Name: Membrana corioalantoidea de codorniz: una herramienta para el diagnóstico fotodinámico y la terapia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Aprende a preparar cultivo ex ovo de codorniz japonesa y utilizar la membrana corioalantoidea para diagnóstico y terapia fotodinámica de cáncer e infecciones microbianas. Este método respeta los principios 3R.

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El trabajo fue apoyado por VEGA 2/0042/21 y APVV 20-0129. La contribución de V. Huntošová es el resultado de la implementación del proyecto: Comunidad científica abierta para la investigación interdisciplinaria moderna en medicina (Acrónimo: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 apoyado por el Programa Operativo Infraestructura Integrada, financiado por el FEDER.

La investigación se realizó de acuerdo con las directrices institucionales. Todos los equipos y reactivos deben ser esterilizados en autoclave o esterilizados con etanol al 70% o luz UV.
1. Incubación de huevos
<ol><li>Almacene los huevos de codorniz fertilizados a 10-15 °C durante un máximo de 4-5 días antes de comenzar la incubación. Use solo huevos limpios y sin daños.</li>
	<li>Incubar los huevos en una incubadora de tiro forzado durante ~ 53-54 h. Ponga los huevos horizontalmente con la rotación de huevos desactivada, al 50% -60% de humedad y a 37,5 °C de temperatura de incubación.</li>
</ol>2. Preparación ex ovo del cultivo
NOTA: Después de la incubación inicial, los huevos son adecuados para comenzar el cultivo ex ovo .
<ol><li>Desinfecte la superficie del huevo con etanol al 70%, sin rotar el huevo.</li>
	<li>En un gabinete estéril de flujo laminar, abra la cáscara del huevo con pequeñas tijeras quirúrgicas estériles y transfiera el contenido a una placa de cultivo de 6 pocillos. Si se hace correctamente, el embrión se colocará sobre una yema intacta. Después de cada huevo, desinfecte las tijeras con etanol al 70%.</li>
	<li>Agregue aproximadamente 5 ml de agua estéril a los huecos en la placa de 6 pocillos, ya que la humedad es esencial para evitar que el CAM se seque.</li>
	<li>Coloque los embriones en una incubadora hasta nuevos experimentos, manteniendo una temperatura de 37 ° C y 80% -90% de humedad.</li>
	<li>Cuando el CAM esté completamente desarrollado (a partir de ED7), coloque un anillo de silicona esterilizado (6 mm de diámetro y aproximadamente 1,5 mm de espesor) en la superficie del CAM, a lo largo de los pequeños capilares. Evite los vasos sanguíneos principales al colocar el anillo. NOTA: El anillo define el espacio de trabajo, ayuda a marcar el lugar de aplicación de la sustancia y evita que el contenido líquido se escape.</li>
	<li>Terminar el cultivo de los embriones de acuerdo con la legislación del país.</li>
	<li>Es importante destacar que use guantes o mantenga las manos desinfectadas con etanol al 70% durante el trabajo. Aspire embriones con punta incorrecta u óvulos no fertilizados con un aspirador al vacío.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63422/63422fig01.jpg"> Figura 1: Preparación del cultivo ex ovo . (A) Huevos de codorniz japonesa tal como se almacenan e incuban. (B) Desinfección de la superficie del huevo con etanol. (C) La cáscara de huevo se corta con tijeras. (D) El contenido del huevo se vacía en el pozo. (E) Embrión de 3 días debidamente preparado, con vasculatura CAM en desarrollo. (F) Placas de cultivo almacenadas en una incubadora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63422/63422fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63422/63422fig02.jpg"> Figura 2: Placa de cultivo de 6 pocillos con embriones y anillos de silicona colocados en la parte superior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63422/63422fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
3. Inoculación de células tumorales
NOTA: Todos los procedimientos requieren el uso de un gabinete de flujo laminar estéril.
<ol><li>Cultivar diferentes tipos de células adherentes en matraces de acuerdo con los respectivos protocolos de cultivo.<ol><li>Retire el medio viejo de los matraces y enjuague la capa celular con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) para eliminar los restos del medio.</li>
		<li>Después de la tripsinización, inhiba la tripsina agregando el medio de cultivo y cosecha las células en tubos de centrífuga. Centrifugar las células y resuspender el pellet celular en un medio de cultivo fresco. Contar las células y resuspenderlas en un medio de cultivo celular a la concentración deseada. NOTA: También es posible producir cultivos celulares 3D, es decir, esferoides utilizando, por ejemplo, el método de gota colgante21.</li>
	</ol></li>
	<li>Implante 1 x 10 5-1 x 106 células tumorales o5-15 esferoides (por CAM) en 30 μL de solución de medio celular en el anillo de silicona en la parte superior de la CAM. NOTA: El volumen depende del tamaño del anillo de silicona utilizado. Si se utiliza un anillo de silicona con un diámetro mayor, se necesita un volumen mayor para cubrir toda el área. Dependiendo del tipo de célula, o para diferentes tipos de experimentos, se pueden utilizar varias concentraciones celulares. A veces, el raspado fino de CAM se utiliza para mejorar la adhesión de las células incrustadas.</li>
	<li>Devolver las CAM con células inoculadas a la incubadora (37 °C y 80%-90% de humedad).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63422/63422fig03.jpg"> Figura 3: Inoculación de CAM con tumores . (A) Aspiración de esferoides con una pipeta, y (B) implantación en la superficie de CAM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63422/63422fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
4. Aplicación del fotosensibilizador
<ol><li>Aplicación de hipericina<ol><li>Con poca luz, prepare una solución madre de hipericina de 2 mM disolviéndola en dimetilsulfóxido (DMSO) al 100%. Prepare una solución de trabajo de 79 μM de hipericina poco antes del experimento con PBS estéril o solución salina. Asegúrese de que la concentración final de DMSO en todas las soluciones sea siempre inferior al 0,2%, lo que no afecta el desarrollo del embrión.</li>
		<li>En condiciones estériles, aplique un volumen apropiado de solución de hipericina al anillo de silicona. Un volumen de 30 μL es suficiente para llenar un anillo con un diámetro de 6 mm.</li>
		<li>Mantener los embriones en una incubadora a 37 °C y 80%-90% de humedad. La hipericina en una solución acuosa es fotoactiva después de su monomerización en el tejido, aproximadamente 3 h después de su aplicación en el CAM.</li>
	</ol></li>
	<li>Aplicación de hipericina con LDL, HDL o nanopartículas como sistemas de transporte NOTA: Estos sistemas de transporte se utilizan para mejorar la penetración de la hipericina en las células y estructuras celulares.<ol><li>Debido a la fotosensibilidad, realice todos los pasos, incluida la preparación de soluciones, con poca luz y almacene las soluciones en la oscuridad.</li>
		<li>Preparar las formulaciones de hipericina-LDL e hipericina-HDL mezclando volúmenes apropiados de lipoproteínas y soluciones madre de hipericina en PBS de acuerdo con la referencia15. La concentración de LDL o HDL a hipericina es 20:115.</li>
		<li>Sintetizar nanopartículas poliméricas por polimerización de apertura de anillo catiónico vivo según las referencias12,13. Ajustar la concentración de hipericina en nanopartículas poliméricas con PBS a 10 μM12,13.</li>
	</ol></li>
</ol>5. PDD y PDT
<ol><li>Realizar PDD<ol><li>En condiciones estériles, aplique fotosensibilizador (hipericina, nanopartículas poliméricas cargadas de hipericina o hipericina con portador de lipoproteínas) en la superficie CAM, con o sin células tumorales (ED 7-9).</li>
		<li>Ilumine el CAM usando luz de excitación violeta (luz LED circular hecha a medida de longitud de onda de 405 nm) y registre la fluorescencia de hipericina en el tejido CAM y las células tumorales con una cámara digital a intervalos de tiempo de 0, 1, 3, 5, 24 y 48 h después de la administración de hipericina.</li>
		<li>Si la investigación requiere una imagen de la CAM en luz blanca, registre la CAM antes de la administración de hipericina y al final del experimento, poco antes de la fijación del tejido, ya que la luz afecta la fotoactivación de la hipericina.</li>
		<li>Evalúe la intensidad de fluorescencia utilizando un programa de procesamiento y análisis de imágenes (por ejemplo, ImageJ22).<ol><li>Divida los canales de imagen RGB en imágenes rojas, verdes y azules separadas. Analice la imagen de intensidad roja en forma de 8 bits. Evalúe la intensidad roja del área dentro del anillo y aproxime a ella como la fluorescencia de hipericina. Obtenga gráficos de perfil de imagen completa (utilizando el complemento Profile Plot de ImageJ) en diferentes intervalos de tiempo después de la administración de hipericina (es decir, desde 0 h, justo después de la administración, hasta 48 h).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Realizar PDT<ol><li>Realizar la TFD al menos 3 h después de la aplicación de hipericina.</li>
		<li>Coloque la fibra óptica sobre la superficie del CAM para que el rayo láser cubra toda el área dentro del anillo de silicona.</li>
		<li>Realizar irradiación in vivo (1-2 min) con una luz láser de 405 nm a una velocidad de fluencia de 285 mW/cm2.</li>
		<li>Grabar CAM con luz blanca y luz fluorescente de 405 nm antes y después del tratamiento fotodinámico (24 h y 48 h).</li>
		<li>Detecte fotodaños 24 h y 48 h después de la TFD a partir de las imágenes tomadas con luz blanca. Evaluar el daño vascular por una puntuación semicuantitativa16: 1 - sin destrucción; 2 - cierre parcial de los capilares (diámetro ≤10 μm) sin destrucción de vasos medianos o grandes (diámetro ≥50 μm) y más pequeños (diámetro 10-50 μm); 3 - cierre parcial de vasos más pequeños con capilares que desaparecen; 4 - cierre parcial de vasos más grandes con vasos más pequeños y capilares que desaparecen; y 5 - fototrombosis total con la mayoría de los vasos desapareciendo.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63422/63422fig04.jpg"> Figura 4: Tratamiento de CAM con luz láser. Esta foto fue tomada con fines ilustrativos. Para PDD o PDT, la habitación debe estar oscura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63422/63422fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
6. Preparación de CAM para una evaluación adicional
<ol><li>Incrustación de parafina<ol><li>Fijar el tejido CAM en una placa de cultivo con paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS durante un mínimo de 2 h y un máximo de durante la noche.</li>
		<li>Retire el PFA y corte cuidadosamente de la CAM una parte del tejido dentro del anillo de silicona.</li>
		<li>Deshidratar inmediatamente el tejido CAM en series ascendentes de alcohol de la siguiente manera. Coloque el tejido CAM en etanol al 70% durante 3 min, solución de eosina durante 2 min (para facilitar la ubicación del tejido en el bloque de parafina), etanol al 96% durante 3 x 5 min (siempre en una nueva placa de Petri) y etanol al 100% durante 5 min y xileno durante 2 x 10 min.</li>
		<li>Con una espátula o un cepillo fino, transferir las muestras lo más rápidamente posible a la parafina disuelta en placas de Petri (59 °C). Después de 24 h, coloque el tejido en molde histológico, llénelo con un medio de inserción de parafina y deje que se solidifique en el refrigerador. Corte la CAM solidificada del medio de incrustación, gírela en la bandeja 90°, llénela nuevamente con el medio de incrustación y deje que se solidifique.</li>
		<li>Preparar secciones de 5-10 μm en un micrótomo para el análisis histopatológico para determinar el daño inducido por PDT.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de secciones CAM congeladas para histología NOTA: Para algunas metodologías, incluida la histología, las secciones congeladas preparadas en el microtomo criostato son más adecuadas. Siga los pasos a continuación para preparar las secciones CAM congeladas.<ol><li>Monte cuidadosamente CAM nativa o fijada con paraformaldehído al 4% en el portaobjetos de vidrio.</li>
		<li>Llene el molde de incrustación a la mitad con un compuesto de temperatura de corte óptimo (OCT) y congele en nitrógeno líquido o una mezcla de hielo seco y etanol.</li>
		<li>Después de la congelación, incline y deslice con cuidado la CAM desde el portaobjetos de vidrio hasta la parte superior del medio OCT congelado. Colocar de nuevo en el molde, cubrir con medio OCT y congelar como en el paso 6.2.2.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis fractal de codornices CAM NOTA: Los cambios en la vasculatura causados por la TFD pueden evaluarse calculando el coeficiente de dimensión fractal19.<ol><li>En la cabina de flujo laminar, desbordar CAM en una placa de cultivo con una solución de fijación precalentada (37 °C) de paraformaldehído al 4% y glutaraldehído al 2% en PBS.</li>
		<li>Retirar la solución de fijación después de 48 h. Separe cuidadosamente la CAM del embrión con microtijeras y un cepillo fino y lávela en PBS.</li>
		<li>Monte la CAM lavada en un portaobjetos de vidrio y déjela secar lentamente.</li>
		<li>Fotografíe la diapositiva utilizando una cámara digital y un transiluminador como fuente de luz blanca homogénea.</li>
		<li>Procesar imágenes digitales con el software ImageJ22. Para el análisis, seleccione una región cuadrada (512 × 512 píxeles) del área con ramas arteriales distales. Binariza y esqueletizar las imágenes y calcular el coeficiente de dimensión fractal (Df) siguiendo los procedimientos descritos en la referencia31.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis molecular del tejido CAM<ol><li>Para el análisis molecular, separe cuidadosamente la CAM nativa, congele en nitrógeno líquido y guárdela a -80 °C.</li>
		<li>Determinar la expresión génica de acuerdo con los protocolos estándar para el aislamiento de ARN23, la transcripción inversa en ADNc y la PCR cuantitativa24.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63422/63422fig05.jpg"> Figura 5: Tejido CAM para análisis fractal. Después de PDT, CAM se fija, se monta en un portaobjetos y se seca para el análisis fractal. La foto fue tomada con luz blanca usando un transiluminador. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63422/63422fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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<li>Mangir, N., Dikici, S., Claeyssens, F., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Ex+Ovo+chick+chorioallantoic+membrane+%28CAM%29+assay+to+evaluate+the+biocompatibility+and+angiogenic+response+to+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+Engineering%22%5BJournal%5D)">Using Ex Ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay to evaluate the biocompatibility and angiogenic response to biomaterials.</a> ACS Biomaterials Science Engineering. 5 (7), 3190-3200 (2019).</li>
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<li>Merlos Rodrigo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+applicability+of+in+ovo+and+ex+ovo+chicken+chorioallantoic+membrane+assays+to+study+cytostatic+activity+in+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Extending the applicability of in ovo and ex ovo chicken chorioallantoic membrane assays to study cytostatic activity in neuroblastoma cells.</a> Frontiers in Oncology. 11, 1-10 (2021).</li>
<li>Meta, M., Kundeková, B., Bilčík, B., Máčajová, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+silicone+ring+application+on+CAM+vasculature+in+Japanese+Quail+%28Coturnix+japonica%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Student+Scientific+Conference+Faculty+of+Natural+Sciences+of+Comenius+University%2C+Bratislava%2C+Slovakia%22%5BJournal%5D)">The effect of silicone ring application on CAM vasculature in Japanese Quail (Coturnix japonica).</a> Proceedings of the Student Scientific Conference Faculty of Natural Sciences of Comenius University, Bratislava, Slovakia. , 385-390 (2019).</li>
<li>Kohli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-screening+the+intrinsic+angiogenic+capacity+of+biomaterials+in+an+optimised+ex+ovo+chorioallantoic+membrane+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Pre-screening the intrinsic angiogenic capacity of biomaterials in an optimised ex ovo chorioallantoic membrane model.</a> Journal of Tissue Engineering. 11, 1-15 (2020).</li>
<li>Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chorioallantoic+membrane+models+of+various+avian+species+differences+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biology-Basel%22%5BJournal%5D)">Chorioallantoic membrane models of various avian species differences and applications.</a> Biology-Basel. 10 (4), 301(2021).</li>
<li>Parsons-Wingerter, P., Elliott, K. E., Clark, J. I., Farr, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor-2+selectively+stimulates+angiogenesis+of+small+vessels+in+arterial+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor-2 selectively stimulates angiogenesis of small vessels in arterial tree.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 20 (5), 1250-1256 (2000).</li>
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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Para un cultivo ex ovo exitoso, es importante seguir el protocolo anterior. Además, si los huevos no se abren con suficiente cuidado o no hay humedad suficiente durante el cultivo, el saco vitelino se adhiere a la cáscara y, a menudo, se rompe. El inicio de un cultivo ex ovo en el momento de aproximadamente 60 h de incubación de huevos asegura la alta tasa de supervivencia de los embriones, ya que ya son lo suficientemente grandes como para sobrevivir a la manipulación. En las etapas posteriores del des...

El modelo de membrana corioalantoidea (CAM) de pollo es bien conocido y ampliamente utilizado en diversas áreas de investigación. Es un órgano extraembrionario ricamente vascularizado que proporciona intercambio gaseoso y transporte mineral1. Debido a la transparencia y accesibilidad de esta membrana, los vasos sanguíneos individuales y sus cambios estructurales se pueden observar en tiempo real2. A pesar de las ventajas, la CAM de los pollitos también tiene algunas limitaciones (por ejemplo, instalaciones de cría más grandes, producción de huevos y consumo de alimento) que podrían evitarse mediante el uso de otras especies de aves. En este protocolo, se describe un modelo alternativo ex ovo CAM utilizando embrión de codorniz japonesa (Coturnix japonica). Debido a su pequeño tamaño, permite el uso de un número mucho mayor de individuos experimentales que el pollo CAM. Además, el desarrollo embrionario más corto de 16 días de los embriones de codorniz es otra ventaja. Los primeros vasos más grandes en la CAM de codorniz aparecen en el día embrionario (DE) 7. Esto se puede comparar directamente con el desarrollo del embrión de pollo (etapas 4-35); Sin embargo, las etapas posteriores de desarrollo ya no son comparables y requieren menos tiempo para el embrión de codorniz3. De interés es la ocurrencia regular de ramificación microvascular similar a la de las CAM de pollo 4,5,6. La rápida maduración sexual, la alta producción de huevos y la reproducción de bajo costo son otros ejemplos que favorecen el uso de este modelo experimental7.
Un modelo CAM aviar se utiliza a menudo en estudios de terapia fotodinámica (TFD)8. La TFD se utiliza para tratar varias formas de cáncer (tumores pequeños localizados) y otras enfermedades no oncológicas. Su principio está en la administración de un fármaco fluorescente, un fotosensibilizador (PS), al tejido dañado y su activación con luz de la longitud de onda adecuada. Una PS prospectiva utilizada en la investigación es la hipericina, originalmente aislada de la planta medicinal hierba de San Juan (Hypericum perforatum)9. Los fuertes efectos fotosensibilizantes de este compuesto se basan en sus propiedades fotoquímicas y fotofísicas. Estos se caracterizan por múltiples picos de excitación de fluorescencia en el rango de 400-600 nm, que inducen la emisión de fluorescencia a aproximadamente 600 nm. Los máximos de absorción de hipericina dentro de la banda espectral están en el rango de 540-590 nm, y los máximos de fluorescencia están en el rango de 590-640 nm9. Para lograr estos efectos fotosensibilizantes, la hipericina es excitada por la luz láser a una longitud de onda de 405 nm después de la administración local10. En presencia de luz, la hipericina puede exhibir efectos virucidas, antiproliferativos y citotóxicos11, mientras que no hay toxicidad sistémica y es liberada rápidamente del organismo. La hipericina es una sustancia lipofílica que forma agregados no fluorescentes insolubles en agua, por lo que se utilizan varios tipos de nanoportadores, como las nanopartículas poliméricas 12,13 o las lipoproteínas de alta y baja densidad (HDL, LDL)14,15, para ayudar a su entrega y penetración en las células. Dado que CAM es un sistema naturalmente inmunodeficiente, las células tumorales se pueden implantar directamente en la superficie de la membrana. El modelo también es adecuado para registrar la extensión del daño vascular inducido por TFD de acuerdo con una puntuación definida16,17. La luz de menor intensidad en comparación con la TFD se puede utilizar para el diagnóstico fotodinámico (PDD). El monitoreo del tejido bajo la luz LED de excitación violeta también conduce a la fotoactivación de fotosensibilizadores18,19,20 que resulta en una emisión de luz fluorescente, pero no proporciona suficiente energía para iniciar una reacción PDT y dañar las células. Lo convierte en una buena herramienta para la visualización y diagnóstico de tumores o para el monitoreo de la farmacocinética de las PSs utilizadas14,15.
Este artículo describe la preparación del ensayo de codorniz ex ovo CAM con tasas de supervivencia superiores al 80%. Este cultivo ex ovo se aplicó con éxito en un gran número de experimentos.

<table><tbody><tr><td>placa de cultivo celular de 6 pocillos</td><td>Sarstedt</td><td>83.392</td><td>Poliestireno transparente, estéril</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2 ESCO CCL-0508</td><td>ESCO, Singapur</td><td>CCL-050B-8</td><td>CO2 incubadora de cultivo celular</td></tr><tr><td>criocorte Leica CM 1800</td><td>Reichert-Jung, Estados Unidos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cámara digital Canon EOS 6D II</td><td>Canon, Japón</td><td></td><td></td></tr><tr><td>láser de diodo 405 nm</td><td>Ocean Optics, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67-68-5</td><td>dimetilsulfóxido</td></tr><tr><td>eosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15086-94-9</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>cepillo fino tamaño 2</td><td>Faber-Castell</td><td>281802</td><td>cepillo para la separación y manipulación CAM</td></tr><tr><td>glutaraldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>111-30-8</td><td></td></tr><tr><td>hematoxilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>517-28-2</td><td></td></tr><tr><td>hipericina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84082-80-4</td><td></td></tr><tr><td>incubadora Bios Midi</td><td>Bios Sedl<img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/63422/63422eq01.jpg" style="margin: auto; ">any, República</td><td></td><td>Checa Incubadora de tiro forzado para incubadora inicial</td></tr><tr><td>incubadora Memmert IF160 Memmert</td><td>, Alemania</td><td></td><td>Incubadora de circulación de aire forzado para incubación CAM</td></tr><tr><td>Kaiser slimlite plano, caja de luz LED</td><td>Kaiser, Alemania</td><td>2453</td><td>Transilluminator</td></tr><tr><td>Luz LED 405 nm</td><td></td><td></td> Lente macro de <td>luz LED circular hecha a medida</td></tr><tr><td>Canon MP- E 65 mm f/ 2.8</td><td>Canon, Japón</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscopio Kapa 2000</td><td>Kvant, Eslovaquia micrótomo</td><td></td><td>de microscopio óptico</td></tr><tr><td>Auxilab 508</td><td>Auxilab, España</td><td></td><td>micrótomo rotatorio manual</td></tr><tr><td>paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3683</td><td>medio de parafina para la inclusión de tejidos</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Tijeras tampón salino fosfato</td></tr><tr><td>Castroviejo</td><td>Orimed</td><td>  OR66-108</td><td>micro tijeras para CAM software de separación</td></tr><tr><td>ImageJ 1.53</td><td>programa de procesamiento y análisis de imágenes</td>de <td>dominio</td><td></td> público</tr><tr><td>solución stock HDL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437641-10MG</td><td>lipoproteínas de alta densidad</td></tr><tr><td>solución madre LDL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437644-10MG</td><td>lipoproteínas de baja densidad</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compuesto</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td>Temperatura óptima de corte Compuesto 118 mL botellas exprimibles</td></tr></tbody></table>

membrana corioalantoidea de codorniz: una herramienta para el diagnóstico fotodinámico y la terapia

Quail Chorioallantoic Membrane - A Tool for Photodynamic Diagnosis and Therapy

La membrana corioalantoidea (CAM) de un embrión aviar es una membrana delgada y extraembrionaria que funciona como un órgano respiratorio primario. Sus propiedades lo convierten en un excelente modelo experimental in vivo para estudiar angiogénesis, crecimiento tumoral, sistemas de administración de fármacos o diagnóstico fotodinámico (PDD) y terapia fotodinámica (PDT). Al mismo tiempo, este modelo aborda el requisito de reemplazar animales de experimentación con una alternativa adecuada. El embrión cultivado ex ovo permite una fácil aplicación, acceso, monitoreo y documentación de sustancias. El más utilizado es el chick CAM; sin embargo, este artículo describe las ventajas de la CAM de codorniz japonesa como un modelo de bajo costo y alto rendimiento. Otra ventaja es el desarrollo embrionario más corto, que permite una mayor rotación experimental. Aquí se explora la idoneidad de la CAM de codorniz para PDD y PDT de cáncer e infecciones microbianas. Como ejemplo, se describe el uso del fotosensibilizador hipericina en combinación con lipoproteínas o nanopartículas como sistema de administración. Se determinó la puntuación de daño de las imágenes en luz blanca y los cambios en la intensidad de fluorescencia del tejido CAM bajo luz violeta (405 nm), junto con el análisis de las secciones histológicas. La CAM de codorniz mostró claramente el efecto de la TFD en la vasculatura y el tejido. Además, se pueden observar cambios como hemorragia capilar, trombosis, lisis de vasos pequeños y sangrado de vasos más grandes. La CAM de codorniz japonesa es un modelo in vivo prometedor para el diagnóstico fotodinámico y la investigación terapéutica, con aplicaciones en estudios de angiogénesis tumoral, así como terapia antivascular y antimicrobiana.

La localización del tumor en la superficie CAM es difícil con luz blanca. Se espera que el fotosensibilizador (aquí, hipericina) utilizado en el PDD sea absorbido selectivamente por el tumor y ayude a visualizar el tumor. La adición de hipericina y el uso de luz fluorescente (p. ej., 405 nm) mostraron muy bien la posición del tumor (carcinoma de células escamosas TE1) (Figura 6A). El análisis histológico mostró células tumorales vitales invadiendo tejidos sanos. Las estructuras concéntricas ...

La membrana corioalantoidea (CAM) del embrión aviar es una herramienta muy útil y aplicable para diversas áreas de investigación. Un modelo especial ex ovo de codorniz japonesa CAM es adecuado para la investigación de tratamientos fotodinámicos.

Membrana corioalantoidea de codorniz: una herramienta para el diagnóstico fotodinámico y la terapia

The chorioallantoic membrane (CAM) of an avian embryo is a thin, extraembryonic membrane that functions as a primary respiratory organ. Its properties ...

Vamos a mostrarle cómo preparar el cultivo ex ovo de codorniz japonesa y cómo usar la membrana corioalantoica o CAM en resumen para el diagnóstico fotodinámico y la terapia del cáncer o las infecciones microbianas. Las ventajas de este método son el rápido crecimiento del desarrollo, el tamaño pequeño, el buen acceso al tejido y el fácil manejo. Además, respeta los principios de la regla 3R para realizar investigaciones con animales.Debido a su similitud estructural con las membranas mucosas como la vejiga, los pulmones o la placenta, es adecuado para pruebas in vivo de posibles fármacos, pruebas de toxicidad o estudios de trasplante. Demostrando el procedimiento estarán Barbora Kundekova y Majlinda Meta, estudiantes de doctorado de mi laboratorio. Para comenzar, use huevos de codorniz fertilizados, frescos o almacenados a 10 a 15 grados centígrados durante un máximo de 4 a 5 días antes del inicio de la incubación.Use solo huevos limpios y sin daños, luego incube los huevos en una incubadora de tiro forzado a 50 a 60% de humedad y 37.5 grados centígrados durante aproximadamente 54 horas colocadas horizontalmente con las rotaciones de huevos apagadas. Desinfecte la superficie del huevo con etanol al 70% sin rotar el huevo. Luego, en un gabinete de flujo laminar estéril mientras usa guantes, abra la cáscara del huevo con tijeras quirúrgicas estériles pequeñas y transfiera el contenido a una placa de cultivo de 6 pocillos.Después de cada huevo, desinfecte las tijeras con etanol al 70%. Agregue aproximadamente 5 mililitros de agua estéril a los huecos en la placa de 6 pocillos, ya que la humedad es esencial para evitar que la CAM se seque. A continuación, aspire embriones con la punta incorrecta u óvulos no fertilizados con un aspirador al vacío, luego coloque los embriones en una incubadora hasta nuevos experimentos mientras mantiene una temperatura de 37 grados centígrados en 80 a 90% de humedad.Cuando la CAM esté lo suficientemente desarrollada, generalmente desde el día embrionario 7, coloque un anillo de silicona esterilizado en la superficie de la CAM a lo largo de los capilares pequeños evitando los vasos sanguíneos principales. En condiciones estériles, aplique un volumen apropiado de solución de hipericina 30 microlitros al anillo de silicona y mantenga los embriones en una incubadora a 37 grados centígrados en 80 a 90% de humedad. Para realizar un diagnóstico fotodinámico, ilumine el CAM con luz de excitación violeta y registre la fluorescencia de la hipericina y el tejido CAM y las células tumorales con una cámara digital en diferentes intervalos de tiempo después de la administración de hipericina.Si la investigación requiere una imagen de la CAM en luz blanca, registre la CAM antes de la administración de hipericina y al final del experimento poco antes de la fijación del tejido, ya que la luz desencadena la fotoactivación de la hipericina. Para realizar la terapia fotodinámica después de la aplicación de hipericina, coloque la CAM debajo de la fibra óptica para que el rayo láser cubra toda el área dentro del anillo de silicona. Después de realizar la irradiación in vivo, en este caso particular con una luz láser de 405 nanómetros a una tasa de fluencia de 285 milivatios por centímetro cuadrado, grabar CAM utilizando luz blanca y / o luz fluorescente antes y después del tratamiento fotodinámico.Fije el tejido CAM en una placa de cultivo con paraformaldehído al 4% en PBS durante un mínimo de 2 horas y un máximo de durante la noche, luego retire el paraformaldehído y corte cuidadosamente del CAM una parte del tejido dentro del anillo de silicona. Todos estos pasos deben hacerse en una campana extractora. Lave la parte cortada del tejido CAM en agua durante 10 minutos y luego deshidrate en series ascendentes de alcohol colocando el tejido CAM en etanol al 70% durante 3 minutos, solución de eosina durante 2 minutos, throcin 96% etanol durante 5 minutos, 100% etanol durante 5 minutos y dos veces en xileno durante 10 minutos en una nueva placa de Petri.Posteriormente, transfiera las muestras lo más rápido posible a la parafina disuelta en placas de Petri utilizando una espátula o un cepillo fino. Después de 24 horas, coloque el tejido en un molde histológico, llénelo con un medio de incorporación de parafina y deje que se solidifique en el refrigerador, luego corte el CAM solidificado del medio de inserción, gírelo en la bandeja 90 grados, llénelo nuevamente con el medio de incrustación y deje que se solidifique. Preparar secciones de 5 a 10 micrómetros en un micrótomo para el análisis histopatológico para determinar el daño inducido por PDT.Para preparar las secciones CAM congeladas para la histología, monte cuidadosamente CAM nativa o fija con paraformaldehído al 4% en el portaobjetos de vidrio, llene el molde de incrustación a la mitad con OCT y congélelo en nitrógeno líquido o una mezcla de hielo seco y etanol. Después de la congelación, incline y deslice con cuidado la CAM desde el portaobjetos de vidrio hasta la parte superior del medio OCT congelado. Colocar de nuevo en el molde, cubrirlo con medio OCT y congelar como se describió anteriormente.Para el análisis de la vasculatura CAM, se necesitan muestras CAM completas. En el gabinete de flujo laminar, desbordar CAM con una solución de fijación precalentada de aldehído paraformado al 4% y glutaraldehído al 2% en PBS, luego retire la solución de fijación después de 48 horas. A continuación, separe cuidadosamente el CAM del embrión con microtijeras y un cepillo fino y lávelo en PBS, luego monte el CAM lavado en un portaobjetos de vidrio y déjelo secar lentamente.Después, fotografíe la diapositiva usando una cámara digital en un transiluminador como fuente de luz blanca homogénea. La ubicación del tumor en la superficie CAM se visualizó bajo luz blanca y luz fluorescente tras la adición de hipericina. El análisis histológico mostró estructuras concéntricas de células escamosas anormales que invaden los tejidos sanos acompañados de edema y engrosamiento de la membrana.Después del tratamiento con TFD, se observó una clara diferencia en la densidad de los vasos dentro del anillo y el área circundante. La radiación láser sin la presencia de fotosensibilizador no causó ningún daño comparable al control sin ningún tratamiento. Después de 3 horas de incubación con hipericina, la irradiación láser resultó en fluorescencia causada por la monomerización de la hipericina agregada con daño extenso a la vasculatura.El análisis histológico reveló que la CAM de control no tratada tenía un grosor relativamente uniforme. Sin embargo, el tratamiento con TFD hizo que la CAM se volviera más delgada y frágil. Acabamos de demostrar cómo preparar el ensayo de codorniz ex ovo CAM y cómo usarlo.Mientras se mantienen las pautas, esta metodología es fácil de dominar y puede obtener resultados rápidos.

quail-chorioallantoic-membrane-tool-for-photodynamic-diagnosis

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

En este video, describimos el método para co-cultivar ganglios de la raíz dorsal y células cancerosas en la membrana corioalantoidea de pollo o CAM para estudiar la invasión perineural.

Membrana corioalantoidea de pollo o modelo tumoral CAM: un método in ovo para simular la invasión perineural de células tumorales

Este video muestra el aislamiento de la membrana corioalantoidea portadora de tumores del embrión de pollo. El CAM cosechado se puede utilizar para otras aplicaciones posteriores.

Cosecha de membrana corioalantoidea de pollo: un método para aislar la membrana corioalantoidea portadora de injerto tumoral del huevo de gallina

El protocolo informado aquí permite la evaluación de la eficacia de la terapia fotodinámica (PDT) en líneas de células y la optimización de la configuración de PDT antes de aplicar la terapia en modelos animales.

Citotóxica eficacia de la terapia fotodinámica en células de osteosarcoma<em&gt; In Vitro</em

Este manuscrito describe la configuración del nueva y procedimiento de microscopía fotoacústica y sistema de doble modalidad de tomografía de coherencia óptica para la proyección de imagen no invasiva, libre de etiqueta coriorretinal de animales más grandes, como conejos.

Novela de fotoacústica de microscopía y tomografía de coherencia óptica Dual-modalidad coriorretinal la proyección de imagen en ojos de conejo vivo

Terapia fotodinámica (TFD) es un procedimiento médico que involucra la incubación de un fotosensibilizador exógeno aplicado (PS) seguido por fotoactivación luz visible para inducir apoptosis. Presentamos un protocolo en vitro PDT diseñado para simular el PDT que puede utilizarse para estudiar las diferencias en incubación de PS y parámetros de tratamiento de la luz.

Un enfoque In Vitro de la terapia fotodinámica

La invasión perineuronal es un fenotipo agresivo para carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello y otros tumores. El modelo de membrana corioalantoica de polluelos se ha utilizado para estudiar angiogénesis, invasión de cáncer, y metástasis. Aquí demostramos cómo este modelo se puede utilizar para evaluar la invasión perineural in vivo.

El modelo Chick Chorioalantoic Membrane In Vivo para evaluar la invasión perineural en el cáncer de cabeza y cuello

Se ha demostrado un sistema compacto de tomografía fotoacústica de sobremesa (PLD-PAT) basado en diodos láser pulsado para obtener imágenes dinámicas in vivo de alta velocidad de la vasculatura cortical de animales pequeños.

Tomografía fotoacústica de escritorio basada en diodos láser pulsada para monitoreo de lavado y lavado de tinte en rata cortical vasculatura

Presentamos el modelo de membrana corioalantoica de pollo como un modelo alternativo, trasplantable, in vivo para el injerto de líneas celulares de cáncer ginecológico y urológico y tumores derivados del paciente.

Uso de la membrana chorioalantoica de pollo en vivo modelo para estudiar cánceres ginecológicos y urológicos

Este es un método eficaz para detectar supresores o impulsores de metástasis del cáncer. Las células, transducidas con una biblioteca de expresión, se inyectan en la vasculatura de la membrana corioalantoica del pollo para formar colonias metastásicas. Las colonias que han disminuido o aumentado la invasividad se extirpan, se expanden, se reinyectan para confirmar su fenotipo y, finalmente, se analizan mediante secuenciación de alto rendimiento.

Descubrimiento de reguladores metastásicos utilizando un modelo de membrana corioalantoica intravital de pollitos rápido y cuantitativo

El presente protocolo describe la implantación y evaluación del melanoma en la coroides murina mediante tomografía de coherencia óptica.

Implantación y evaluación del melanoma en la coroides murina mediante tomografía de coherencia óptica

Aquí, describimos un protocolo para desarrollar un modelo de xenoinjerto de membrana corioalantoidea (CAM) de pollo para tejido ovárico humano y demostramos la efectividad de la técnica, el marco de tiempo de revascularización del injerto y la viabilidad del tejido durante un período de injerto de 6 días.

El modelo de membrana corioalantoidea de pollo (CAM) como herramienta para estudiar el trasplante de tejido ovárico

Aprende a preparar cultivo ex ovo de codorniz japonesa y utilizar la membrana corioalantoidea para diagnóstico y terapia fotodinámica de cáncer e infecciones microbianas. Este método respeta los principios 3R.

Membrana corioalantoidea de codorniz: una herramienta para el diagnóstico fotodinámico y la terapia

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