Eliminación de un sitio de inicio traslacional interno del ARNm mientras se conserva la expresión de la proteína de longitud completa
16 de marzo de 2022
El presente protocolo describe una única mutación M213L en Gja1 que conserva la generación completa de Connexin43 pero evita la traducción de la isoforma GJA1-20k traducida internamente más pequeña.
La dificultad con una sola sustitución de residuos es genotipar animales de manera eficiente a pesar de la diferencia en un solo residuo. El uso especial de una enzima de restricción agrega solo un paso único, rápido y de bajo costo al genotipado típico basado en PCR. Este protocolo se puede aplicar a cualquier otro modelo de ratón con un punto de mutación si la secuencia objetivo es reconocida por una enzima de restricción, que suele ser el caso.
Corte de uno a tres milímetros de la punta de la cola con tijeras limpias y transfiéralo a un tubo de PCR de ocho tiras de 0.2 mililitros. Después de contener la muestra de cola como se describe en el manuscrito, guárdela a T-menos 20 grados Celsius hasta la extracción, hasta aproximadamente una semana. Agregue 100 microlitros de solución de lisis tisular por tubo y mezcle bien, seguido de spin-down usando una minicentrífuga de mesa a 2, 200 veces G durante 10 segundos a temperatura ambiente.
Asegúrese de que las muestras de cola estén sumergidas en la solución. Coloque los tubos en un conjunto de termocicladores programando los parámetros para la lisis del tejido, la inactivación y la sujeción. Guarde el lisado tisular a cuatro grados centígrados durante un máximo de una semana si la PCR no se puede realizar de inmediato.
Prepare una solución de PCR que contenga cinco microlitros de agua libre de nucleasas, 0,75 microlitros de cebadores de 10 micromolares hacia adelante y hacia atrás, y 7,5 microlitros de mezcla maestra de PCR por muestra en un nuevo tubo de PCR. Añadir un microlitro del lisado tisular previamente preparado a la solución de PCR. Mezcle bien la solución de PCR y gire hacia abajo con una minicentrífuga de mesa a 2, 200 veces G durante 10 segundos a temperatura ambiente.
Coloque los tubos en un termociclador programado. Una vez que se complete la reacción, almacene los productos de PCR a cuatro grados Celsius durante uno o dos meses o aproximadamente un año a menos 20 grados Celsius. Prepare la solución enzimática que contiene siete microlitros de agua libre de nucleasas, dos microlitros de tampón CutSmart a una fuerza de 10X y un microlitro de enzima de restricción NlaIII.
Si hay varias muestras, multiplica cada contenido para hacer la mezcla y alícuota 10 microlitros por tubo. Añadir 10 microlitros de producto pcr previamente obtenido a la solución enzimática por tubo. Mezcle bien y gire hacia abajo con la minicentrífuga de mesa como se demostró anteriormente.
Coloque los tubos en un termociclador o bloque de calor programado. Almacene el producto después de la incubación en condiciones frías. Agregue 0.75 gramos de agarosa en 50 mililitros de tampón TAE de una sola fuerza.
Mezclar y calentar la agarosa en el microondas hasta que se disuelva por completo. Después de enfriarlo, agregue cinco microlitros de tinción de ADN y mezcle suavemente. Vierta 25 mililitros del gel de agarosa en el molde de gel y permita que el gel se solidifique.
Cargue 10 microlitros de producto pcrendido digerido al pozo. Haga funcionar el gel con 100 voltios durante 35 minutos. Imagen del gel de agarosa bajo luz ultravioleta.
La electroforesis de agarosa realizada utilizando el producto de PCR digerido dio como resultado varias bandas de diferentes tamaños en cada genotipo, con dos bandas en tipo salvaje, tres en heterocigotos y una en homocigotos, respectivamente. La inyección de prueba con análisis de blastocistos dio como resultado una tasa de éxito del 76,9% en la inyección de 50 nanogramos por microlitro de los oligos donantes, y una tasa de éxito del 25% en la inyección de 25 nanogramos por microlitro de los mismos oligos donantes, respectivamente. Finalmente, inyectando 50 nanogramos por microlitro de los oligos donantes con precipitación de etanol se obtuvieron animales fundadores con una tasa de éxito del 50%.
La purificación de oligo donantes por precipitación de etanol redujo la toxicidad al tiempo que mantuvo una alta eficiencia de edición del genoma. El manejo cuidadoso y la adición de una baja cantidad de reactivos es muy importante. Asegúrese de que se agreguen correctamente y se mezclen bien.
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Descripción general
Este protocolo describe un método para la genotipificación de animales con una única mutación M213L en el gen Gja1 que conduce a la producción de Connexina43 de longitud completa, al tiempo que impide la traducción del isoformo más pequeño GJA1-20k. El método destaca la eficiencia y rentabilidad del uso de enzimas de restricción en la genotipificación basada en PCR.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Genética
- Biología Molecular
- Modelos Animales
Antecedentes
- Importancia de identificar mutaciones genéticas
- Dificultades de las sustituciones de un solo residuo
- Aplicación de enzimas de restricción en genotipificación
Métodos Utilizados
- Genotipificación basada en PCR
- Modelos de ratón con mutaciones puntuales
- Electroforesis en gel de agarosa para análisis de ADN
Resultados Principales
- Identificación exitosa de genotipos con patrones de bandas distintos
- Altas tasas de éxito en la generación de animales fundadores
- Eficiencia validada de los métodos descritos para el análisis genético
Conclusiones
- El estudio demuestra un protocolo eficiente para la genotipificación de mutaciones en modelos de ratón.
- Contribuye con metodologías valiosas para la investigación genética en biología del desarrollo.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la genotipificación precisa de mutaciones puntuales en modelos de ratón, apoyando estudios de validación de dianas en los que debe analizarse la expresión proteica específica de isoformas. Al eliminar isoformas truncadas que podrían interferir, al tiempo que se conserva la función proteica completa, mejora la desvinculación mecanicista en las fases iniciales del descubrimiento. Este enfoque aumenta la confianza predictiva en hipótesis terapéuticas relacionadas con la biología de la Connexina 43 y las vías asociadas de uniones en hendidura.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante el aislamiento de la contribución funcional de la Cx43 de longitud completa frente a las isoformas truncadas en el extremo N.
- Valor operativo: Proporciona un método de genotipado escalable para distinguir alelos silvestres, heterocigotos y mutantes homocigotos en grandes cohortes.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al aclarar si los fenotipos observados se deben a la pérdida de la proteína de longitud completa o a mecanismos específicos de isoformas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Genera muestras de ADN con patrones de fragmentos de restricción adecuados para flujos de trabajo de cribado de alto rendimiento.
- Salida cuantitativa: Permite la cuantificación alelo-específica mediante análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción por PCR.
- Reproducibilidad: Estandariza la genotipificación entre laboratorios mediante la adición de una enzima de bajo costo a protocolos de PCR existentes.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Facilita modelos preclínicos en los que el tráfico de Cx43 y el ensamblaje de uniones comunicantes están implicados en trastornos cardíacos, neurológicos u oncológicos.
- Continuidad traslacional: Relaciona el genotipo molecular con el resultado fenotípico al preservar la expresión de Cx43 de longitud completa mientras se reduce GJA1-20k.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Proporciona información para criterios de avance o detención al permitir la correlación entre los niveles de expresión de isoformas y las respuestas funcionales in vivo.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento, desde la validación temprana del blanco hasta las pruebas de eficacia preclínica, especialmente cuando es necesario resolver funciones proteicas específicas de isoformas.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis mediante modelos genéticos que permiten diferenciar entre la función de proteínas completas y la actividad de isoformas truncadas.
- Genotipificación: Proporciona ADN genómico listo para ensayos que se puede utilizar en aplicaciones posteriores, como la validación de CRISPR o la gestión de colonias de cría.
- Análisis: Ofrece patrones de bandas claros y fácilmente interpretables en geles de agarosa, lo que permite asignar genotipos rápidamente sin necesidad de secuenciación.
- Investigación Traslacional: Permite estudios preclínicos en los que la localización de Cx43 en la membrana y la comunicación intercelular son parámetros mecanicistas clave.
- Reutilización Empresarial: Adaptable a cualquier mutación puntual en la que pueda introducirse o eliminarse un sitio de restricción, lo que ofrece una plataforma de genotipificación reutilizable.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos al aislar las contribuciones específicas de cada isoforma.
- Valor operativo: Aumenta el rendimiento y reduce el costo por muestra mediante un único paso de digestión con enzimas de restricción posterior a la PCR.
- Valor estratégico: Mejora la confianza en las decisiones durante la optimización de compuestos iniciales al aclarar las relaciones genotipo-fenotipo.
- Impacto en la cartera: Permite el avance ajustado al riesgo de candidatos que dirigen vías dependientes de Cx43.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en biología molecular en el diseño de cebadores para PCR y selección de enzimas de restricción.
- Depende del acceso a termocicladores, sistemas de electroforesis en gel de agarosa y equipos de imagen UV.
- Necesita la estandarización de las condiciones de lisis de tejidos y de la PCR entre diferentes usuarios para obtener resultados consistentes.
- La adaptación a sistemas modelo alternativos depende del contexto de la secuencia y de la compatibilidad con las enzimas de restricción.
- Se limita a mutaciones que alteran o crean un sitio de reconocimiento para enzimas de restricción; las mutaciones silenciosas pueden requerir estrategias alternativas.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
DNA Extraction
1:45
DNA Amplification by PCR
2:42
Incubation with Restriction Enzyme
3:34
Preparation of 1.5% Agarose Gel for Electrophoresis and DNA Band Detection
4:22
Results: Genotype Analysis and Recombination Efficiency
5:21
Conclusion
