Name: In vivo Imágenes de tejidos biológicos con fluorescencia combinada de dos fotones y microscopía de dispersión Raman estimulada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprende a realizar imágenes in vivo de la médula espinal en ratones mediante microscopía dual de fluorescencia de dos fotones y dispersión Raman estimulada. Esta técnica permite estudiar dinámicas celulares y enfermedades neurodegenerativas.

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Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Becas de Investigación de Hong Kong a través de subvenciones 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, la Comisión de Innovación y Tecnología (ITCPD/17-9), el Esquema de Área de Excelencia del Comité de Becas Universitarias (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) y la Universidad de Ciencia y Tecnología de Hong Kong (HKUST) a través de la subvención RPC10EG33.

Los autores no tienen nada que revelar y no tienen intereses financieros en competencia.

En este protocolo, se describe en detalle la configuración básica del microscopio TPEF-SRS. Para las imágenes SRS, la bomba y los haces stokes se superponen temporal y espacialmente dentro del OPO. Sin embargo, esta superposición puede interrumpirse después de pasar a través del sistema de microscopio. Por lo tanto, la optimización espacial y temporal de la colocalización de la bomba y los haces de Stokes es necesaria y crítica para lograr una imagen SRS óptima. El retardo temporal entre la bomba y el haz de Stokes está ...

La microscopía Raman1,2 está emergiendo como un poderoso método libre de etiquetas para obtener imágenes de tejidos biológicos basado en las frecuencias características de varios enlaces químicos en biomoléculas. Debido a su capacidad de imagen no invasiva y bien adaptativa, la microscopía Raman se ha utilizado ampliamente para obtener imágenes de componentes enriquecidos con lípidos en tejidos biológicos como la vaina de mielina3,4,5, los adipocitos6,7 y las gotas lipídicas8,9,10 . La señal de dispersión Raman estimulada (SRS) adquirida como ganancia Raman estimulada (SRG) o pérdida Raman estimulada (SRL) no tiene fondo, mostrando un parecido espectral perfecto con la dispersión Raman espontánea11,12. Además, SRL y SRG dependen linealmente de la concentración de analitos, lo que permite el análisis cuantitativo de los componentes bioquímicos9,11,13. La microscopía de fluorescencia excitada de dos fotones (TPEF) se ha utilizado ampliamente para imágenes biológicas in vivo debido a su capacidad de seccionamiento óptico inherente, profundidad de penetración profunda y baja fototoxicidad14,15,16. Sin embargo, el rendimiento de las imágenes TPEF depende de las características de las etiquetas fluorescentes, y el número de colores resolubles es limitado debido a los espectros de fluorescencia de banda ancha8,17,18,19. Las imágenes SRS sin etiqueta y las imágenes TPEF basadas en fluorescencia son dos modalidades de imágenes complementarias, y su combinación puede proporcionar abundante información biofísica y bioquímica de los tejidos. Estas dos modalidades de imagen se basan en los procesos ópticos no lineales (NLO), lo que permite una integración simple en un sistema de microscopio. La combinación de las imágenes SRS y TPEF, las llamadas imágenes de doble modal, permite la obtención de imágenes de alta dimensión y el perfil de células y tejidos, lo que facilita una comprensión integral de los sistemas biológicos complejos. Específicamente, la microscopía SRS de picosegundos (ps) puede lograr imágenes de enlace químico con alta resolución espectral en comparación con la técnica SRS de femtosegundo (fs)11, lo que permite diferenciar múltiples componentes bioquímicos en el tejido biológico, especialmente en la región de huellas dactilares abarrotada20,21. Además, en comparación con otro sistema de microscopio NLO de doble modal de uso común con integración de microscopio de dispersión anti-Stokes coherente (CARS), SRS muestra un rendimiento superior al CARS en términos de interpretación espectral y de imagen, así como sensibilidad de detección11. El microscopio SRS-TPEF se ha utilizado como una poderosa herramienta para estudiar diversos sistemas biológicos, como Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis tadpole brain5, cerebro de ratón23,24, médula espinal25,26, nervio periférico27, tejido adiposo7, etc.
La médula espinal junto con el cerebro constituye el sistema nervioso central (SNC). La visualización de las actividades celulares en el SNC in vivo en condiciones fisiológicas y patológicas es fundamental para comprender los mecanismos de los trastornos del SNC28,29,30 y para desarrollar las terapias correspondientes31,32,33. La vaina de mielina, que envuelve y aísla los axones para la conducción potencial de acción a alta velocidad, desempeña un papel importante en el desarrollo del SNC. La desmielinización se considera un sello distintivo en los trastornos de la sustancia blanca, como la esclerosis múltiple34. Además, después de una lesión medular35, los restos de mielina pueden modular la activación de los macrófagos, contribuyendo a la inflamación crónica y a la lesión secundaria36. Por lo tanto, las imágenes in vivo de la vaina de mielina junto con las neuronas y las células gliales en modelos de ratones vivos son de gran ayuda para comprender los procesos dinámicos en los trastornos del SNC.
En este protocolo, se describen los procedimientos fundamentales de configuración de un microscopio TPEF-SRS construido en casa y se introducen los métodos de imagen in vivo de doble modal para la médula espinal de ratón.

<table><tbody><tr><td>#2 Pinzas</td><td>Dumont</td><td>11223-20</td><td>Para laminectomía</td></tr><tr><td>10X objetivo</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo Lambda 10X</td><td></td></tr><tr><td>25X objetivo</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XSVMP2</td><td></td></tr><tr><td>Burn cream</td><td>Betadine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara</td><td></td> <td>Sony&alpha; 6300</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de corriente</td><td>Stanford research</td><td>SR570</td><td></td></tr><tr><td>Módulos fotomultiplicadores de corriente</td><td>Hamamatsu</td><td>H11461-01</td><td></td></tr><tr><td>D2 Espejo dicroico de paso largo de 665 nm</td><td>Semrock</td><td>FF665-Di02-25x36</td><td>Para dirigir la señal de epifluorescencia al módulo de detección</td></tr><tr><td>D3 Espejo dicroico de paso corto de 700 nm</td><td>Edmund</td><td>69-206</td><td>Para separar el SRS de Ruta de detección de TPEF</td></tr><tr><td>Crema depilatoria</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FS1 975 nm filtro de paso corto</td><td>Edmund</td><td>86-108</td><td>Para el bloqueo de haces de carreras</td></tr><tr><td>FS1 Filtro de paso de banda</td><td>Semrock</td><td>FF01-850/310</td><td>Para el bloqueo de haces de carreras</td></tr><tr><td>Fs2 Filtro de paso de banda</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/50</td><td>Para seleccionar la señal YFP</td></tr><tr><td>Fs2 Filtro de paso corto</td><td>Semrock</td><td>FF01-715/SP-25</td><td>Para el bloqueo del rayo láser de excitación fs</td></tr><tr><td>Placa de media onda</td><td>Thorlabs</td><td>SAHWP05M-1700</td><td></td></tr><tr><td>Fotodetector de alta velocidad</td><td>MenloSystems</td><td>FPD 310-F</td><td>Para comprobar la modulación del haz de Stokes</td></tr><tr><td>Yodo</td><td>Betadine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IR Visor</td><td>FJW</td><td>FIND-R-SCOPE Visor de infrarrojos 2X Kit modelo 84499C2X</td><td></td></tr><tr><td>Iris</td><td>Thorlabs</td><td>CPA1</td><td></td></tr><tr><td>L1</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-060-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>L10</td><td>Thorlabs</td><td>LA4052-A</td><td></td></tr><tr><td>L2</td><td>Thorlabs</td><td>LA1422-B</td><td></td></tr><tr><td>L3</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-050-B</td><td></td></tr><tr><td>L4</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-060-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>L7</td><td></td><td></td><td>f=100 mm, recubrimiento AB</td></tr><tr><td>L8</td><td>Thorlabs</td><td>LA4874-A</td><td></td></tr><tr><td>L9</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-035-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de bloqueo</td><td>APE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mirror</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td></td></tr><tr><td>Aleta motorizada</td><td>Thorlabs</td><td>MFF101/M</td><td></td></tr><tr>tarjeta<td>de adquisición multifuncional</td><td>National Instrument</td><td>PCIe-6363</td><td></td></tr><tr><td>Osciloscopio</td><td>Tektronix</td><td>TDS2012C</td><td></td></tr><tr><td>Fotodiodo</td><td>APE</td><td></td><td>Para la detección de señal SRS</td></tr><tr><td>Fuente láser de picosegundos</td><td>APE</td><td>picoEmerald</td><td></td></tr><tr><td>Divisor de haz polarizador</td><td>Thorlabs</td><td>CCM1-PBS252/M Medidor</td><td></td>de</tr><tr><td>potencia</td><td>Newport</td><td>843-R</td><td></td></tr><tr>Lente de escaneo<td>Braun Salina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L5</td><td>Thorlabs</td><td>SL50-CLS2</td><td></td></tr><tr><td>Espejo de escaneo</td><td>Cambridge Technology</td><td>6215H</td><td></td></tr><tr><td>Gel de silicona</td><td>World Precision Inc.</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>Ti:zafiro fs láser</td><td></td><td>Camaleón Ultra II</td><td></td></tr><tr><td>Lente de tubo L6</td><td>Thorlabs</td><td>TTL200-S8</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo imágenes de tejidos biológicos con fluorescencia combinada de dos fotones y microscopía de dispersión raman estimulada

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) permite obtener imágenes sin etiquetas de los tejidos biológicos en su microambiente natural basado en la vibración molecular intrínseca, proporcionando así una herramienta perfecta para el estudio in vivo de los procesos biológicos a resolución subcelular. Al integrar imágenes de fluorescencia excitada de dos fotones (TPEF) en el microscopio SRS, las imágenes in vivo de doble modal de los tejidos pueden adquirir información bioquímica y biofísica crítica desde múltiples perspectivas, lo que ayuda a comprender los procesos dinámicos involucrados en el metabolismo celular, la respuesta inmune y la remodelación de tejidos, etc. En este protocolo de video, se introduce la configuración de un sistema de microscopio TPEF-SRS, así como el método de imágenes in vivo de la médula espinal animal. La médula espinal, como parte del sistema nervioso central, juega un papel crítico en la comunicación entre el cerebro y el sistema nervioso periférico. La vaina de mielina, abundante en fosfolípidos, rodea y aísla el axón para permitir la conducción saltatoria de los potenciales de acción. Las imágenes in vivo de las vainas de mielina en la médula espinal son importantes para estudiar la progresión de las enfermedades neurodegenerativas y la lesión de la médula espinal. El protocolo también describe la preparación animal y los métodos de imagen TPEF-SRS in vivo para adquirir imágenes biológicas de alta resolución.

La obtención de imágenes dual-modales in vivo de los axones espinales, así como de las vainas de mielina, se realiza utilizando los ratones transgénicos Thy1-YFPH, que expresan EYFP en las neuronas aferentes del ganglio de la raíz dorsal (Figura 3). Estas neuronas aferentes marcadas transmiten la información sensorial del nervio periférico a la médula espinal, con la rama central ubicada en la columna dorsal de la médula espinal. Con el microscopio TPEF-SRS, la vaina de mielina dens...

La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) permite obtener imágenes sin etiquetas de biomoléculas en función de su vibración intrínseca de enlaces químicos específicos. En este protocolo, se describe la configuración instrumental de un SRS integrado y un microscopio de fluorescencia de dos fotones para visualizar las estructuras celulares en la médula espinal de ratones vivos.

In vivo Imágenes de tejidos biológicos con fluorescencia combinada de dos fotones y microscopía de dispersión Raman estimulada

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Las imágenes in vivo de tejidos biológicos con resolución subcelular y especificidad química son una herramienta poderosa para comprender los procesos dinámicos involucrados en el metabolismo celular, la respuesta inmune y la remodelación de tejidos. Con la fluorescencia combinada de dos fotones y la microscopía de dispersión Raman estimulada, la información bioquímica y biofísica crítica de los tejidos biológicos se puede adquirir desde múltiples perspectivas con resolución subcelular. Específicamente, esta microscopía de doble modal se puede utilizar para obtener imágenes de la dinámica celular y las interacciones en la médula espinal del ratón para estudiar la progresión de las enfermedades neurodegenerativas y la lesión de la médula espinal.Para comenzar, encienda el láser de zafiro de titanio cambiando el interruptor de la tecla de la posición de espera a la de encendido y espere 30 minutos para que el láser se caliente. Luego encienda el OPO haciendo clic en el botón de inicio en el panel de control de OPO y espere 20 minutos para que el láser se caliente. Después de que el láser de picosegundos se caliente, verifique la profundidad de modulación del haz stokes reduciendo la potencia del haz Stokes a aproximadamente 20 milivatios, abriendo el obturador láser para el haz Stokes y colocando un fotodetector de alta velocidad en la salida OPO para detectar el haz.A continuación, conecte el puerto de salida del fotodetector al puerto de entrada de un osciloscopio utilizando un cable coaxial con un conector BNC para monitorear el pulso láser. Luego abra la ventana de control de EOM en el software de control OPO y ajuste la potencia y la fase de EOM de acuerdo con el diagrama de intensidad de pulso que se muestra en el osciloscopio para lograr la profundidad máxima de modulación a 20 megahercios. En el software de control OPO, abra el obturador láser de la bomba mientras detiene la salida de Stokes.A continuación, haga clic en el cuadro de configuración de señal para establecer la longitud de onda del haz de la bomba en 796 nanómetros, luego haga clic en el cuadro de potencia OPO establecido e ingrese 20 para establecer su potencia al mínimo para la alineación óptica. A continuación, coloque la placa de alineación P1 detrás del divisor de haz polarizador a unos 10 centímetros y coloque la placa P2 detrás de P1 a unos 30 centímetros en la trayectoria óptica. Después de abrir el obturador del microscopio para el rayo láser de picosegundos, ajuste el espejo M1 para ubicar el centro del rayo láser de picosegundos en el orificio pasante de P1. Utilice un visor infrarrojo para observar la posición del punto del haz en P1 al ajustar el espejo M1. Del mismo modo, ajuste el espejo M2 para ubicar el centro del rayo láser de picosegundos en el orificio pasante de P2. Utilice el visor infrarrojo para observar la posición del punto del haz en P2 al ajustar el espejo M2. Después de ajustar los espejos hasta que el centro del haz de picosegundos se localice en el orificio pasante de ambas placas de alineación, cierre el obturador del haz de picosegundos en el software de control del microscopio.A continuación, abra el obturador del microscopio para el rayo láser de femtosegundo. Ajuste el espejo M3 para ubicar el centro del punto de haz láser de femtosegundo en el orificio pasante de P1, luego ajuste el espejo M4 para ubicar el centro del punto de haz láser de femtosegundo en el orificio pasante de P2. Después de ajustar los espejos hasta que el centro del rayo láser de femtosegundos se localice en los orificios pasantes de las dos placas de alineación, cierre el obturador del microscopio para el haz de femtosegundos. A continuación, coloque una cámara en la posición del objetivo para visualizar la ubicación de los dos puntos de haz y marque la posición del haz de la bomba en la pantalla de la cámara como referencia.Luego coloque una placa de alineación P0 antes de la lente L3 y ajuste el espejo óptico usando una llave hexagonal para que el centro del haz stokes pase el orificio pasante de la placa de alineación en el puerto de salida láser. Utilice el visor infrarrojo para confirmar la posición del punto del haz en P0 durante el ajuste. A continuación, retire la placa de alineación P0 y use la tecla hexagonal para ajustar el espejo óptico dos para que el centro del haz stokes se colocalice con la marca de referencia del haz de la bomba en la cámara.Siga ajustando los espejos hasta que el haz de Stokes se superponga estrictamente con el haz de la bomba tanto en P0 como en los planos de la cámara. Abra el software de control del amplificador de bloqueo y ajuste la longitud de onda del láser de la bomba a 796 nanómetros y la potencia de la bomba y el haz stokes a 50 y 70 milivatios correspondientes a 15 y 25 milivatios en la muestra, respectivamente. Luego use aceite de oliva para la optimización de la fase del amplificador de bloqueo.El aceite de oliva se sella en un portaobjetos con papel de seda unido a la parte inferior para mejorar la dispersión de la señal o la detección EPI-SRS. Coloque la muestra de aceite de oliva en el escenario y ajuste el enfoque del objetivo 25X en la muestra. Usando el software de control del microscopio, establezca los parámetros de imagen como se menciona en el manuscrito de texto.Luego, utilizando el software de control del amplificador de bloqueo, establezca el valor de la constante de tiempo en 10 microsegundos. A continuación, escanee el rayo láser sobre la muestra, ajustando la fase con un tamaño de paso de 22,5 grados hasta que la intensidad de la señal SRS alcance el máximo. Luego escanee la muestra con el obturador láser cerrado, ajustando el valor de desplazamiento con un tamaño de paso de un milivoltio hasta que la señal SRS promedio esté cerca de cero.A continuación, abra el cuadro de diálogo del administrador de retrasos en el software de control OPO y escanee el aceite de oliva, ajustando la etapa de retraso hasta que la señal SRS del aceite de oliva alcance su máximo. Luego detenga el escaneo y haga clic en el botón Agregar datos en el cuadro de diálogo del administrador de retrasos para registrar los datos de retraso actuales. Después de adquirir datos de retardo de manera similar en diferentes turnos Raman mediante la obtención de imágenes de varias muestras químicas, seleccione el ajuste de datos en el orden cinco en el cuadro de diálogo del administrador de retardo para ajustar los puntos de datos actuales con la función polinómica de quinto orden.Luego aplique los datos ajustados haciendo clic en el botón usar como personalizado y marcando la casilla de verificación. La etapa de retardo se ajusta automáticamente a diferentes longitudes de onda de acuerdo con la curva de retardo ajustada. Para obtener imágenes in vivo, fije el ratón en la etapa de estabilización con su médula espinal expuesta e inmersa en solución salina.Ahora monte la etapa de estabilización en una etapa de cinco ejes debajo del microscopio TPEF-SRS. Luego asegure la cabeza del mouse con dos barras de cabeza y baje la placa de sujeción para ofrecer suficiente espacio para el movimiento del pecho durante la respiración, aliviando los artefactos de movimiento. A continuación, ajuste la etapa de traducción Z para ajustar el enfoque hasta que la imagen de Brightfield de la vasculatura de la médula espinal se pueda observar bajo un objetivo 10X.Localice la vena dorsal de la médula espinal en el centro del campo de visión ajustando la etapa de traslación de dos ejes de la etapa de cinco ejes. A continuación, ajuste los ángulos de balanceo y cabeceo de la etapa de cinco ejes para ajustar la superficie dorsal de la médula espinal perpendicular al eje objetivo en función de la imagen de Brightfield. Luego reemplace el 10X con un objetivo de inmersión en agua 25X para imágenes TPEF-SRS.Para obtener imágenes SRS, seleccione el divisor de haz polarizador sobre el objetivo presionando el botón del interruptor conectado a la aleta motorizada. Para las imágenes TPEF, seleccione el espejo dicroico D2 sobre el objetivo presionando el botón del interruptor conectado a la aleta motorizada. Finalmente, establezca los parámetros de imagen como se describe en el manuscrito de texto y comience a escanear la muestra.Las imágenes dual-modales in vivo de axones YFP escasamente marcados y vainas de mielina en la médula espinal del ratón revelaron que los axones están estrechamente envueltos por una gruesa capa de vainas de mielina. Como se puede ver en la imagen de la médula espinal TPEF-SRS, los ganglios de Ranvier han disminuido el diámetro axonal y la axilemma está directamente expuesta a la matriz extracelular. Combinado con nuevas sondas para fluorescencia y srS de imágenes de dos fotones excitados la microscopía SRS puede lograr imágenes estructurales y funcionales simultáneas de varias biomoléculas, facilitando nuestra comprensión de procesos biológicos complejos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Fuente: Espinoza, R., et al. Imágenes de dispersión Raman estimuladas en dos colores en tiempo real del cerebro de ratón para el diagnóstico de tejidos. J. Vis. Exp. (2022).  El video muestra imágenes de dispersión Raman estimulada (SRS) de dos colores de secciones de tejido cerebral de ratón. Dos rayos láser sincronizados se dirigen a la sección del tejido para excitar vibraciones moleculares, lo que resulta en un cambio de intensidad relativa en los haces. Los lípidos y las proteínas en el...

Imágenes de dispersión Raman estimulada a dos colores del tejido cerebral de ratón

Coherente dispersión anti-Stokes Raman (CARS) microscopía basada en la vibración inherente de la molécula se adhiere permite imágenes de células vivas químicamente selectivo libre de etiquetas. Este trabajo presenta la aplicación de una técnica de microscopía complementaria en un microscopio de barrido láser estándar multifotónica basado en un femtosegundo Ti: zafiro láser y un láser de OPO.

Implementación de un sistema coherente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) en un Ti: Zafiro y OPO láser basado en Laser Standard Microscopio de Barrido

En este manuscrito, se describe la implementación de un microscopio de dispersión Raman (SRS) estimulado, obtenido mediante la integración de una configuración experimental SRS con un microscopio de escaneo láser. El microscopio SRS se basa en dos fuentes láser de femtosegundo (fs), un Ti-Sapphire (Ti:Sa) y un oscilador paramétrico óptico sincronizado (OPO).

Implementación de un microscopio no lineal basado en la dispersión estimulada de Raman

Los cambios morfológicos ocurren en las células de fibroblastos inmune sensibles después de la activación y promueven alteraciones en el reclutamiento celular. Utilización de imágenes de 2 fotones junto con una proteína específica de fibroblastos de ingeniería genética 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) línea de ratón y verde fluorescently etiquetado lipopolysaccharide-FITC, podemos ilustrar la absorción altamente específica de lipopolisacárido en fibroblastos dérmicos y cambios...

In Vivo 2-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

La microscopia estimulada de la dispersión de Raman (SRS) permite la proyección de imagen selectiva, etiqueta-libre de mitades químicas específicas y se ha empleado con eficacia para las moléculas del lípido de la imagen in vivo. Aquí, proporcionamos una breve introducción al principio de la microscopía SRS y describimos métodos para su uso en el almacenamiento de lípidos por imágenes en Caenorhabditis elegans.

Imágenes Libres De Etiquetas De La Dinámica De Almacenamiento De Lípidos En Caenorhabditis elegans Usando Microscopía De Dispersión Raman Estimulada

La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) es una técnica de imagen potente, no destructiva y sin etiquetas. Una aplicación emergente es la histología Raman estimulada, donde las imágenes SRS de dos colores en las transiciones Raman de proteínas y lípidos se utilizan para generar imágenes de pseudo-hematoxilina y eosina. Aquí, demostramos un protocolo para imágenes SRS de dos colores en tiempo real para el diagnóstico de tejidos.

Imágenes de dispersión Raman estimuladas en dos colores en tiempo real del cerebro del ratón para el diagnóstico de tejidos

La imagen electrónica de dispersión Raman estimulada por pre-resonancia (epr-SRS) de tintes Raman similares al arco iris es una nueva plataforma para imágenes de proteínas basadas en epítopos altamente multiplexados. Aquí, presentamos una guía práctica que incluye preparación de anticuerpos, tinción de muestras de tejido, ensamblaje de microscopio SRS e imágenes de tejido epr-SRS.

Imágenes de tejidos altamente multiplexados con tintes Raman

Este artículo compara directamente la resolución, la sensibilidad y los contrastes de imagen de la dispersión Raman estimulada (SRS) y la dispersión Raman anti-Stokes coherente (CARS) integradas en la misma plataforma de microscopio. Los resultados muestran que CARS tiene una mejor resolución espacial, SRS da mejores contrastes y resolución espectral, y ambos métodos tienen una sensibilidad similar.

Comparación directa de la dispersión Raman estimulada hiperespectral y la microscopía de dispersión Raman antiespecial coherente para imágenes químicas

Presentamos un protocolo para adquirir imágenes químicas con microscopía de dispersión Raman estimulada por banda ancha (SRS). Basado en un microscopio SRS que opera con detección diferencial de bloqueo multicanal, el protocolo describe la preparación de la muestra, el ajuste del aparato SRS y la quimiometría para desenredar diferentes constituyentes de muestras químicamente heterogéneas.

Imágenes químicas multiplex basadas en microscopía de dispersión Raman estimulada por banda ancha

Utilizando una plataforma multimodal que combina modalidades de imágenes ópticas sin etiquetas, hemos desarrollado un protocolo para visualizar y cuantificar la dinámica y el metabolismo celular. A través de imágenes a través de fluorescencia multifotónica, generación de segundos armónicos y microscopía de dispersión Raman estimulada, podemos generar una visión holística del entorno celular y molecular.

Plataforma de imagen óptica multimodal para el estudio del metabolismo celular

Aprende a realizar imágenes in vivo de la médula espinal en ratones mediante microscopía dual de fluorescencia de dos fotones y dispersión Raman estimulada. Esta técnica permite estudiar dinámicas celulares y enfermedades neurodegenerativas.

In vivo Imágenes de tejidos biológicos con fluorescencia combinada de dos fotones y microscopía de dispersión Raman estimulada

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