Cauterización de círculo completo del plexo vascular limbal para el glaucoma inducido quirúrgicamente en roedores

Desarrollamos un método simple para inducir la degeneración del glaucoma robusto y progresivo basado en la elevación temporal de la presión intraocular. Esto representa una oportunidad única para estudiar los puntos clave de la fisiopatología del glaucoma. Se trata de un modelo de fácil aprendizaje, no invasivo, de bajo coste y altamente reproducible que permite el análisis de funciones in vivo y diseños experimentales a corto plazo utilizando un número reducido de animales para cada experimento.

La retina y el nervio óptico son partes evaluables del sistema nervioso central, por lo que modelar el deterioro progresivo de estas estructuras puede proporcionar información valiosa sobre otros trastornos neurodegenerativos. Para medir la presión intraocular basal, o PIO, de los ojos de control experimentales y contralaterales, coloque a la rata anestesiada en una posición de decúbito ventral sobre la mesa de trabajo, de modo que la superficie corneal sea fácilmente accesible hasta la punta del tonómetro. Coloque la punta del tonómetro de manera que toque ligeramente la zona corneal central perpendicularmente.

A continuación, adquiera la medida pulsando el botón de medición. A continuación, coloque a la rata en una ligera posición de decúbito lateral bajo un microscopio estereoscópico e inspeccione el ojo experimental con un aumento de 40 veces. Durante el procedimiento, mantenga lubricado el ojo de control contralateral instilando una gota de carmelosa sódica o hialuronato de sodio.

A continuación, con unas pinzas curvas, empuje suavemente el globo ocular experimental hacia delante para exponer la vasculatura que rodea los 360 grados del limbo. Luego, con la otra mano, usando una cauterización oftálmica a baja temperatura, cauterice suavemente los vasos alrededor de la córnea. Tenga cuidado de no cauterizar la periferia corneal.

Confirme el éxito del procedimiento quirúrgico observando la aparición de pequeñas marcas circulares de cauterización en el limbo escleral, la obliteración de la vasculatura limbal y la dilatación de la pupila en el ojo operado. Después de la cirugía, verifique la PIO postoperatoria inmediata en ambos ojos como se demostró anteriormente. A continuación, aplique una gota de acetato de prednisolona oftálmico en la superficie anterior del ojo experimental.

Después de 40 segundos, reemplácelo con un ungüento antibiótico oftálmico. Aplicar un seguimiento clínico diario del ojo experimental con medicamentos tópicos compuestos por un antiinflamatorio no esteroideo y una pomada antibiótica. Para el análisis de la respuesta optomotora, coloque a la rata para que se habitúe en una plataforma construida con cuatro monitores de computadora en un cuadrilátero.

Mantenga el cursor rojo en forma de cruz en el fotograma de vídeo entre los ojos de la rata que se mueve libremente, ya que indica el centro del cilindro virtual. Obsérvese la respuesta optomotora que consiste en un seguimiento reflejo de la cabeza y el cuello de la rata provocado por las gradaciones rotativas. Inicialmente, introduce un estímulo con baja frecuencia espacial, luego aumenta la frecuencia progresivamente hasta que no se note el movimiento de seguimiento.

Para registrar el electrorretinograma patrón, después de anestesiar a la rata, inserte cuidadosamente el electrodo activo en la periferia temporal de la córnea. Además, inserte el electrodo de referencia en el tejido subcutáneo del canto temporal ipsilateral y el electrodo de tierra en una de las extremidades posteriores. A continuación, coloque la rata a 20 centímetros de la pantalla de estímulo, controle la línea de base de la señal e inicie la adquisición pulsando el botón Análisis del sistema de adquisición.

Después de aislar las retinas, transfiéralas a una placa de cultivo de 24 pocillos que contenga PBS de un mililitro, manteniendo la retina interna hacia arriba. Permeabilizar el tejido lavando con un tensioactivo no iónico al 0,5% diluido en PBS. Luego, incube el tejido y la solución de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente agitando suavemente.

Durante la incubación, prepare la solución de anticuerpos primarios Brn-3a y guárdela a cuatro grados centígrados. Después del bloqueo tisular, incubar las retinas en 200 microlitros de solución primaria de anticuerpos a cuatro grados centígrados durante 72 horas con una suave agitación. A continuación, lave el pañuelo con PBS.

Incubar el tejido en 200 microlitros de la solución de anticuerpos secundarios durante dos horas a temperatura ambiente y luego con una solución de contratinción nuclear durante 10 minutos para la tinción de núcleos fluorescentes. Después de tres lavados con PBS, transfiera la retina a un portaobjetos de microscopio de vidrio con dos cepillos pequeños manteniendo el lado vítreo hacia arriba. Coloque el cuadrante dorsal de la retina hacia arriba en el portaobjetos del microscopio.

Finalmente, aplique 200 microlitros de medio de montaje antidecoloración en un cubreobjetos de vidrio y colóquelo en la retina montada plana para su análisis microscópico. Bajo un microscopio de epifluorescencia confocal, utilizando un objetivo de aumento de 40 veces, examine las monturas planas para estimar las células ganglionares de la retina. Después de la enucleación del globo ocular, extirpe el segmento proximal de la porción intraorbitaria del nervio óptico, incluida parte de la porción intraocular.

Luego, coloque inmediatamente las muestras en viales o tubos que contengan de 200 a 300 microlitros de fijador frío. Después de dos horas, lavar el tejido con tampón de cacodilato de sodio frío de 100 micromolares. A continuación, se fija el tejido durante una hora en tetróxido de osmio al 1% y cloruro de calcio de cinco nanomolares a cuatro grados centígrados bajo una suave agitación.

Después de tres lavados con tampón de cacodilato de sodio frío, lavar los fragmentos del nervio óptico con agua destilada fría antes de incubar durante la noche y acetato urinario al 1% a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, después de tres lavados con agua, deshidratar progresivamente el tejido en concentraciones crecientes de acetona. Luego, realice tres rondas de soluciones de acetona de resina epoxi y de incrustación antes de incrustar el tejido en resina epoxi pura durante 24 horas.

Al día siguiente, retire las muestras del portamuestras y transfiéralas a moldes de inclusión durante 48 horas a 60 grados centígrados. Después de la polimerización, utilice un ultramicrótomo para cortar secciones semifinas transversales de los fragmentos del nervio óptico. Luego, recoja y transfiera las secciones a un portaobjetos de vidrio de microscopio.

Tiñe las secciones con azul de toluidina y toma imágenes de ellas con un microscopio óptico con un aumento de 100 veces. Para el análisis ultraestructural, realice secciones transversales ultrafinas y recolóquelas en una rejilla de cobre. Luego, tiñe las secciones con acetato urinario y citrato de plomo para un examen microscópico electrónico de transmisión.

La cauterización de círculo completo indujo la elevación de la PIO inmediatamente después de la cirugía en comparación con los ojos de control. El pico de PIO postoperatoria se observó el primer día y disminuyó gradualmente hasta los niveles basales del sexto día. Además, la función retiniana se evaluó tanto conductual como electrofisiológicamente mediante reflejo optomotor y electrorretinograma patrón, respectivamente.

Después de la cirugía, ambos parámetros mostraron dos fases distintas de deterioro: la fase aguda de hipertensión ocular en el tercer día y una fase de degeneración secundaria en el día 30. En comparación con los nervios ópticos de control, los recuentos axonales y las secciones transversales semifinas del nervio óptico disminuyeron progresivamente después de la cirugía. Las micrografías electrónicas de transmisión de los nervios ópticos del ojo de control demostraron fibras mielinizadas densamente empaquetadas separadas por procesos de células gliales delgadas y microtúbulos axonales y neurofilamentos evidentes.

Por el contrario, después de tres días de hipertensión ocular, se observaron algunas fibras degeneradas, vacuolización citoplasmática en los procesos de las células gliales y cromatina condensada en los núcleos de las células gliales. Después de siete días, hubo un aumento en las fibras axonales degeneradas y en los procesos de células gliales hipertónicas. Y después de 14 días, se observó un mayor desarreglo de las fibras del nervio óptico asociado con la invasión de los procesos de las células gliales entre los axones.

Además, la densidad de las células ganglionares de la retina disminuyó con el tiempo, principalmente en los cuadrantes retinianos dorsal y temporal. Mientras realiza este procedimiento, trate de tocar suavemente los vasos limbales con una punta de cauterización, sin afectar la periferia del cordón umbilical y asegurándose de que se observen marcas de cauterización continuas alrededor del limbo escleral. Después de este procedimiento, se pueden aplicar una variedad de métodos, como la evaluación bioquímica e inmunohistoquímica funcional de las estructuras oculares y otros métodos que pueden reconocer la fisiopatología del glaucoma.