Producción automatizada a gran escala de esferoides de células madre derivadas de tejido adiposo para bioimpresión 3D
31 de marzo de 2022
Aquí, describimos la producción a gran escala de esferoides estromales /células madre (ASC) derivados de tejido adiposo utilizando un sistema de pipeteo automatizado para sembrar la suspensión celular, asegurando así la homogeneidad del tamaño y la forma del esferoide. Estos esferoides ASC se pueden utilizar como bloques de construcción para enfoques de bioimpresión 3D.
La importancia del protocolo radica en la reducción de los errores humanos y la contaminación microbiológica. Además, responsable de producir miles de esferoides para enfoques de bioimpresión 3D. La principal ventaja de este asunto, sin embargo, es que ha optimizado las horas de trabajo.
Los parámetros del software son cruciales porque pueden influir en la calidad final de los esferoides. Y el mejor consejo sería realizar pruebas solo con medios de cultivo celular. La demostración visual de este método es crítica porque es un antiguo método tradicional de cultivo celular 3D basado en Begin recolectando la suspensión de células madre con una pipeta serológica de 10 mililitros y transfiriéndola a un tubo de centrífuga de 50 mililitros.
Luego, centrífuga a 400 RCF durante 5 minutos para obtener el pellet ASC. Resuspend el pellet celular usando DMEM-Low que contiene 10% FBS. Después de realizar el recuento celular, tome ASC en tubos de centrífuga separados de 15 mililitros para sembrar las recesiones 81 y 256 micromoldeadas con hidrogel no adherente.
Consulte el manuscrito de texto para obtener detalles del número de celdas utilizadas. Agregue 500 microlitros de solución estéril de agarosa ultra pura al 2% en el centro de un molde de silicona que contenga 81 o 256 huecos circulares. Después de 40 minutos, desmoldar la agarosa ultra pura del molde de silicona y colocarla en un pozo de una placa de plástico de 12 pocillos.
Agregue dos mililitros de DMEM-Low en el pozo con la agarosa micromoldeada e incube a 37 grados Celsius con un suministro de dióxido de carbono atmosférico del 5% durante al menos 12 horas antes de sembrar los ASC. Asegúrese de que el flujo laminar esté encendido y que el flujo de aire del gabinete funcione correctamente. Confirme que el equipo está conectado al voltaje correcto y que la tableta está conectada al equipo.
Compruebe si la altura del vidrio de protección del gabinete está al mismo nivel que el marcado del sensor del equipo. Presione el botón de encendido o apagado en el lado izquierdo del equipo. Luego, espere a que comiencen la tableta y el equipo.
Coloque las cajas de punta, el bastidor para tubos de centrífuga y la placa que contiene el hidrogel de agarosa micromoldeado en el espacio de trabajo del equipo. En el software abierto en la tableta, haga clic en LabWare Editor. Configure una mesa de trabajo virtual y elija las posiciones de las pipetas, las cajas de punta, el bastidor para los tubos de plástico y las placas.
Haga clic en el botón "Cambiar a procedimiento" para incluir todos los parámetros y comandos llevados a cabo por el equipo a lo largo del experimento. Espere a que se abra una barra de herramientas y una lista de procedimientos en el software. Inicialmente, para indicar los comandos, incorpore el número de muestras que se van a pipetear y arrástrelo a la lista de procedimientos.
Luego, haga clic en el botón de comando "transferencia de reactivos" en el software para transferir la suspensión ASC a los pocillos de la placa de 12 pocillos que contiene los micro moldes y arrástrela a la lista de procedimientos. Haga clic en propiedades"para configurar las posiciones de inicio y fin para que el equipo transfiera la muestra. Espere a que el software vuelva a la página Tabla de trabajo.
Configure los parámetros para la siembra automatizada de los ASC como se describe en el manuscrito de texto. Seleccione el agua como el tipo de líquido estándar. Haga clic en el botón "opciones" para configurar los parámetros para crear una suspensión homogénea de los ASC como se describe en el manuscrito de texto.
Haga clic en el botón con un símbolo de verificación en la barra superior del software para asegurarse de que no haya ningún error de programación. Haga clic en el botón reproducir en la barra superior del software para iniciar el programa. Deje que el equipo comience según lo programado.
Y espera a que emita un sonido que indique que ha terminado. Recoja la placa de 12 pocillos y luego incube a 37 grados Celsius con un suministro de dióxido de carbono atmosférico del 5% durante al menos 18 horas, para permitir la formación completa y compacta de esferoides. Cosechar manualmente los esferoides después de uno, tres y siete días de cultivo para su análisis.
Enjuague el medio con una micro pipeta para liberar los esferoides del hidrogel de agarosa no adherente micromoldeado. Recoge los esferoides manualmente con una micro pipeta y transfiérelos a un tubo centrífugo de 15 mililitros. Se midieron un total de 85 y 160 esferoides a partir de hidrogeles no adhesivos micromoldeados con 81 y 256 recesiones circulares, respectivamente.
El sistema automático de pipetas sembró la suspensión de celdas ASC en 12 pocillos de una sola placa de 12 pocillos en 15 minutos. Utilizando el hidrogel no adherente micromoldeado 81, se produjeron 972 esferoides en este estudio. Mientras que el hidrogel no adherente micromoldeado 256 produjo 3072 esferoides.
Los esferoides ASC fueron analizados por la homogeneidad de su tamaño y forma. Los esteroides ASC de micromoles con 81 recesiones mostraron un diámetro homogéneo durante el período de cultivo. En contraste con los esteroides ASC de micro moldes con 256 recesiones, la relación de diámetros más pequeño y más grande fue cercana a uno en los esferoides ASC de micro moldes con 81 y 256 recesiones.
Los análisis de viabilidad, morfología y fuerza proporcionaron evidencia para la producción exitosa y a gran escala de esferoides ASC. El mayor caso es asegurarse de que el problema se resolvió abruptamente sin errores.
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Descripción general
Este artículo describe un protocolo para la producción a gran escala de esferoides de células estromales/estaminales derivadas de tejido adiposo (ASC) utilizando un sistema automatizado de pipeteo. Este método mejora la homogeneidad en tamaño y forma de los esferoides, lo que los hace adecuados para aplicaciones de bioprintado 3D.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Cultivo celular
- Impresión biológica 3D
- Investigación con células madre
Antecedentes
- Los métodos tradicionales de cultivo celular en 3D pueden ser propensos a errores humanos.
- La contaminación microbiológica es una preocupación importante en el cultivo celular.
- Los sistemas automatizados pueden optimizar el proceso de producción.
- La calidad de los esferoides está influenciada por los parámetros del software.
Objetivo del estudio
- Reducir los errores humanos en la producción de esferoides.
- Minimizar los riesgos de contaminación.
- Producir miles de esferoides de manera eficiente para la investigación y aplicaciones.
Métodos Utilizados
- Sistema automatizado de pipeteo para la siembra de suspensión celular.
- Uso de pipetas serológicas para la recolección de suspensión de células madre.
- Transferencia de la suspensión celular a tubos de centrífuga para su procesamiento.
- Pruebas con medio de cultivo celular para optimizar las condiciones.
Resultados principales
- Producción exitosa de esferoides uniformes de células madre del tejido adiposo (ASC).
- Reducción de las horas de trabajo necesarias para la generación de esferoides.
- Mejora en el control de calidad mediante la automatización.
- Demuestra la eficacia del método en un formato visual.
Conclusiones
- El método automatizado mejora la fiabilidad de la producción de esferoides.
- Ofrece una solución escalable para aplicaciones de bioprinting 3D.
- Estudios futuros pueden basarse en este protocolo para diversas aplicaciones.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La producción a gran escala y automatizada de esferoides derivados de células madre del tejido adiposo (ASC) aborda un cuello de botella crítico en los flujos de trabajo de bioprintado 3D, al permitir la generación reproducible y con mínima contaminación de bloques constructores uniformes. Esta capacidad mejora la confianza predictiva en ingeniería de tejidos y apoya tuberías de biofabricación escalables y de alto rendimiento. La producción confiable de esferoides impacta directamente el potencial traslacional de los tejidos ingenierizados para aplicaciones preclínicas y en etapas de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite pruebas sólidas de hipótesis sobre interacciones célula-célula y célula-matriz en microentornos tridimensionales.
- Apoya la reducción de riesgos biológicos al proporcionar modelos de tejidos fisiológicamente relevantes.
- Facilita la validación funcional de objetivos mediante sistemas estandarizados y reproducibles de esferoides.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara esferoides homogéneos y validados para cribado de compuestos posteriores y desarrollo de ensayos.
- Mejora la reproducibilidad del ensayo y la consistencia de los resultados cuantitativos al minimizar errores humanos y contaminaciones.
- Permite la producción escalable de microtejidos 3D listos para ensayos, destinados a flujos de trabajo de alto rendimiento.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Proporciona construcciones de tejidos 3D relevantes para enfermedades, útiles para modelos traslacionales y estudios de biomarcadores.
- Asegura continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la estandarización de la calidad y tamaño de los esferoides.
- Reduce el riesgo al avanzar con las construcciones de tejidos hacia estudios in vivo y traslacionales.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método automatizado de producción de esferoides se sitúa en la interfaz entre el descubrimiento temprano, el desarrollo de ensayos y la generación de modelos preclínicos, facilitando la transición desde la investigación basada en hipótesis hasta la ingeniería de tejidos a escala.
- Biología de Descubrimiento: Facilita estudios mecanicistas al permitir entornos de cultivo 3D controlados para la comprobación de hipótesis.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles de esferoides para la evaluación de compuestos y la normalización de ensayos.
- Análisis: Ofrece poblaciones de esferoides homogéneas y medibles para análisis comparativos entre diferentes condiciones.
- Investigación Translacional: Se ajusta a las necesidades de modelado de enfermedades y biomarcadores mediante la producción de estructuras 3D fisiológicamente relevantes.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad escalable y automatizada para su uso repetido en múltiples programas de I+D.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la modelización de tejidos tridimensionales.
- Valor operativo: Estandariza la producción, reduce las horas de trabajo y minimiza el riesgo de contaminación.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones más acertadas de avance/no avance y una mayor eficiencia del capital al apoyar flujos de trabajo de alto rendimiento y reproducibles.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización y el avance ajustados al riesgo de proyectos de ingeniería de tejidos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de células madre y flujos de trabajo de bioimpresión 3D.
- Necesita acceso a sistemas automatizados de pipeteo e infraestructura de hidrogeles micromoldeados.
- Exige la estandarización cruzada entre equipos de parámetros de software y protocolos de control de calidad.
- Puede ser necesaria una adaptación para diferentes tipos celulares o formatos de hidrogel.
- La homogeneidad y viabilidad deben validarse rutinariamente para garantizar la fiabilidad en pasos posteriores.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:55
Trypsinization of ASC Monolayer at Passage Three
1:45
Micro Molded Non-Adherent Agarose Hydrogel Fabrication
2:31
Bio-Fabrication of ASC Spheroids Using the Automated Pipetting System
5:48
Results: Automated Pipette System for Large-Scale Generation of ASC Spheroids
7:17
Conclusion
