolección de huevos, microinyección pronuclear de mezcla CRISPR y detección de blastocistos
NOTA: Este procedimiento sigue un protocolo general14 publicado anteriormente.
<ol><li>Inyecte 5 UI de PMSG (gonadotropina sérica de yegua preñada) (ver Tabla de materiales) en 100 μL de agua estéril a 5-10 ratones a las 8 semanas de edad mediante un enfoque intraperitoneal aproximadamente a las 3:00 p.m. (día 1).</li>
	<li>Inyectar 5 UI de hCG (gonadotropina coriónica humana) (ver Tabla de Materiales) en 100 μL de agua estéril a las donantes de óvulos mediante un enfoque intraperitoneal 46-48 h después de la inyección de PMSG (día 3). Establezca la cría 1: 1 con machos de sementales.</li>
	<li>Cosechar los huevos fertilizados en medio M2 con hialuronidasa, lavar tres veces en 100 μL de medio M2 alrededor de las 10:00 a.m., luego mantener en medio mWM15 o KSOM16 (día 4) (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Introducir la mezcla CRISPR (paso 1.3) en embriones en etapa de 1 célula cosechados de los ratones por microinyección pronuclear14 en 100 μL de M2 cubiertos con aceite de parafina en un plato de plástico en un microscopio invertido con una óptica que mejora el contraste a primera hora de la tarde (Video 1). NOTA: La microinyección pronuclear de la mezcla CRISPR se realizó en embriones en etapa de 1 célula a las 14-16 h postcoitum (p.c.). Los embriones inyectados se cultivaron en una incubadora de CO2 al 5% durante unas horas y se transfirieron quirúrgicamente a las 18-20 h p.c. en ratones ICR receptores que tenían un tapón de cópula en la misma mañana.</li>
	<li>Transfiera 20-30 embriones de 2 células a cada receptor para producir animales recombinantes. NOTA: Siga el protocolo general14 o cultive esos embriones en medio mWM o KSOM durante 4 días para validar la eficiencia y examinar la toxicidad. La toxicidad de la mezcla CRISPR es aceptable cuando al menos un tercio de los embriones inyectados alcanzan temprano la etapa de blastocisto completamente expandido con múltiples recombinantes entre ellos. Al mismo tiempo, más del 90% de los embriones no manipulados alcanzan la misma etapa de blastocisto en un cultivo paralelo. Siga el paso 2.6-2.9 para la detección de blastocitos, que no es esencial, pero se puede hacer si se prefiere cuantificar la tasa de éxito de HDR.</li>
	<li>Recoger individualmente blastocistos tempranos a completamente expandidos con 2 μL de medio de cultivo utilizando una punta de pipeta fina tapada con un micropipetador en tubos de PCR individuales (día 8; Vídeo 2).</li>
	<li>Lise blastocistos en 8 μL de mezcla de digestión (igual que el paso 3.2; ver Tabla de Materiales) y procese a 75 °C durante 10 min, 95 °C durante 5 min, luego enfríe hasta 4 °C para su almacenamiento. Utilice 2 μL del lisado como plantilla para pcr en una mezcla total de PCR de 15 μL (paso 3).</li>
	<li>Examinar la eficacia del HDR mediante electroforesis en gel de agarosa17 de las muestras de PCR después de la digestión de restricción con NlaIII (paso 3-5).</li>
	<li>Confirme el estado de la recombinación dirigida secuenciando el amplicón17 de 668 pb en los fundadores y la progenie posterior para confirmar la integridad de la mutación.</li>
</ol>3. Extracción de ADN
NOTA: Los ratones en el día postnatal 10 se utilizaron para este experimento debido a la muerte súbita del ratón knock-out GJA1-20k alrededor de 2-4 semanas después del nacimiento4. También se puede aplicar un protocolo más general después del informe18 publicado anteriormente.
<ol><li>Corte 1-3 mm de la punta del dedo del pie o la punta de la cola con tijeras limpias y transfiéralo a un tubo de PCR de 0,2 ml y 8 tiras. Para evitar la contaminación entre las muestras del dedo del pie o la cola, use tijeras prelimpiadas o una cuchilla por ratón o limpie antes de cada muestra con etanol al 70% o blanqueador al 10%. Si la cola sangra después del muestreo, aplique una breve presión con una gasa para detener la hemorragia. Guarde las muestras de cola a -20 °C hasta la extracción durante aproximadamente una semana.</li>
	<li>Añadir solución de lisis tisular (ver Tabla de Materiales) en un tubo de 100 μL y mezclar bien, seguido de spin-down con una minicentrífuga de mesa (2.200 x g durante 10 s a temperatura ambiente). Asegúrese de que las muestras de cola estén sumergidas en la solución.</li>
	<li>Coloque los tubos en un termociclador establecido por el siguiente programa; 75 °C durante 10 min (lisis tisular), 95 °C durante 5 min (inactivación) y 4 °C (retención). Guarde el lisado tisular a 4 °C durante un máximo de una semana si las PCR no se pueden realizar inmediatamente.</li>
</ol>4. Amplificación del ADN por PCR
<ol><li>Preparar una solución de PCR que contenga 5 μL de H2O libre de nucleasa, 0,75 μL de imprimaciones de 10 μM hacia adelante y hacia atrás, y 7,5 μL de mezcla maestra de PCR (ver Tabla de Materiales) por muestra en un nuevo tubo de PCR (ver Tabla 1 para secuencias de imprimación). Si hay varias muestras, escalar el contenido a alícuota de 14 μL por tubo.</li>
	<li>Añadir 1 μL de lisado tisular a la solución de PCR preparada en el paso 3.1. Tenga cuidado de no tocar la cola.</li>
	<li>Mezclar bien y girar hacia abajo con una minicentrífuga de mesa (2.200 x g durante 10 s a temperatura ambiente).</li>
	<li>Coloque los tubos en un termociclador establecido por el programa mencionado a continuación. Guarde los productos de PCR a 4 °C durante 1-2 meses o ~1 año a -20 °C. NOTA: 95 °C durante 3 min (paso 1, desnaturalización inicial), 95 °C durante 15 s (paso 2, Desnaturalización), 60 °C durante 15 s (paso 2, Recocido), 72 °C durante 45 s (paso 2, Extensión), repita el paso 2 durante 35 ciclos, 72 °C durante 10 min (paso 3, Extensión final) y 4 °C (paso 4, Retención).</li>
</ol>5. Incubación con enzima de restricción
<ol><li>Preparar la solución enzimática que contiene 7 μL de H2O libre de nucleasa, 2 μL de tampón CutSmart 10x y 1 μL de enzima de restricción NlaIII (ver Tabla de Materiales). Si hay varias muestras, multiplique cada contenido para hacer la mezcla y alícuota 10 μL por tubo.</li>
	<li>Añadir 10 μL de producto de PCR obtenido en el paso 3 a la solución enzimática por tubo.</li>
	<li>Mezclar bien y girar hacia abajo con una minicentrífuga de mesa (2.200 x g durante 10 s a temperatura ambiente).</li>
	<li>Coloque los tubos en un termociclador o bloque de calor establecido por el programa mencionado a continuación. Almacene el producto después de la incubación a 4 °C durante 1-2 meses o ~1 año a -20 °C. NOTA: 37 °C durante 16 h (al menos 2 h; el corto tiempo de incubación puede resultar en una escisión insuficiente) y 4 °C para la explotación.</li>
</ol>6. Detección de banda de ADN
<ol><li>Prepare un gel de agarosa al 1,5% que contenga tinción de gel de ADN para la electroforesis.<ol>
<li>Agregue 0.75 g de agarosa en 50 ml de tampón 1x TAE seguido de mezcla y calor en microondas hasta que la agarosa se disuelva por completo. Después de enfriar, agregue 5 μL de tinción de ADN y mezcle suavemente.</li>
		<li>Vierta en el molde de gel (25 ml por molde) y permita que el gel se solidifique. Para obtener una mejor resolución y separación, aumente la concentración de agarosa a 2.5% -4% según sea necesario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cargue 10 μL de producto de PCR digerido en el pozo. Mezcle 6x búfer de carga, si es necesario.</li>
	<li>Pasar el gel con 100 V durante 35 min. NOTA: Estos parámetros pueden necesitar optimización.</li>
	<li>Imagen bajo luz UV (longitud de onda de 302 nm).</li>
</ol>

<ol><li>Smyth, J. W., Shaw, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+of+connexin43+gap+junction+formation+by+internally+translated+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms.</a> Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).</li>
<li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GJA1-20k+arranges+actin+to+guide+Cx43+delivery+to+cardiac+intercalated+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs.</a> Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cx43+isoform+GJA1-20k+promotes+microtubule+dependent+mitochondrial+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cx43 isoform GJA1-20k promotes microtubule dependent mitochondrial transport.</a> Frontiers in Physiology. 8, 905(2017).</li>
<li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxiliary+trafficking+subunit+GJA1-20k+protects+connexin-43+from+degradation+and+limits+ventricular+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Auxiliary trafficking subunit GJA1-20k protects connexin-43 from degradation and limits ventricular arrhythmias.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (9), 4858-4870 (2020).</li>
<li>Syvanen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gels+to+chips%3A+%26%2334%3Bminisequencing%26%2334%3B+primer+extension+for+analysis+of+point+mutations+and+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">From gels to chips: &#34;minisequencing&#34; primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms.</a> Human Mutation. 13 (1), 1-10 (1999).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+SNP+discovery+in+tetraploid+alfalfa+using+454+sequencing+and+high+resolution+melting+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide SNP discovery in tetraploid alfalfa using 454 sequencing and high resolution melting analysis.</a> BMC Genomics. 12, 1-11 (2011).</li>
<li>Han, Y., Khu, D. M., Monteros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+melting+analysis+for+SNP+genotyping+and+mapping+in+tetraploid+alfalfa+%28Medicago+sativa+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">High-resolution melting analysis for SNP genotyping and mapping in tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.).</a> Molecular Breeding. 29 (2), 489-501 (2012).</li>
<li>Peng, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+quick+PCR-based+method+to+genotype+mice+with+a+leptin+receptor+mutation+%28db%2Fdb+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice).</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (1), 117-123 (2018).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148(2016).</li>
<li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPOR%3A+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR%2FCas9+genome+editing+experiments+and+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 242-245 (2018).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Paquet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+introduction+of+specific+homozygous+and+heterozygous+mutations+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9.</a> Nature. 533 (7601), 125-129 (2016).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , (2014).</li>
<li>Pomp, D., Critser, E. S., Rutledge, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+sodium+lactate+in+Whitten%27s+medium+improves+in+vitro+developmental+capacity+of+one-cell+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Lower sodium lactate in Whitten's medium improves in vitro developmental capacity of one-cell mouse embryos.</a> Theriogenology. 29 (5), 1019-1025 (1988).</li>
<li>Summers, M. C., McGinnis, L. K., Lawitts, J. A., Raffin, M., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IVF+of+mouse+ova+in+a+simplex+optimized+medium+supplemented+with+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids.</a> Human Reproduction. 15 (8), 1791-1801 (2000).</li>
<li>Green, M. R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MRS+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual+%28Fourth+Edition%29%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition)</a>. , (2012).</li>
<li>Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+genotyping+of+animals+followed+by+establishing+primary+cultures+of+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments.+95%22%5BJournal%5D)">Rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. 95. (95), e51879(2015).</li>
<li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+unexpected+CRISPR-Cas9+off-target+activity+revealed+by+trio+sequencing+of+gene-edited+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">No unexpected CRISPR-Cas9 off-target activity revealed by trio sequencing of gene-edited mice.</a> PLoS Genetics. 14 (7), 1007503(2018).</li>
<li>Nature Medicine. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keep+off-target+effects+in+focus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Keep off-target effects in focus.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1081(2018).</li>
<li>Mayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+EcoRI-activity+of+EcoRI+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Optimization of the EcoRI-activity of EcoRI endonuclease.</a> FEBS Letters. 90 (2), 341-344 (1978).</li>
<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point+mutations+close+to+the+AUG+initiator+codon+affect+the+efficiency+of+translation+of+rat+preproinsulin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo.</a> Nature. 308 (5956), 241-246 (1984).</li>
<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point+mutations+define+a+sequence+flanking+the+AUG+initiator+codon+that+modulates+translation+by+eukaryotic+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes.</a> Cell. 44 (2), 283-292 (1986).</li>
<li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+response+protein+GJA1-20k+promotes+mitochondrial+biogenesis%2C+metabolic+quiescence%2C+and+cardioprotection+against+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Stress response protein GJA1-20k promotes mitochondrial biogenesis, metabolic quiescence, and cardioprotection against ischemia/reperfusion injury.</a> JCI Insight. 3 (20), 121900(2018).</li>
<li>Shimura, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+mitochondrial+fission+induced+by+stress-responsive+protein+GJA1-20k%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k.</a> Elife. 10, 69207(2021).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Un modelo de ratón modificado genéticamente es un enfoque común para comprender la función del gen. Sin embargo, dado que la isoforma traducida internamente GJA1-20k se traduce del mismo ARNm Gja1 que cx43 de longitud completa, se ideó una estrategia creativa para retener la expresión de Cx43 de longitud completa y suprimir la expresión de GJA1-20k. El enfoque se basa en una mutación del codón de inicio interno de GJA1-20k. Con una mutación de un solo punto, M213 se cambió a L en el ARNm de Gja1 , que l...

La conexina 43 (Cx43) de longitud completa y la isoforma truncada N-terminal, GJA1-20k, codificadas por el mismo ARNm GJA1, pero utilizan diferentes codones de inicio1 para iniciar la traducción. La traducción de Cx43 se produce en el primer codón de inicio de AUG, mientras que la traducción de GJA1-20k se inicia en el AUG en el residuo 213. Anteriormente se encontró que GJA1-20k tiene funciones esenciales para el tráfico de Cx43 de longitud completa, la estabilización de la actina y la regulación de la morfología mitocondrial in vitro 1,2,3.
Para comprender el papel de GJA1-20k in vivo, se generó un modelo de ratón GJA1-20k "knock-out" que conservó la capacidad de crear Cx43 de longitud completa. El enfoque consistió en utilizar el sistema CRISPR-Cas9 para sustituir el único residuo en 213 de una metionina (M) a una leucina (L) (Gja1M213L/M213L)4. Una mutación interna de M a L disminuye drásticamente la probabilidad de que ocurra la traducción interna, pero conserva la traducción y la función de la proteína4 de longitud completa. Debido a que el tipo salvaje (WT) y el alelo mutado tienen tamaños idénticos y productos de ARNm casi idénticos, existe una dificultad considerable para confirmar el genotipo en los ratones. La secuenciación del ADN puede identificar la mutación, pero es demasiado costosa y requiere demasiado tiempo para el uso rutinario. En general, se han establecido varios métodos de genotipado más rápido, como la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR), la minisecuenciación-ligadura, el análisis de fusión de alta resolución y el sistema de mutación refractaria de amplificación tetra-primer PCR (ARMS-PCR)5,6,7,8. Sin embargo, estos métodos alternativos requieren múltiples pasos, recursos únicos y / o varios conjuntos de cebadores específicos que pueden inducir productos de PCR no específicos.
Este protocolo introduce un enfoque detallado de selección y edición de genes por parte de CRISPR-Cas9 para crear una sola mutación de aminoácidos, y se presenta un genotipado rápido para confirmar la mutación. La identificación del genotipo implica el uso creativo de enzimas de restricción que utilizan solo un conjunto único de cebadores para identificar el gen objetivo. Se remite a los lectores a la Referencia4 para observar el profundo efecto electrofisiológico de la muerte súbita cardíaca causada por una mutación de sustituciónGja1 M213L / M213L de un residuo que aún genera una proteína de longitud completa pero no genera una isoforma de truncamiento traducida internamente más pequeña. Este protocolo ayudará a que otros modelos de ratones utilicen una mutación puntual para disminuir la traducción interna de una isoforma de interés mientras conservan la expresión de la proteína endógena de longitud completa.

<table><tbody><tr><td>0,2 mL Tubo de PCR de 8 tiras</td><td>Thomas Scientific</td><td>1148A28</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>Para micrortón pronuclear</td></tr><tr><td>de inyección 10x Tampón CutSmart</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td>Tampón de digestión para NlaIII</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7.5</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td>Para tampón pronuclear micorinjection</td></tr><tr><td>50x TAE Tampón</td><td>Invitrogen</td><td>24710-030</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador de 96 pocillos</td><td>Applied Biosystems</td><td>Modelo # 9902</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>664</td><td>cepa de ratón</td></tr><tr><td>Sistema de imagen Chemidoc MP</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>Para tomar imágenes de gel con luz ultravioleta de 302 nm</td></tr><tr><td>Proteína</td> <td>eSpCas9MilliporeSigma</td><td>ESPCAS9PRO-50UG</td><td></td></tr><tr><td>Gel Lading Dye Púrpura (6x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td>Tampón de carga para electroforesis</td></tr><tr><td>Guantes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hCG (gonadotropina coriónica humana)</td><td>MilliporeSigma</td><td>23-073-425G</td> Hialuronidasa <td></td></tr><tr><td></td><td>MilliporeSigma</td><td>H3884-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Software Image Lab</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>Para analizar la imagen de gel</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico invertido con plasDIC</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert A1</td><td></td></tr><tr><td>KAPA Kits de genotipado de ratones</td><td>Roche Diagnostics</td><td>KK7352</td><td>Para lisis de tejidos o células, extracción de ADN y mezcla maestra de PCR</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>LifeGlobal</td><td>ZEKS-050</td><td>medio de cultivo de embriones</td></tr><tr><td>Lab coart</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M2 medium</td><td>MilliporeSigma</td><td>MR015D</td><td></td></tr><tr><td>NlaIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0125S</td><td>Para digerir el producto de PCR</td></tr><tr><td>Agua sin nucleasas</td><td></td><td>Ambion AM9937</td><td>Para diluir reactivos</td>Aceite de</tr><tr><td>parafina</td><td>Nacalai USA</td><td>2613785</td><td></td></tr><tr><td>Plugged 20 &mu; L punta de pipeta fina</td><td>FisherScientific</td><td>02-707-171</td><td>Para recoger blastocitos</td></tr><tr><td>PMSG (yegua preñada' s gonadotropina sérica)</td><td>ProSpec-Tany</td><td>HOR-272</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Invitrogen</td><td>AM9760G</td><td>Para tampón pronuclear micorinyección</td></tr><tr><td>SYBR seguro DNA Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Para detectar bandas en gel</td></tr><tr><td>tracrRNA</td><td>Dharmacon</td><td>U-002000-120</td><td>Guid RNA</td></tr></tbody></table>

eliminación de un sitio de inicio traslacional interno del arnm mientras se conserva la expresión de la proteína de longitud completa

Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein

El sistema de edición de genes CRISPR-Cas9, basado en mecanismos de reparación del genoma, permite la generación de modelos de ratón modificados genéticamente de forma más rápida y sencilla en relación con la recombinación homóloga tradicional. El sistema CRISPR-Cas9 es particularmente atractivo cuando se desea una mutación de un solo punto. La proteína de unión de brecha, Connexin 43 (Cx43), está codificada por el gen Gja1, que tiene un solo exón codificante y no se puede empalmar. Sin embargo, Gja1 produce no solo la proteína Cx43 de longitud completa, sino hasta seis isoformas truncadas N-terminales mediante un proceso conocido como traducción interna, el resultado de la iniciación de la traducción ribosómica en los sitios de inicio internos de AUG (metionina). GJA1-20k es la isoforma truncada más comúnmente generada de Cx43 iniciada en el codón AUG en la posición 213 del ARNm Gja1. Debido a que el residuo 213 ocurre al final del último dominio transmembrana de Cx43, GJA1-20k es efectivamente la cola C-terminal de 20 kDa de Cx43 como una proteína independiente. Investigadores anteriores identificaron, en células, que un papel crítico de GJA1-20k es facilitar el tráfico de hemicanales de unión de brecha Cx43 de longitud completa a la membrana plasmática. Para examinar este fenómeno in vivo, se generó un ratón mutante con una mutación puntual Gja1 que reemplaza el ATG (Metionina) en el residuo 213 por TTA (mutación Leucina, M213L). El resultado de M213L es que el ARNm de Gja1 y el Cx43 de longitud completa todavía se generan, pero la traducción de Gja1-20k se reduce significativamente. Este informe se centra en la elección del sitio de la enzima de restricción para desarrollar un modelo de ratón mutado en un aminoácido (Gja1 M213L / M213L). Este protocolo describe ratones modificados genéticamente por el sistema CRISPR-Cas9 y el genotipado rápido mediante la combinación de PCR y tratamientos con enzimas de restricción.

El sistema de edición de genes CRISPR/Cas9 produce una mutación ATG a TTA y una mutación silenciosa de TCC a TCG en 56.264.279 a 56.264.281 y en 56.264.291 a 56.264.293 en el cromosoma 10 del ratón, o en 869 a 871 y 881 a 883 en el ARNm de Gja1, respectivamente. Esas mutaciones dan como resultado una mutación de metionina 213 a leucina (M213L) en la proteína GJA1 y la mutación TTC a TTG interrumpe una secuencia PAM cercana para evitar la edición no deseada del gen (Figura 1). Los detalles de...

El presente protocolo describe una única mutación M213L en Gja1 que conserva la generación completa de Connexin43 pero evita la traducción de la isoforma GJA1-20k traducida internamente más pequeña.

Eliminación de un sitio de inicio traslacional interno del ARNm mientras se conserva la expresión de la proteína de longitud completa

The CRISPR-Cas9 gene-editing system, based on genome repair mechanisms, enables the generation of gene-modified mouse models more quickly and easily ...

La dificultad con una sola sustitución de residuos es genotipar animales de manera eficiente a pesar de la diferencia en un solo residuo. El uso especial de una enzima de restricción agrega solo un paso único, rápido y de bajo costo al genotipado típico basado en PCR. Este protocolo se puede aplicar a cualquier otro modelo de ratón con un punto de mutación si la secuencia objetivo es reconocida por una enzima de restricción, que suele ser el caso.Corte de uno a tres milímetros de la punta de la cola con tijeras limpias y transfiéralo a un tubo de PCR de ocho tiras de 0.2 mililitros. Después de contener la muestra de cola como se describe en el manuscrito, guárdela a T-menos 20 grados Celsius hasta la extracción, hasta aproximadamente una semana. Agregue 100 microlitros de solución de lisis tisular por tubo y mezcle bien, seguido de spin-down usando una minicentrífuga de mesa a 2, 200 veces G durante 10 segundos a temperatura ambiente.Asegúrese de que las muestras de cola estén sumergidas en la solución. Coloque los tubos en un conjunto de termocicladores programando los parámetros para la lisis del tejido, la inactivación y la sujeción. Guarde el lisado tisular a cuatro grados centígrados durante un máximo de una semana si la PCR no se puede realizar de inmediato.Prepare una solución de PCR que contenga cinco microlitros de agua libre de nucleasas, 0,75 microlitros de cebadores de 10 micromolares hacia adelante y hacia atrás, y 7,5 microlitros de mezcla maestra de PCR por muestra en un nuevo tubo de PCR. Añadir un microlitro del lisado tisular previamente preparado a la solución de PCR. Mezcle bien la solución de PCR y gire hacia abajo con una minicentrífuga de mesa a 2, 200 veces G durante 10 segundos a temperatura ambiente.Coloque los tubos en un termociclador programado. Una vez que se complete la reacción, almacene los productos de PCR a cuatro grados Celsius durante uno o dos meses o aproximadamente un año a menos 20 grados Celsius. Prepare la solución enzimática que contiene siete microlitros de agua libre de nucleasas, dos microlitros de tampón CutSmart a una fuerza de 10X y un microlitro de enzima de restricción NlaIII.Si hay varias muestras, multiplica cada contenido para hacer la mezcla y alícuota 10 microlitros por tubo. Añadir 10 microlitros de producto pcr previamente obtenido a la solución enzimática por tubo. Mezcle bien y gire hacia abajo con la minicentrífuga de mesa como se demostró anteriormente.Coloque los tubos en un termociclador o bloque de calor programado. Almacene el producto después de la incubación en condiciones frías. Agregue 0.75 gramos de agarosa en 50 mililitros de tampón TAE de una sola fuerza.Mezclar y calentar la agarosa en el microondas hasta que se disuelva por completo. Después de enfriarlo, agregue cinco microlitros de tinción de ADN y mezcle suavemente. Vierta 25 mililitros del gel de agarosa en el molde de gel y permita que el gel se solidifique.Cargue 10 microlitros de producto pcrendido digerido al pozo. Haga funcionar el gel con 100 voltios durante 35 minutos. Imagen del gel de agarosa bajo luz ultravioleta.La electroforesis de agarosa realizada utilizando el producto de PCR digerido dio como resultado varias bandas de diferentes tamaños en cada genotipo, con dos bandas en tipo salvaje, tres en heterocigotos y una en homocigotos, respectivamente. La inyección de prueba con análisis de blastocistos dio como resultado una tasa de éxito del 76,9% en la inyección de 50 nanogramos por microlitro de los oligos donantes, y una tasa de éxito del 25% en la inyección de 25 nanogramos por microlitro de los mismos oligos donantes, respectivamente. Finalmente, inyectando 50 nanogramos por microlitro de los oligos donantes con precipitación de etanol se obtuvieron animales fundadores con una tasa de éxito del 50%.La purificación de oligo donantes por precipitación de etanol redujo la toxicidad al tiempo que mantuvo una alta eficiencia de edición del genoma. El manejo cuidadoso y la adición de una baja cantidad de reactivos es muy importante. Asegúrese de que se agreguen correctamente y se mezclen bien.

removal-an-internal-translational-start-site-from-mrna-while

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un obstáculo importante para los análisis bioquímicos de los ribosomas que contienen naciente peptidil-ARNt ha sido la presencia de los ribosomas otros en las mismas muestras, los ribosomas no participan en la traducción de la secuencia del ARNm específico que se analiza. Hemos desarrollado una metodología sencilla para purificar, exclusivamente, los ribosomas que contiene la naciente peptidil-tRNA de interés.

El aislamiento de los ribosomas traducir contienen peptidil-ARNt para el Análisis Funcional y Estructural

Una técnica para identificar sitios traduccionales pausa en ARNm se describe. Este procedimiento se basa en el aislamiento de polipéptidos nacientes acumulan en los ribosomas durante la traducción in vitro de un ARNm diana, seguido por el análisis del tamaño de las cadenas nacientes utilizando una electroforesis en gel de desnaturalización.

El aislamiento de los ribosomas polipéptidos nacientes Bound<em&gt; In vitro</em&gt; Para la identificación de sitios de traslación pausa a lo largo del ARNm

Se describe aquí una técnica que ahora se utilizan habitualmente para aislar de forma estable consolidados complejos ribosoma cadena naciente (RNC). Esta técnica aprovecha el descubrimiento de que un joven de 17 aminoácidos de longitud SecM "secuencia de la detención" puede detener la elongación de la traducción en un procariota...

Usar secuencias de detención SecM como una herramienta para aislar Ribosome polipéptidos enlazados

Aquí se describe un método para visualizar retículo endoplasmático asociados mRNAs en células de cultivo de tejidos de mamíferos. Esta técnica implica la permeabilización selectiva de la membrana plasmática con digitonina para eliminar el contenido citoplásmico seguido por...

La visualización de los ARNm retículo endoplásmico localizados en células de mamíferos

Muchos ARNm que codifican proteínas mitocondriales se asocian con la membrana externa mitocondrias. Se describe un procedimiento de fraccionamiento subcelular destinada a aislamiento de las mitocondrias de levadura con sus ARNm y ribosomas asociados. Este protocolo se puede aplicar a las células cultivadas bajo diversas condiciones con el fin de revelar los mecanismos de la localización del mRNA y la traducción localizada cerca de las mitocondrias.

Aislamiento de ARNm asociados a la mitocondria de levadura para estudiar los mecanismos de traducción localizada

Este manuscrito describe un método para visualizar y cuantificar eventos traducción localizada en compartimientos subcelulares. El enfoque propuesto en este manuscrito requiere un sistema de proyección de imagen confocal básico y reactivos y es rápida y rentable.

La inmunofluorescencia cuantitativa a medida Global localizada traducción

Toeprinting tiene como objetivo medir la capacidad de in vitro transcrito RNA para formar complejos de iniciación de traducción con los ribosomas en una variedad de condiciones. Este protocolo describe un método para RNA mamíferos toeprinting y puede utilizarse para estudiar traducción dependiente de la tapa y IRES-conducido.

Toeprinting análisis de formación de complejos de iniciación traducción de mRNAs mamíferos

La entrega directa de complejos de ribonucleoproteínacas Cas9/ARN guía premontados es un medio rápido y eficiente para la edición del genoma en células hematopoyéticas. Aquí, utilizamos este enfoque para eliminar un silenciador intrónico RUNX1 y examinar las respuestas transcripcionales en las células leucémicas OCI-AML3.

Investigación del papel transcripcional de un silenciador intrónico RUNX1 por RIBonucleoprotein CRISPR/Cas9 en células de leucemia mieloide aguda

Este procedimiento se describe cómo establecer cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina y es seguida por la transfección utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXCell.

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

Mutagénesis dirigida de los plásmidos es toda una forma sencilla de crear variaciones ligeramente diferentes de un plásmido original. Aquí se demuestra de una manera fácil y rentable para introducir sustituciones de bases en un plásmido usando reactivos estándar.

Mutagénesis dirigida casera de plásmidos enteros

Aprende a genotipar mutaciones puntuales en modelos murinos mediante PCR y enzimas de restricción para identificar el alelo Gja1 M213L. Este protocolo eficiente permite distinguir genotipos por patrones de bandas en gel de agarosa.

Eliminación de un sitio de inicio traslacional interno del ARNm mientras se conserva la expresión de la proteína de longitud completa (Video) | JoVE Journal

Eliminación de un sitio de inicio traslacional interno del ARNm mientras se conserva la expresión de la proteína de longitud completa

Explorar más videos