Name: Despliegue de científicos comunitarios para realizar muestreos genéticos no destructivos de poblaciones de mariposas raras (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Aprende un protocolo de muestreo genético no destructivo para mariposas recolectando restos de huevos eclosionados. Este método permite la participación de científicos comunitarios y es rentable para estudios de conservación.

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Los autores desean agradecer a David Cuthrell, Amanda Dillon, Steve Fuller, Neil Gifford, Heidi Holman, Dean Jue, Sally Jue, Daniel Kennedy, Genevieve Kozak, Rebecca Longenecker, Maureen McClung, Matt Moran, Robin Niver, Brenda Smith, Hunter Trowbridge y Jessup Weichelt por su ayuda con varios aspectos del proyecto, incluida la logística, la coordinación, los permisos y / o la recolección de muestras. Esta investigación fue financiada a través de una subvención del Servicio de Pesca y Vida Silvestre de los Estados Unidos (Número de Identificación de Premio Federal F20AC00356) administrada por el Instituto de Manejo de Vida Silvestre (subvención SA 2021-01).

1. Difusión de suministros a científicos comunitarios
<ol><li>Revise cuidadosamente y reúna la lista completa de suministros relacionados con la recolección necesarios consultando la Tabla completa de materiales.</li>
	<li>Si la recolección de muestras se llevará a cabo en múltiples ubicaciones y/o por múltiples individuos/equipos, reúna y organice todos los suministros necesarios en unidades desplegables separadas (Figura 1 y Figura 2).</li>
	<li>Transportar suministros (unidades desplegables) a científicos comunitarios u otro personal responsable de la recolección de campo.</li>
	<li>Si el personal no es local, empaque cuidadosamente los suministros (cada unidad desplegable) en una caja de envío de cartón separada con una etiqueta de envío completa y un envío. NOTA: El envío acelerado no es necesario en esta etapa.</li>
</ol>2. Preparación de la colección de científicos comunitarios
<ol><li>Al recibir los suministros de recolección, incluida la caja de aparejos de recolección, revise cuidadosamente la lista de suministros laminados y realice un inventario completo. Notifique al líder del proyecto si falta algún suministro.</li>
	<li>Prellene los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml con 180 μL de tampón de lisis, aplique etiquetas con una etiqueta de identificación única preimpresa a cada tubo de microcentrífuga y coloque todos los tubos en la caja de almacenamiento de tubos de microcentrífuga de 64 pocillos. Asegure firmemente la tapa después de la carga. NOTA: Si las impresoras de etiquetas no están disponibles, aplique números de identificación únicos en el costado y la tapa de cada vial utilizando un marcador a prueba de etanol.</li>
	<li>Asegúrese de que todo el equipo digital (por ejemplo, teléfono inteligente o cámara) esté completamente cargado y que las baterías de repuesto estén empacadas.</li>
	<li>Llene parcialmente una hielera pequeña con hielo para el almacenamiento en el campo y el transporte local de las muestras recolectadas.</li>
	<li>Empaque todos los suministros de recolección en la caja de aparejos de recolección o en un contenedor resistente y resistente a la intemperie similar para un transporte seguro y un almacenamiento consolidado.</li>
	<li>Revise el protocolo de recolección de muestras genéticas no destructivas en detalle antes de dirigirse al campo. NOTA: Utilice el protocolo ilustrado laminado y condensado para obtener orientación adicional en el campo (Figura Suplementaria S1 y Figura Suplementaria S2).</li>
</ol>3. Recogida de muestras en el campo
<ol><li>Al llegar al sitio de campo, use un lápiz o un bolígrafo para todo clima para registrar en el cuaderno de campo resistente a la intemperie la hora del día, la fecha, el nombre general de la propiedad (por ejemplo, el Bosque Nacional Apalachicola), el nombre o la descripción de la ubicación específica del sitio del campo y la lectura del GPS si está disponible, y el nombre completo y los roles de todas las personas presentes.</li>
	<li>Localice un hábitat adecuado con la presencia de larvas de especies de plantas hospedadoras específicas para la mariposa objetivo. NOTA: Tenga cuidado para evitar o minimizar el impacto en hábitats sensibles, poblaciones de plantas y vida silvestre. Además, asegúrese de asegurar todos los permisos y / o permisos de propietarios apropiados antes de acceder a un sitio y eventos de recolección de muestras.</li>
	<li>Usando un teléfono inteligente o una cámara, tome fotografías detalladas de todos los sitios de campo, ubicaciones de recolección de muestras, plantas hospedadoras y cualquier otra información que pueda ser relevante para el proyecto. Use teléfonos inteligentes u otras cámaras que registren coordenadas GPS. NOTA: El geoetiquetado de fotos debe estar habilitado en todos los teléfonos inteligentes.</li>
	<li>Busque exhaustivamente todas las partes larvales de la planta huésped, como hojas, capullos florales, flores o frutas en desarrollo, que se sabe que se seleccionan oviponiendo (poniendo huevos) mariposas hembras adultas en busca de huevos eclosionados. Para la mayoría de los Lycaenidae, busque huevos blancos eclosionados con un agujero distintivo en el centro que se asemeje a una rosquilla de la que emergió la larva neonata (Figura 3). Busque huevos no eclosionados que sean de color algo más oscuro, a menudo verde o azulado, y que estén completamente intactos sin un agujero en el medio (Figura 4). Use una lente de mano u otro dispositivo de aumento para inspeccionar cada huevo de cerca.</li>
	<li>Una vez que se haya localizado un huevo eclosionado, póngase guantes de nitrilo en ambas manos.</li>
	<li>Usando pinzas limpias, estériles y puntiagudas, agarre y tire suavemente del huevo eclosionado de la planta huésped y colóquelo directamente en un tubo de microcentrífuga etiquetado precargado con tampón de lisis tomado de la caja de almacenamiento de 64 pocillos. NOTA: Algunos materiales de arrastre de la planta huésped (menos de 15 mm de diámetro) son aceptables y normales durante la recolección.</li>
	<li>Recoja como mínimo un total de 5 muestras por parche / sitio de la planta huésped (cada una con 1-20 huevos eclosionados), con el objetivo de >50 huevos en total en un lugar si está disponible. NOTA: Esto ayudará a garantizar que se recolecte al menos algo de tejido en cada planta / parche de muestra y aumentará las posibilidades de detectar ADN (observación personal).</li>
	<li>Después de cada recolección de huevos, limpie cuidadosamente las puntas de las pinzas sumergiéndolas en un frasco de etanol al 95% o rociándolas con etanol al 95% de una botella de compresión o usando toallitas con alcohol. NOTA: Esto ayudará a minimizar el arrastre de tejido entre eventos de muestreo.</li>
	<li>Si está disponible, recoja varios huevos eclosionados (1-20 huevos) de varias plantas en el mismo parche huésped en un solo tubo de microcentrífuga y cierre firmemente la tapa. Para las especies de mariposas que utilizan especies herbáceas o leñosas hospedadoras más grandes, recolecte múltiples huevos de diferentes lugares en la misma planta si los parches del huésped son limitados. NOTA: Las plantas están en el mismo parche huésped si sus hojas se tocan entre sí. Si hay una separación física notable entre plantas o parches, esto debe considerarse una muestra diferente. Si recolecta otro tipo de tejido, como exuvia larvaria o una sola pierna, coloque solo una pierna, fragmento de pierna o exuvia larvaria en un tubo de microcentrífuga (una muestra por individuo).</li>
	<li>Asegúrese de que todo el material recolectado esté completamente sumergido en el tampón de lisis dentro de cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Golpee la parte inferior del tubo en cuestión sobre una superficie dura para volver a sumergir cualquier muestra si es necesario.</li>
	<li>Limpie los fórceps para que se sequen con una toallita de laboratorio desechable limpia. NOTA: La limpieza cuidadosa de las pinzas es esencial para evitar la contaminación cruzada entre las muestras.</li>
	<li>Al recolectar una nueva muestra, deseche los guantes de nitrilo usados y reemplácelos con un par limpio.</li>
	<li>En un cuaderno de campo resistente a la intemperie, use un lápiz o un bolígrafo para todo clima para registrar la etiqueta de identificación única asignada desde el tubo de microcentrífuga junto con el tipo de muestra (por ejemplo, huevos, exuvias larvales o pata), el número aproximado de huevos eclosionados e información de recolección como nombres de recolectores, fecha, ubicación, especies de plantas hospedadoras y cualquier nota adicional (Figura 2).</li>
	<li>Vuelva a colocar el tubo cerrado de microcentrífuga con muestras de restos de huevo en la caja de almacenamiento de microcentrífugas de 64 pocillos.</li>
	<li>Mantenga la caja de almacenamiento de microcentrífugas de 64 pocillos en un refrigerador con hielo mientras esté en el campo.</li>
	<li>Mantenga todos los demás suministros de recolección en la caja de aparejos de recolección mientras esté en el campo para un almacenamiento y transporte seguro y consolidado entre sitios.</li>
</ol>4. Cuando se completa la recopilación de campos
<ol><li>Asegúrese de que todos los tubos de microcentrífuga que contienen muestras estén en la caja de almacenamiento de microcentrífugas de 64 pocillos en un refrigerador con hielo para el transporte.</li>
	<li>Coloque todos los suministros de recolección de campo nuevamente en la caja de aparejos de recolección.</li>
	<li>Transporte todas las muestras de vuelta a la oficina o laboratorio y revise cuidadosamente cada tubo de microcentrífuga para asegurarse de que todo el material de muestra esté completamente sumergido en el tampón de lisis.</li>
	<li>Coloque la caja de almacenamiento de microcentrífugas de 64 pocillos con muestras en un congelador hasta su envío o procesamiento. NOTA: Un congelador comercial promedio de -18 ° C es aceptable para el almacenamiento a corto plazo.</li>
	<li>Evalúe cuidadosamente todos los suministros en la caja de herramientas de recolección y reemplace cualquiera según sea necesario. Nota : esto es particularmente importante si se programan varios eventos de recopilación de campos.</li>
	<li>Guarde la caja de aparejos de recolección en un lugar seguro hasta el próximo evento de recolección de campo.</li>
	<li>Descargue todas las imágenes digitales y asegúrese de que todas estén respaldadas de forma segura en un servidor o sistema de almacenamiento basado en la nube.</li>
	<li>Escanee o fotografíe las páginas originales del cuaderno de campo resistentes a la intemperie u hojas de datos de campo que contengan datos de recopilación hasta que toda la información se pueda ingresar en una hoja de cálculo o base de datos del proyecto.</li>
</ol>5. Envío de muestras y datos
<ol><li>Retire todas las cajas de almacenamiento de microcentrífugas de 64 pocillos con muestras del congelador.</li>
	<li>Empaquete cuidadosamente las cajas de almacenamiento de microcentrífugas de 64 pocillos con muestras y el cuaderno de campo o las hojas de datos de campo en una caja de envío estándar, adjunte la etiqueta de envío proporcionada con el número de cuenta del remitente original y envíela al director del proyecto al director del proyecto mediante entrega urgente garantizada por el transportista, durante la noche y al día siguiente.</li>
	<li>Envíe por correo electrónico el número de seguimiento del paquete y una copia de las páginas escaneadas del cuaderno o las hojas de datos de campo al director del proyecto.</li>
</ol>6. Extracción de ADN
<ol><li>Una vez recibidas las cajas de almacenamiento de microcentrífugas de 64 pocillos, almacénelas a -20 °C para la preservación del ADN en muestras hasta que estén listas para la extracción de ADN.</li>
	<li>En el laboratorio, extraer ADN moliendo tejido de insectos almacenado en tampón de lisis después de descongelar desde -20 ° C. Añadir 20 μL de proteinasa K y dejar la muestra en remojo durante toda la noche a 56 °C en una incubadora calentada durante no más de 24 h.</li>
	<li>Agregue los tampones de limpieza y lavado apropiados, según la recomendación específica del fabricante13.</li>
	<li>Transfiera la muestra suspendida en tampón a una columna de centrifugado unida a un vial de recolección de 2 ml.</li>
	<li>Girar hacia abajo a 6.021 × g durante 60 s usando una centrífuga. Agregue los amortiguadores de lavado apropiados y gire hacia abajo adecuadamente.</li>
	<li>Liberar ADN unido utilizando tampón de elusión (30 μL) y girar la muestra en un tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 ml. Conservar a -20 °C. NOTA: Proceda a la secuenciación si la concentración de ADN excede 0.010 ng / ml. Ver Figura 5 para la concentración de ADN por tipo de tejido.</li>
</ol>7. Análisis de datos de secuencias de ADN
<ol><li>Recorte o edite llamadas base de baja calidad en las secuencias resultantes.</li>
	<li>Consultar secuencias contra bases de datos públicas para confirmar la identificación de especies.</li>
	<li>Alinear secuencias entre sí para comparar las diferencias entre individuos.</li>
</ol>

<ol><li>Donald, H. M., Wood, C. W., Benowitz, K. M., Johnson, R. A., Drodie, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondestructive+sampling+of+insect+DNA+from+defensive+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">Nondestructive sampling of insect DNA from defensive secretion.</a> Molecular Ecology Resources. 12 (5), 856-860 (2012).</li>
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<li>Storer, C., Daniels, J., Xiao, L., Rossetti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+noninvasive+genetic+sampling+to+survey+rare+butterfly+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Using noninvasive genetic sampling to survey rare butterfly populations.</a> Insects. 10 (10), 311(2019).</li>
<li>Wagner, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+decline+in+the+Anthropocene%3A+Death+by+a+thousand+cuts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Insect decline in the Anthropocene: Death by a thousand cuts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 20239891(2021).</li>
<li>Montgomery, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+insect+apocalypse+upon+us%3F+How+to+find+out%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Conservation%22%5BJournal%5D)">Is the insect apocalypse upon us? How to find out.</a> Biological Conservation. 241, 108327(2020).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Este protocolo describe un método de campo para muestrear de forma no destructiva mariposas raras para análisis de estructura genética de poblaciones o códigos de barras de ADN. Los beneficios generales de este protocolo están diseñados específicamente para ayudar a maximizar la implementación amplia por parte de personas de diferentes niveles de experiencia y habilidad, como científicos comunitarios, profesionales de la conservación y estudiantes. Estos incluyen un costo general relativamente bajo, suministros y equipos fáciles de adquirir, un método sencillo y accesible sin numerosos pasos demasiado complejos y fácil implementación en un área geográfica amplia. Además, se dirige al material orgánico residual que elimina la necesidad de capturar o manipular temporalmente y, en el proceso, dañar potencialmente a los organismos vivos para adquirir muestras genéticas. Además, extiende el período potencial disponible para la recolección de muestras más allá de la fenología tradicional o la vida útil de una etapa de vida particular, mejorando la flexibilidad y la oportunidad general de recolección para ayudar a maximizar el número de muestras. 
Si bien el taxón focal para este esfuerzo fue la mariposa elfina helada, un especialista en hábitat generalizado pero en declive, este protocolo se puede aplicar más ampliamente a muchos otros insectos, incluidos los de interés para la conservación. Del mismo modo, si bien el protocolo se dirige a la recolección de huevos eclosionados como fuente de material genético, puede adaptarse fácilmente a otras muestras potencialmente más tradicionales (por ejemplo, patas, fragmentos de alas, clips antenales) o incluso organismos enteros. Sin embargo, este aspecto también es una limitación potencial del protocolo. Aunque la gran mayoría de los pasos están diseñados para ser relativamente simples y rápidos de lograr, la búsqueda exhaustiva de parches de plantas hospederas larvales en busca de huevos para incubar, que individualmente suelen tener < 1.0 mm de diámetro, requiere mucho tiempo y mano de obra. No obstante, una actividad de muestreo tan extensa es particularmente ideal para una red más grande de participantes, como los científicos comunitarios. 
Al igual que con otros proyectos basados en el campo, la preparación cuidadosa es esencial. Esto incluye realizar un inventario completo de los suministros necesarios para garantizar que no falten artículos, que se haya completado cualquier trabajo de preparación requerido y que estén bien organizados, empaquetados de forma segura y listos para el despliegue en el campo. Además, todo el personal de campo, particularmente aquellos que realizan la recolección de tejidos, deben revisar el protocolo de recolección en detalle antes de cualquier evento de recolección y dirigir cualquier pregunta a las personas que supervisan el proyecto. Una vez en el campo, la parte de recolección de muestras del protocolo requiere una atención meticulosa a los detalles. Esto incluye localizar e inspeccionar cuidadosamente cualquier óvulo para asegurarse de que estén incubados y, por lo tanto, sean apropiados para la recolección, limpiar a fondo las pinzas, reemplazar los guantes para ayudar a reducir el arrastre de tejido entre eventos de muestreo y garantizar que las muestras de tejido estén completamente sumergidas en el tampón de lisis dentro de cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Por último, el registro de datos precisos y detallados es esencial, lo que incluye vincular la etiqueta de identificación única asignada desde el tubo de microcentrífuga junto con la muestra específica tomada y toda la demás información pertinente de la colección. Si bien este paso es rutinario en la investigación científica, a menudo necesita ser aclarado y reforzado a fondo para una audiencia científica comunitaria.
Aquí, demostramos el potencial de aprovechamiento de los científicos comunitarios para la recolección de muestras no letales de especies pequeñas, raras y amenazadas. Sin embargo, existen algunas limitaciones potenciales a tener en cuenta al analizar cualquier dato genético resultante. Por ejemplo, si bien agrupar muestras de un solo parche aumenta las posibilidades de recuperar suficiente ADN para la detección, también introduce potencialmente heterocigosidad. Además, como el protocolo implica recolectar el corion de óvulos eclosionados, solo las mariposas hembras, que representan el ADN parental, pueden ser muestreadas dentro de una población. No obstante, como no se disponía de datos genéticos previos a nivel poblacional para C. irus, los conocimientos resultantes obtenidos solo pueden beneficiar la conservación y el manejo de las especies. Por ejemplo, si bien se requeriría un diseño de estudio minucioso y detallado y una cuidadosa selección de marcadores para evaluar adecuadamente la estructura de la población, el protocolo de muestreo descrito aquí y el uso de códigos de barras de ADN de la subunidad 1 (CO1) de la subunidad 1 de la citocromo c oxidasa (CO1) podrían usarse para detectar la aparición de taxones raros o en peligro. Storer et detalla una discusión adicional sobre la utilidad y la aplicación de la secuenciación de ADN a partir de muestreos no letales descritos aquí. al.14.
Más allá del objetivo principal de recolectar muestras para análisis genético, el protocolo también enfatiza que los participantes tomen fotografías digitales detalladas de todos los sitios de campo, ubicaciones de recolección, plantas hospederas larvales presentes y cualquier otro elemento del hábitat circundante que pueda ser relevante. Dicha documentación ayuda a proporcionar una evaluación general del hábitat que es útil para ilustrar las condiciones existentes del sitio, como la fenología de las plantas, la densidad de recursos del huésped y el historial de manejo (por ejemplo, incendios prescritos recientes). Dicha información es particularmente útil para proyectos en los que se toman muestras de campo durante un período temporal más amplio para permitir comparaciones ambientales más detalladas. 
Por último, a medida que la disminución mundial de insectos continúa acelerándose, se necesitan urgentemente esfuerzos ampliados de evaluación y monitoreode especies 15,16. El uso de una participación más amplia de científicos comunitarios, estudiantes (por ejemplo, pasantes y becarios del Servicio de Pesca y Vida Silvestre de los Estados Unidos) y profesionales de la conservación ofrece opciones cada vez más viables para la recopilación extensa de datos de muchos tipos, incluidas muestras de ADN. En consecuencia, los datos generados a partir de este protocolo tienen muchos usos posibles. Estos incluyen ayudar a informar las acciones de conservación (por ejemplo, planificación, recuperación y manejo), decisiones de inclusión o evaluaciones del estado de las especies, e investigación ecológica, poblacional y taxonómica.

El muestreo genético poblacional efectivo de taxones de insectos raros, en declive y/o listados a menudo es fundamental para ayudar a informar las acciones de conservación y manejo. Los métodos de muestreo de tejidos letales o perjudiciales se utilizan rutinariamente para muchos análisis genéticos. Sin embargo, estos métodos son indeseables o no están permitidos porque pueden causar daño a las poblaciones existentes vulnerables o afectar negativamente el comportamiento y la aptitud física. Varias técnicas de muestreo no letales o no invasivas que involucran tejido como patas enteras, recortes de antenas o alas, exuvias larvales o hemolinfa de secreciones defensivas y otros productos, como frass, han sido adecuadas para la investigación genética de insectos 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . La viabilidad general y la aplicabilidad de estas diversas técnicas de muestreo de tejidos varían significativamente según la biología, la ecología, el comportamiento, el tamaño y la rareza del organismo focal, la situación y los individuos que recolectan el material. Por ejemplo, las piernas enteras o los recortes de apéndices requieren la captura temporal y el manejo cuidadoso de varios individuos de una etapa de vida apropiada, generalmente por personal experimentado. Del mismo modo, es probable que las fuentes de tejidos, como las exuvias larvales o frass, solo sean prácticas si los organismos están en cautiverio o retenidos temporalmente durante un período adecuado.
Para las preguntas de investigación que se hacen a nivel de población, como las relacionadas con la posible diferenciación taxonómica o la estructura genética, a menudo se requiere un muestreo a una escala temporal o geográfica más amplia (es decir, regional o continental). Como resultado, ciertas fuentes de tejido no invasivas pueden ser completamente imprácticas o, al menos, ineficientes para recolectar en cantidad. La recolección de muestras a tales escalas también puede ser logística o financieramente poco práctica o prohibitiva para los investigadores individuales o incluso para los equipos de campo más pequeños. Si bien la participación directa de los científicos de la comunidad ha sido cada vez más adoptada por la comunidad de investigación para ayudar a abordar muchos de estos desafíos y acelerar la recopilación basada en big data, la adopción ha sido limitada para los estudios que involucran muestreo no destructivo, no invasivo o de eDNA10,11,12.
Para ayudar a superar algunas de estas limitaciones potenciales, demostramos que el corion de los óvulos de mariposa eclosionados podría producir una cantidad y calidad suficientemente altas de ADN para una secuenciación exitosa de genes para confirmar la identidad de la especie y cuantificar la variación genética. Posteriormente probamos varios protocolos de recolección utilizando esta técnica13. Este trabajo piloto sirvió de base para un mayor perfeccionamiento metodológico. Este documento describe en detalle el protocolo de recolección de campo revisado, sencillo pero completo, implementado para científicos comunitarios y otro personal no experto. Este protocolo es parte de un análisis de la estructura poblacional de la mariposa elfa helada (Callophrys irus) para ayudar a informar futuras acciones de conservación y una determinación federal de posible inclusión en la Ley de Especies en Peligro de Extinción de los Estados Unidos. Aunque potencialmente requiere más mano de obra que algunos métodos no invasivos, la falta de contacto necesario con los organismos y la facilidad de uso lo convierten en un modelo potencialmente viable que se puede aplicar a otros programas de investigación genética de poblaciones dirigidos a una selección de insectos comunes y aquellos de interés para la conservación, que dejan restos de huevos residuales de ninfas o larvas recién eclosionadas. El lenguaje de protocolo presentado aquí fue desarrollado específicamente para mariposas de la familia Lycaenidae y para uso de no expertos definidos aquí como científicos comunitarios u otros individuos (por ejemplo, biólogos de agencias, pasantes) con experiencia entomológica limitada.

<table><tbody><tr><td>Refrigerador Igloo Playmate de 14 cuartos Refrigerador</td> portátil <td>Amazon</td><td>NA</td><td> Cantidad por unidad desplegable: 1 refrigerador</td></tr><tr><td>250 DNeasy Mini Columnas de Centrifugado, Proteinasa K, Tampones, Tubos de Recolección (2 mL)</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>Qiagen DNeasy Blood & Kit de pañuelos Cantidad por unidad desplegable: NA</td></tr><tr><td>Andwin Socio de Diversidad de Proveedores Científicos MARCADORES DE LABORATORIO NEGRO</td><td>FisherSci</td><td>NC9280166</td><td>a prueba de etanol marcador de laboratorio Cantidad por unidad desplegable: 2 marcadores</td></tr><tr><td>Caja</td><td></td><td></td> de envío de cartón <td>caja de envío Cantidad por unidad desplegable: según sea necesario</td></tr><tr><td>Botellas de lavado de polietileno Eisco, LDPE</td><td>FisherSci</td><td>S14091</td><td>Spray de grado de laboratorio o botella rociadora (para etanol o alcohol) Cantidad por unidad desplegable: 1 botella</td></tr><tr><td>FedEx U.S. express airbill FedEx</td><td>NA</td> envío de <td>devolución</td><td>etiqueta Cantidad por unidad desplegable: 2 etiquetas</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga premium de Fisherbrand: 1,5 mL Tubos de microcentrífuga</td><td>estériles FisherSci</td><td>NC9386261</td> de <td>1,5 mL Cantidad por unidad desplegable: 128 tubos</td></tr><tr><td>Pinzas, #4a, puntas muy finas pero extra fuertes (33 mm), 4-3/8" (111 mm) de largo</td> Pinzas de punta recta <td>Bioquip</td><td>4523</td><td> Cantidad por unidad desplegable: 2 pinzas rectas</td></tr><tr><td>Pinzas, #7, puntas curvas (13 mm), puntas muy finas, 4-1/2" (114 mm) de largo</td> Pinzas de punta curva <td>Bioquip</td><td>4527</td><td> Cantidad por unidad desplegable: 2 pinzas curvas</td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional&nbsp; Kimtech Science Kimwipes Limpiaparabrisas para tareas delicadas, 1 capa</td><td>FisherSci</td><td>06-666A</td><td>toallitas kimwipes (u otra toallita estéril) Cantidad por unidad desplegable: 1 caja</td></tr><tr><td>Laminado Ilustrado Protocolo de recolección de campo</td><td>NA</td><td></td> NA <td>Protocolo abreviado Cantidad por unidad desplegable: 1 protocolo</td></tr><tr><td>Lista de materiales laminados NA Lista de suministros NA</td><td></td><td></td><td> Cantidad por unidad desplegable: 1 lista</td></tr><tr><td>Lily Sugar 'N Cream The Original Solid Yarn, 2.5 oz, Medium 4 Positione, 100% Algodón - Hot Pink - Lavar a máquina & Hilo</td> rosa <td>seco Amazon</td><td>NA</td><td>(para asegurar a las pinzas para mayor visibilidad) Cantidad por unidad desplegable: 2 yardas</td></tr><tr><td>Lupa de Bausch & Lomb, 10x Lupa Coddington Lente</td> de mano <td>Amazon</td><td></td><td>NA Cantidad por unidad desplegable: 2 lentes de mano</td></tr><tr><td>MyGift Bandejas de plástico transparente de 2 niveles Caja de almacenamiento de suministros para manualidades/estuche de primeros auxilios con asa superior y Cerradura de pestillo</td><td>Caja</td><td>de almacenamiento de suministros de Amazon NA Cantidad por unidad desplegable: 1 caja</td><td></td></tr><tr><td>Nitrilo, Guantes Desechables, L, Sin Polvo, 2.8 mil Espesor de la palma</td><td>Guantes de laboratorio de</td> nitrilo Grainger <td>60NU14</td> (<td>grandes) Cantidad por unidad desplegable: 1 caja</td></tr><tr><td>Nitrilo, Guantes Desechables, M, Sin Polvo, 2.8 mil Espesor de la palma</td><td>Grainger</td><td>60NU13</td><td>guantes de laboratorio de nitrilo (mediano) Cantidad por unidad desplegable: 1 caja</td></tr><tr><td>Qiagen, Inc.&nbsp; TAMPÓN ATL (200 ML)</td><td>Qiagen</td><td>19076</td><td>Tampón de lisis Qiagen ATL Cantidad por unidad desplegable: 180 y micro; l/tubo; 128 tubos</td></tr><tr><td>Rite In The Rain Cuaderno de espiral lateral resistente a la intemperie, tapa amarilla, patrón de página universal (n.º 373-MX), 11 x 8,75 x 0,5</td><td>Cuaderno de campo resistente a la intemperie Amazon NA Cantidad por unidad desplegable: 1 cuaderno</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas para sellos profesionales Showgard Pinzas de punta redonda 904 904</td><td>pinzas</td><td></td><td>de punta de pala Amazon NA de 6 Cantidad por unidad desplegable: 2 pinzas de pala largas</td></tr><tr><td>Limpiaparabrisas prehumedecidos Texwipe PolySat</td><td>Toallitas con alcohol FisherSci</td><td>18-366-231</td><td> Cantidad por unidad desplegable: 100 toallitas</td></tr><tr><td>Thermo Scientific CryoBoxes</td><td>FisherSci</td><td>12-565-227</td><td>Tubos de microcentrífuga de 64 pocillos Cajas de recolección/almacenamiento Cantidad por unidad desplegable: 2 cajas</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>material de embalaje Cantidad por unidad desplegable: según sea necesario</td></tr></tbody></table>

despliegue de científicos comunitarios para realizar muestreos genéticos no destructivos de poblaciones de mariposas raras

Deploying Community Scientists to Conduct Nondestructive Genetic Sampling of Rare Butterfly Populations

La disminución mundial de insectos continúa acelerándose. Se necesita críticamente un muestreo genético eficaz para avanzar en la comprensión de muchos taxones y abordar las brechas de conocimiento existentes. Este protocolo representa un método demostrado para el muestreo no destructivo de mariposas raras para la estructura genética de la población o análisis de códigos de barras de ADN. Utiliza el corion de óvulos de mariposa eclosionados para producir ADN de cantidad y calidad suficientemente altas para una secuenciación exitosa de genes para confirmar la identidad de la especie y cuantificar la variación genética. Puede ser particularmente útil cuando otras técnicas de muestreo de tejidos no son prácticas o no están disponibles. Si bien se desarrolló para un lepidóptero, podría adaptarse fácilmente para su uso con otras especies de insectos. Fue diseñado específicamente con facilidad de uso como objetivo para ayudar a maximizar la implementación amplia por parte de individuos de diferentes niveles de experiencia y habilidad, como científicos comunitarios, profesionales de la conservación y estudiantes, y para su uso en grandes áreas geográficas para facilitar un amplio muestreo de población. Los datos generados pueden ayudar a informar las decisiones taxonómicas y de listado, las acciones de conservación y gestión, y mejorar la investigación ecológica básica.

Se enviaron materiales para recolectar hasta 563 muestras a ocho científicos de conservación y comunitarios de nueve estados en todo el rango de especies en el este de América del Norte. Los materiales se enviaron durante tres meses durante 2021 antes de las horas pico de vuelo locales. Hasta la fecha, hemos recibido un total de 160 muestras de tejido de C. irus que se han recogido (Tabla 1). El ADN genómico fue extraído siguiendo un protocolo para este tipo de muestra detallado por Storer et al.14. De estas 160 muestras, el ADN se extrajo con éxito de 88 con una concentración promedio de 1,67 ng / μL (SE ± 2,98), y el mayor rendimiento de ADN fue de 26,8 ng / μL. Las concentraciones se cuantificaron utilizando un kit de ensayo de alta sensibilidad según las instrucciones del fabricante con 2 μL de extracto.
Si bien el número total de muestras recibidas es sustancialmente menor que el número total total de materiales desplegados para la recolección, esto es predominantemente un artefacto de proporcionar una sobreabundancia de materiales de recolección al recolector primario o al líder del equipo para permitirles tener la máxima flexibilidad para incluir múltiples sitios de recolección y / o científicos comunitarios involucrados si lo desean. Además, C. iris es un taxón raro y en declive representado por poblaciones limitadas y a menudo relativamente pequeñas en toda su área de distribución existente. A pesar de esta limitación, el número total de muestras de tejido recibidas es sustancial, especialmente en comparación con lo que se esperaría con un muestreo más tradicional de mariposas adultas individuales.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63416/63416fig01.jpg"> Figura 1: Unidades desplegables individuales de todos los suministros necesarios en espera de envío a científicos comunitarios u otro personal responsable de la recolección de campo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63416/63416fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63416/63416fig02.jpg"> Figura 2: Unidad desplegable individual que incluye todos los suministros, caja de aparejos de recolección de plástico transparente y etiqueta de transportista exprés completa en espera de envío a científicos de la comunidad u otro personal responsable de la recolección de campo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63416/63416fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63416/63416fig03.jpg"> Figura 3: Foto del huevo de mariposa elfa esmerilada eclosionada (Callophrys irus) en lupino silvestre (Lupinus perennis) que muestra un agujero distinto en el centro del cual emergió la larva neonata. Tenga en cuenta que el color general del huevo eclosionado es blanco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63416/63416fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63416/63416fig04.jpg"> Figura 4: Foto de huevos de mariposa elfa helada (Callophrys irus) eclosionados sin eclosionar en lupino silvestre (Lupinus perennis). Tenga en cuenta que los huevos no eclosionados carecen de un agujero central notable y que su color general es verde azulado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63416/63416fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63416/63416fig05.jpg"> Figura 5: Concentración de ADN por tipo de tejido. Las líneas medias de la caja representan la mediana, cada caja extiende el IQR, y los bigotes de la caja son 1.5 × IQR, con cualquier punto fuera de los valores atípicos. Las muestras que contenían una sola caja de huevos tenían solo una caja de huevos, y las muestras que contenían múltiples cajas de huevos tenían al menos dos casos, con un número de casos que variaba de 2 a 20 (promedio = 5.3) por muestra. Abreviatura: IQR = rango intercuartílico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63416/63416fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Estado</td>
			<td>Estuche de huevo</td>
			<td>Cajas de huevos</td>
			<td>Frass</td>
			<td>Pierna</td>
			<td>Mudar</td>
			<td>Total general</td>
		</tr><tr><td>Arkansas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
			<td></td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Florida</td>
			<td>3</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td>7</td>
			<td>22</td>
			<td>42</td>
		</tr><tr><td>Míchigan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Nuevo Hampshire</td>
			<td>24</td>
			<td>6</td>
			<td></td>
			<td>15</td>
			<td></td>
			<td>45</td>
		</tr><tr><td>Nueva York</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>30</td>
			<td></td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>Ohio</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Wisconsin</td>
			<td>9</td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td>Oklahoma</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>16</td>
			<td>6</td>
			<td></td>
			<td>22</td>
		</tr><tr><td>Total general</td>
			<td>36</td>
			<td>21</td>
			<td>16</td>
			<td>65</td>
			<td>22</td>
			<td>160</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Número y tipo de material tisular recolectado por estado. 
Figura suplementaria S1: Portada del protocolo a doble cara, laminado, condensado e ilustrado para su uso en el campo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63416/63416_Supplemental%20Fig%20S2.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria S2. Contraportada del protocolo ilustrado de dos caras, laminado, condensado para su uso en el campo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63416/63416_Supplemental%20Fig%20s1.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Aquí, presentamos un protocolo sencillo para el muestreo genético no invasivo de poblaciones de mariposas basado en la recolección de residuos de huevos residuales. Se puede utilizar para confirmar la identidad de la especie y cuantificar la variación genética. Este protocolo se puede adaptar fácilmente a grupos más amplios para la participación de la ciencia comunitaria.

Despliegue de científicos comunitarios para realizar muestreos genéticos no destructivos de poblaciones de mariposas raras

Global insect declines continue to accelerate. Effective genetic sampling is critically needed to advance the understanding of many taxa and address ...

Este protocolo utiliza un enfoque novedoso de muestreo del corion de ovi mariposa eclosionado para el análisis genético. Puede ser particularmente útil cuando otras técnicas de muestreo de tejidos no son prácticas, no están disponibles o no están permitidas. Este protocolo tiene un costo total relativamente bajo utilizando suministros fáciles de adquirir y apunta al material orgánico residual que elimina la necesidad de capturar o manipular temporalmente y potencialmente dañar organismos vivos para adquirir muestras genéticas.El protocolo general es sencillo y fácil de aprender, pero requiere destreza y estricta atención al detalle, específicamente para localizar, identificar y eliminar con éxito muestras objetivo muy pequeñas para evitar la contaminación cruzada entre los eventos de recolección de muestras. Comience por revisar cuidadosamente y reunir la lista completa de suministros relacionados con la recolección necesarios. Si la recolección de muestras ocurre en múltiples ubicaciones o por múltiples individuos o equipos, reúna y organice todos los suministros necesarios en unidades desplegables separadas.Transportar suministros a científicos comunitarios u otro personal responsable de la recolección de campo. Si el personal no es local, empaque cuidadosamente los suministros en una caja de cartón separada con una etiqueta de envío completa y envíelos. Al recibir los suministros de recolección, incluida la caja de aparejos de recolección, revise cuidadosamente la lista de suministros laminados y realice un inventario completo.Notifique al líder del proyecto si falta algún suministro. Prellene los tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros con 180 microlitros de tampón de lisis. Aplique una etiqueta de identificación única preimpresa a cada tubo de microcentrífuga y coloque todos los tubos en la caja de almacenamiento de tubos de microcentrífuga de 64 pocillos.Asegure firmemente la tapa después de la carga. Asegúrese de que todos los equipos digitales estén completamente cargados y que las baterías de repuesto estén empacadas. Llene parcialmente una hielera pequeña con hielo para el almacenamiento en el campo y el transporte local de las muestras recolectadas.Empaque todos los suministros de recolección en la caja de aparejos de recolección o en un contenedor resistente a la intemperie similar para un transporte seguro y almacenamiento consolidado. Revise el protocolo de recolección de muestras genéticas no destructivas y detalle antes de dirigirse al campo. Al llegar al sitio de campo, use un lápiz o un bolígrafo para todo clima para registrar la hora del día, la fecha, el nombre general de la propiedad, el nombre o la descripción de la ubicación específica del sitio del campo, la lectura del GPS si está disponible y el nombre completo y los roles de todas las personas presentes en el cuaderno de campo resistente a la intemperie.Localice un hábitat adecuado para la presencia de una planta huésped larval para la mariposa objetivo específica de la especie. Usando un teléfono inteligente o una cámara, tome fotografías detalladas de todos los sitios de campo, ubicaciones de recolección de muestras, plantas hospedadoras y otra información relevante. Use teléfonos inteligentes u otras cámaras que registren coordenadas GPS.Busque exhaustivamente todas las partes larvales de la planta huésped, como hojas, capullos florales, flores o frutas en desarrollo que se sabe que son seleccionadas por las mariposas hembras adultas que postulan óvulos para huevos eclosionados. Para la mayoría de los Lycaenidae, busque huevos de eclosión blanca con un agujero distintivo en el centro que se asemeje a una rosquilla de la que emergió la larva neonata. Busque huevos sin eclosionar que sean de color más oscuro, a menudo verde o azulado, y que estén completamente intactos sin un agujero en el medio.Una vez que se localice un huevo eclosionado, use guantes de nitrilo. Usando pinzas estériles y puntiagudas, agarre y saque suavemente el huevo eclosionado de la planta huésped y colóquelo directamente en un tubo de microcentrífuga etiquetado precargado con tampón de lisis. Del mismo modo, se pueden usar y procesar otras muestras de tejido.Asegúrese de que todo el material recolectado esté completamente sumergido en el tampón de lisis dentro de cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Golpee la parte inferior del tubo sobre una superficie dura para volver a sumergir las muestras si es necesario. Al recolectar una nueva muestra, deseche los guantes de nitrilo usados y reemplácelos con un par limpio.Después de cada recolección de huevos, limpie cuidadosamente las puntas de los fórceps sumergiéndolos o rociándolos en un frasco de etanol al 95% de una botella de compresión o usando toallitas con alcohol. Recoja al menos cinco muestras por parche de planta huésped por sitio, cada muestra contiene de uno a 20 huevos, con el objetivo de obtener más de 50 huevos en total en un lugar si está disponible. Recoja de uno a 20 huevos eclosionados de varias plantas en el mismo parche huésped en un solo tubo de microcentrífuga y cierre firmemente la tapa.Para las especies de mariposas que utilizan especies herbáceas o leñosas hospedadoras más grandes, recolecte múltiples huevos de diferentes lugares en la misma planta si los parches del huésped son limitados. En el cuaderno de campo resistente a la intemperie, registre la etiqueta de identificación única asignada junto con el tipo de muestra, el número aproximado de huevos eclosionados y la información de recolección. Vuelva a colocar el tubo cerrado de microcentrífuga con muestras de restos de huevo en la caja de almacenamiento de microcentrífugas de 64 pocillos.Mantenga la caja de almacenamiento en una hielera con hielo mientras está en el campo. Coloque todos los demás suministros de recolección en la caja de aparejos de recolección para un almacenamiento y transporte seguros y consolidados entre sitios. De estas 160 muestras, el ADN se extrajo con éxito de 88 con una concentración promedio de 1,67 nanogramos por microlitro y el mayor rendimiento de ADN fue de 26,8 nanogramos por microlitro.Las concentraciones de ADN por tipo de tejido confirmaron que las muestras que contenían un solo residuo de huevo tenían solo una caja de huevos y las muestras que contenían múltiples cajas de huevos tenían al menos dos casos con un número de casos que oscilaba entre dos y 20, con un promedio de 5.3 por muestra. Se enviaron materiales para recolectar hasta 563 muestras a ocho científicos de conservación y comunitarios de nueve estados en todo el rango de especies en el este de América del Norte. Los materiales se enviaron durante tres meses durante 2021 antes de las horas pico de vuelo locales.Se han recibido un total de 160 muestras de tejido de iris de Calephelis. Es crucial minimizar la contaminación cruzada entre las muestras, garantizar que la muestra recolectada esté completamente sumergida en el tampón de lisis y registrar con precisión la etiqueta de identificación única y los datos de recolección para cada muestra. Este protocolo permitió un amplio despliegue y uso por parte de científicos comunitarios para muestrear de forma no destructiva las poblaciones existentes de una mariposa rara para ayudar a realizar un análisis de estructura genética de amplio rango.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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