Name: Aislamiento y cribado de la biodiversidad del suelo para hongos involucrados en la degradación de materiales recalcitrantes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Aprende a aislar hongos del suelo con potencial de biodegradación de contaminantes recalcitrantes como hidrocarburos y plásticos mediante medios selectivos y ensayos enzimáticos para aplicaciones de biorremediación ambiental.

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Reconocemos a la Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) de la Universidad de Pavía y al profesor Solveig Tosi por brindar la oportunidad de este trabajo.

1. Selección de cepas de hongos capaces de degradar materiales recalcitrantes del suelo
<ol><li>Preparación de solución antibiótica.<ol>
<li>Ponga penicilina (50 mg/L), estreptomicina (40 mg/L), clortetraciclina (40 mg/L), neomicina (100 mg/L) y cloranfenicol (100 mg/L) en 250 ml de agua estéril desionizada.</li>
		<li>Antes de agregar cloranfenicol a la solución antibiótica, disolverlo en 3 ml de etanol ≥99%.</li>
		<li>Coloque la solución antibiótica en un agitador magnético (sin calor) con una barra de agitación magnética dentro de la solución durante 10 minutos. Guárdelo a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de medios de crecimiento.<ol>
<li>Ponga 1 g de ácido húmico comercial, 3,26 g de caldo Bushnell-Haas (BH) y 15 g de agar en 1 L de agua desionizada y hágalo en autoclave durante 20 min a 121 °C (agar de ácido húmico).</li>
		<li>Coloque el agar de ácido húmico en placas de Petri debajo de un gabinete de flujo laminar.</li>
		<li>Poner 4 g de lignocelulosa, 3,26 g de BH y 15 g de agar en 1 L de agua desionizada y esterilizarlo en autoclave durante 20 min a 121 °C (agar lignocelulosa).</li>
		<li>Coloque el agar de lignocelulosa en placas de Petri debajo de un gabinete de flujo laminar.</li>
		<li>Bajo un gabinete de flujo laminar, después de que los medios se hayan solidificado en las placas de Petri, transfiera 1 ml de la solución antibiótica a las placas preparadas utilizando una jeringa estéril con un filtro de 0,2 μm para esterilizarla.</li>
		<li>Distribuya la solución antibiótica uniformemente en las superficies de la placa utilizando un esparcidor celular desechable estéril en forma de L y déjela secar al aire debajo del gabinete de flujo laminar.</li>
		<li>Poner 20 g de caldo de extracto de malta y 15 g de agar en 1 L de agua desionizada y autoclave durante 20 min a 121 °C (agar de extracto de malta - MEA).</li>
		<li>Coloque el MEA en placas de Petri debajo de un gabinete de flujo laminar.</li>
	</ol></li>
	<li>Muestreo de suelos y diluciones de suelos.<ol>
<li>Muestree el suelo de interés a una profundidad de 10 cm, eliminando cualquier planta, hierba y hojas muertas de la capa superior, y colóquelo en bolsas estériles de polietileno.</li>
		<li>Después de llegar al laboratorio, tamice el suelo con una malla de 2 mm, eliminando las raíces y los restos de plantas.</li>
		<li>Si no es posible proceder con el análisis aguas abajo de inmediato, almacene las muestras de suelo tamizadas a 4 °C.</li>
		<li>Trabajando bajo un gabinete de flujo laminar, coloque 1 g del suelo tamizado en un tubo estéril de 15 ml con 10 ml de agua desionizada estéril (1 x 10-1 dilución). Agite el tubo horizontalmente durante 30 min.</li>
		<li>Debajo de un gabinete de flujo laminar, antes de que la suspensión se asiente, tome 1 ml de la dilución 1 x 10-1 con una pipeta estéril y transfiérala a 9 ml de agua desionizada en blanco (1 x 10-2 dilución). Vórtice a fondo.</li>
		<li>Antes de que la suspensión se asiente, tome 1 ml de la dilución 1 x 10-2 con una pipeta estéril y transfiérala a 9 ml de agua desionizada en blanco (1 x 10-3 dilución). Vórtice a fondo.</li>
	</ol></li>
	<li>Diluciones de suelo de chapado en medios selectivos.<ol>
<li>Trabajando bajo un gabinete de flujo laminar, recolecte 100 μL de la dilución 1 x 10-3 usando una micropipeta con un punto estéril y transfiérala a una placa de Petri de agar húmico. Haga esto durante al menos 4 o 5 placas de Petri.</li>
		<li>Distribuya la dilución uniformemente en la superficie de la placa de Petri utilizando un esparcidor celular desechable estéril en forma de L.</li>
		<li>Deje que se seque al aire durante 10-15 minutos debajo del gabinete de flujo laminar.</li>
		<li>Repita los pasos 1.4.1.-1.4.3. utilizando placas de Petri de lignocelulosa.</li>
		<li>Incubar a 25 °C en la oscuridad durante un máximo de 15 días.</li>
	</ol></li>
	<li>Aislamiento de colonias de hongos cultivadas de medios selectivos a medios de crecimiento.<ol>
<li>A partir de 3 días después de la preparación, revise las placas de Petri de medios selectivos preparadas diariamente para detectar cualquier crecimiento de colonias de hongos durante un máximo de 15 días.</li>
		<li>Verifique todas las colonias de hongos presentes para ver si hay similitudes. Si es necesario, prepare una diapositiva para ser observada bajo un microscopio de luz. NOTA: El objetivo es aislar el mayor número de colonias de hongos, pero es necesario evitar aislar siempre la misma cepa fúngica de diferentes placas, por lo que esta comprobación es muy importante. Busca colonias con diferente macro y micromorfología.</li>
		<li>Debajo de un gabinete de flujo laminar o en un quemador Bunsen, aísle cada cepa fúngica elegida retirando suavemente una pequeña parte del micelio de la colonia con una aguja de inoculación estéril y transfiriéndola a una nueva placa de Petri MEA. NOTA: En esta fase, es muy importante ser delicado y preciso porque existe un alto riesgo de contaminación de las otras colonias de hongos presentes en la placa de Petri original. Si crece más de una cepa fúngica en la placa MEA inoculada, repita el Paso 1.5.3.</li>
		<li>Incubar a 25 °C en la oscuridad durante 7 días. Estas son las cepas de hongos que se probarán más a fondo en sustancias recalcitrantes específicas.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Pruebas de crecimiento de sustancias recalcitrantes
<ol><li>Prueba de crecimiento en vaselina.<ol>
<li>Transfiera 20 ml de BH líquido (3,26 g/L de BH) a viales de 50 ml y esterilícelos en autoclave a 121 °C durante 20 min.</li>
		<li>Transfiera 7 ml de agua desionizada a viales de vidrio de 15 ml y agregue algunos trozos de hojas de vidrio rotas en cada vial.</li>
		<li>Esterilizarlos en autoclave a 121 °C durante 20 min.</li>
		<li>Debajo del gabinete de flujo laminar, agregue 1 ml de vaselina a cada vial de BH de 50 ml con una pipeta estéril. Mantenga algunos viales con solo BH como control negativo.</li>
		<li>Debajo del gabinete de flujo laminar, retire el micelio en la superficie del medio de las placas MEA con las cepas de hongos elegidas (preparadas en el paso 1.5.3.) con una aguja estéril y transfiéralo a viales de vidrio de 15 ml con las hojas de cubierta rotas.</li>
		<li>Agite cada vial en un mezclador de vórtice durante 2 minutos, permitiendo que las hojas de cubierta rotas corten el cubo de la colonia de hongos, haciendo una suspensión de hongos.</li>
		<li>Inocular cada vial de vaselina con 200 μL de suspensión fúngica. Haga dos réplicas para cada cepa fúngica.</li>
		<li>Para el control negativo, coloque 200 μL de suspensión fúngica en viales con solo BH líquido. Además, mantenga un par de viales con vaselina sin ninguna inoculación fúngica para verificar si hay contaminación en el medio.</li>
		<li>Incubar los viales a 25 °C en la oscuridad y revisarlos después de 15 días y 30 días desde el inóculo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prueba de crecimiento en aceite de motor usado.<ol>
<li>Poner 3,26 g de BH y 15 g de agar en 1 L de agua desionizada y autoclave durante 20 min a 121 °C (BHA).</li>
		<li>Coloque el BHA en placas de Petri debajo de un gabinete de flujo laminar.</li>
		<li>Cuando se haya solidificado, transfiera 500 μL de aceite de motor usado a las placas de Petri BHA y distribúyalo uniformemente en las superficies de la placa utilizando un esparcidor de células desechable estéril en forma de L.</li>
		<li>Inocular cada placa BHA de aceite de motor usado con cada cepa fúngica, recogiendo el micelio de las placas preparadas en el Paso 1.5.3. Trabaje en un quemador Bunsen o debajo de una campana de flujo laminar para evitar la contaminación. Haga dos réplicas para cada cepa fúngica.</li>
		<li>Para el control negativo, inocule las placas de Petri solo con BHA. Además, mantenga un par de placas de Petri BHA de aceite de motor usado sin ninguna inoculación fúngica para verificar si hay contaminación en el medio.</li>
		<li>Incubar las placas de Petri a 25 °C en la oscuridad y comprobarlas después de 15 días y 30 días desde el inóculo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prueba de crecimiento en plásticos.<ol>
<li>Transfiera 200 μL de suspensión fúngica (Pasos 2.1.5.-2.1.6.) a una placa de 96 micropocillos. Haga tres réplicas de la combinación de cepa fúngica y plástico.</li>
		<li>A cada pozo con la suspensión fúngica, agregue 10 mg de un tipo diferente de polvo plástico (tereftalato de polietileno - PET, cloruro de polivinilo - PVC, polietileno de alta densidad - HDPE, poliestireno - PS, poliuretano - PUR).</li>
		<li>Para el control negativo, en lugar de agregar el polvo de plástico, agregue 200 μL de solución BH esterilizada al pozo con la suspensión de hongos. Además, para cada tipo de polvo plástico, llene un pozo con 200 μL de solución BH esterilizada y 10 mg de cada polvo plástico para verificar la contaminación del medio.</li>
		<li>Incubar las placas de micropocillos a 25 °C en la oscuridad y comprobarlas después de 15 días y 30 días desde el inóculo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Pruebas enzimáticas cualitativas
<ol><li>Prueba colorimétrica cualitativa de enzimas ligninolíticas.<ol>
<li>Poner 27 g de caldo de dextrosa de patata (PD) y 15 g de agar en 1 L de agua desionizada y esterilizarlo en autoclave durante 20 min a 121 °C (PDA).</li>
		<li>Cuando el medio se haya enfriado un poco pero todavía esté líquido, agregue ácido gálico (5 g / L) debajo de una campana de flujo laminar y coloque el medio en placas de Petri.</li>
		<li>Inocular las placas de PDA + ácido gálico con cada cepa fúngica, recogiendo el micelio de las placas preparadas en el paso 1.5.3. Trabaje en un quemador Bunsen o debajo de una campana de flujo laminar para evitar la contaminación.</li>
		<li>Como controles negativos, prepare placas de Petri con solo PDA (sin ácido gálico) e inocularlas con las cepas de hongos (una por cada cepa de hongos), así como una placa de Petri con PDA + ácido gálico y sin inoculación de hongos.</li>
		<li>Incubar las placas de Petri a 25 °C en la oscuridad y comprobarlas después de 7 días desde el inóculo.</li>
	</ol></li>
	<li>Prueba colorimétrica cualitativa de lacasas.<ol>
<li>Poner 27 g de PD y 15 g de agar en 1 L de agua desionizada y esterilizarlo en autoclave durante 20 min a 121 °C (PDA).</li>
		<li>Cuando el medio se haya enfriado un poco pero todavía esté líquido, agregue guaiacol (400 μL / L) debajo de una campana de flujo laminar y colóquelo en placas de Petri.</li>
		<li>Inocular las placas PDA + guaiacol con cada cepa fúngica, recogiendo el micelio de las placas preparadas en el paso 1.5.3. Trabaje en un quemador Bunsen o debajo de una campana de flujo laminar para evitar cualquier contaminación.</li>
		<li>Como controles negativos, preparar placas de Petri con solo PDA (sin guaiacol) e inocularlas con las cepas de hongos (una por cada cepa de hongos), así como una placa de Petri con PDA + guaiacol y sin inoculación de hongos.</li>
		<li>Incubar las placas de Petri a 25 °C en la oscuridad y comprobarlas después de 7 días desde el inóculo.</li>
	</ol></li>
	<li>Prueba cualitativa de proteasas.<ol>
<li>Prepare el medio SÍ añadiendo K2HPO4 (1 g/L), KH2PO4 (0,5 g/L), MgSO4·7H2O (0,5 g/L), MnCl2·4H2O (0,001 g/L), CuCl2·2H2O (1,4 x 10-5 g/L), ZnCl2 (1,1 x 10-5 g/L), CoCl2·6H2O (2 x 10-5 g/L), Na2MoO4·2H2O (1,3 x 10-5 g/L), FeCl3·6H2O (7,5 x 10-5 g/L), y gelatina/peptona (0,02 g/L) al agua desionizada.</li>
		<li>Coloque el medio YES en un agitador magnético (sin calor) con una barra de agitación magnética dentro del medio durante 10 minutos.</li>
		<li>Cuando todas las sales se hayan disuelto en el medio, transfiera 5 ml de la solución a viales de vidrio estéril de 20 ml y hágalos en autoclave durante 20 minutos a 121 °C.</li>
		<li>Para el control negativo, preparar unos viales de vidrio estéril de 20 ml con 5 ml de solución de BH y autoclave durante 20 min a 121 °C.</li>
		<li>Bajo un gabinete de flujo laminar, transfiera 200 μL de suspensión fúngica (Pasos 2.1.5.-2.1.6.) para cada cepa a los viales esterilizados del medio YES (haga al menos 2 réplicas por cepa fúngica). Para cada cepa fúngica, agregue 200 μL de la misma suspensión fúngica a los viales esterilizados BH para tener un control negativo.</li>
		<li>Incubar los viales a 25 °C en la oscuridad durante 21 días y revisarlos cada 7 días.</li>
	</ol></li>
	<li>Prueba cualitativa de esterasas.<ol>
<li>Prepare el medio Tween 80 agregando peptona (10 g / L), NaCl (5 g / L), CaCl2 (0.1 g / L) y 10 ml de Tween 80 a 1 L de agua desionizada.</li>
		<li>Coloque el medio Tween 80 en un agitador magnético (sin calor) con una barra de agitación magnética dentro del medio durante 10 minutos.</li>
		<li>Cuando todo esté fundido dentro del medio, transfiera 5 ml de la solución a viales de vidrio estéril de 20 ml y hágalos en autoclave durante 20 minutos a 121 °C.</li>
		<li>Para el control negativo, preparar unos viales de vidrio estéril de 20 ml con 5 ml de solución de BH y autoclave durante 20 min a 121 °C.</li>
		<li>Bajo un gabinete de flujo laminar, transfiera 200 μL de suspensión fúngica (Pasos 2.1.5.-2.1.6.) para cada cepa a los viales esterilizados medianos Tween 80 (haga al menos 2 réplicas por cepa fúngica). Para cada cepa fúngica, agregue 200 μL de la misma suspensión fúngica a los viales esterilizados BH para un control negativo.</li>
		<li>Incubar los viales a 25 °C en la oscuridad durante 21 días y revisarlos cada 7 días.</li>
	</ol></li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La rica biodiversidad del suelo es una fuente abundante de hongos que poseen numerosas capacidades metabólicas, algunas de las cuales podrían ser candidatos potenciales para la biorremediación. Las pruebas selectivas de medios (Sección 1 del protocolo) son métodos fáciles de realizar y efectivos para aislar hongos capaces de crecer en polímeros complejos naturales como su única fuente de carbono. Los hongos pueden producir hidrolasas extracelulares, inespecíficas y oxidorreductasas30 como las enzi...

El suelo es un componente fundamental de la vida en la Tierra y es la base de muchos ecosistemas. Los minerales, la materia orgánica y los microorganismos en el suelo pueden considerarse como un sistema, con asociaciones e interacciones cercanas que ocurren entre ellos. Las interacciones de estos compuestos tienen un impacto importante en los procesos terrestres, la calidad ambiental y la salud de losecosistemas 1. La contaminación del suelo plantea graves problemas ambientales en todo el mundo. La aplicación indiscriminada, a largo plazo y excesiva de sustancias recalcitrantes y tóxicas, como pesticidas, productos derivados del petróleo, plásticos y otros productos químicos, tiene graves efectos en la ecología del suelo y, como resultado, puede alterar la microbiota del suelo. Las comunidades microbianas en los suelos están compuestas por una amplia gama de organismos en diferentes estados fisiológicos, siendo la mayoría bacterias y hongos. Muchos de los contaminantes en los suelos tienen estabilidad a mediano y largo plazo, y su persistencia puede conducir al desarrollo de mecanismos adaptativos que permitan a los microorganismos utilizar sustancias recalcitrantes como nutrientes 2,3. Estos microorganismos pueden, por lo tanto, ser considerados para las técnicas de biorremediación.
La biorremediación trata de mitigar los efectos de la contaminación mediante el uso de microorganismos y sus enzimas para la degradación o transformación de residuos en compuestos menos tóxicos o no tóxicos. Varias especies de arqueas, bacterias, algas y hongos poseen esta capacidad de biorremediación4. Como resultado de sus particulares acciones biodegradativas, los hongos son organismos especialmente prometedores para la biorremediación. Pueden atacar diferentes sustratos utilizando su red hifal, lo que les permite penetrar en la matriz del suelo de manera más eficiente que otros microorganismos. Además, pueden alcanzar intersticios inaccesibles donde los contaminantes son difíciles de eliminar5, y también pueden sobrevivir a bajos niveles de humedad6. Además, los hongos sintetizan diferentes casetes de enzimas inespecíficas, generalmente para degradar sustancias recalcitrantes naturales como la celulosa, la lignina y los ácidos húmicos. Aquellos que carecen del sustrato objetivo pueden estar involucrados en la degradación de una amplia gama de contaminantes recalcitrantes, como hidrocarburos, plásticos y pesticidas 7,8,9,10. Por lo tanto, aunque muchas especies de hongos ya han sido reportadas como agentes de biorremediación, existe un creciente interés en explorar especies que aún no se han estudiado para seleccionar candidatos para la biorremediación de sustancias contaminantes recalcitrantes. Las especies ya conocidas por tener propiedades de biorremediación pertenecen al filo Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota14,15 y Mucoromycota. Por ejemplo, los géneros Penicillium y Aspergillus son bien conocidos por estar involucrados en la degradación de hidrocarburos alifáticos13, diferentes polímeros plásticos 16,17,18, metales pesados19 y colorantes20. Del mismo modo, estudios realizados sobre hongos basidiomicetos, como Phanerochaete chrysosporium y Trametes versicolor, han revelado su implicación en la oxidación de materiales recalcitrantes como hidrocarburos aromáticos13 y plásticos21. Otro ejemplo de hongos implicados en los procesos de biodegradación son los zygomycetes Rhizopus spp., Mucor spp. y Cunninghamella spp.22,23. En particular, Cunninghamella es capaz de oxidar hidrocarburos aromáticos y se considera un organismo modelo para estudiar la desintoxicación de productos de una amplia gama de xenobióticos13.
Existen varias enzimas fúngicas implicadas en los principales procesos degradativos de materiales recalcitrantes 24,25, como la esterasa, la lacasa, la peroxidasa y la proteasa. Las lacasas son oxidasas que contienen cobre producidas en la célula y posteriormente secretadas, que permiten la oxidación de una variedad de compuestos fenólicos y aromáticos. Pueden degradar orto y para difenoles, los fenoles que contienen el grupo amino, la lignina y las diaminas que contienen el grupo arilo26. Las peroxidasas utilizan peróxido de hidrógeno como mediador para degradar la lignina y otros compuestos aromáticos. Hay muchas peroxidasas diferentes, pero las que tienen el mayor potencial para degradar sustancias tóxicas son la lignina peroxidasa y la manganeso peroxidasa27.
Las esterasas y proteasas pertenecen al grupo de las enzimas extracelulares o ectocelulares, que actúan fuera de sus células de origen pero que aún están unidas a ellas. Estas enzimas pueden catalizar la hidrólisis de moléculas recalcitrantes grandes en otras más pequeñas. Debido a su baja especificidad de sustrato, estas enzimas pueden desempeñar un papel clave en la biorremediación de diversos contaminantes, como colorantes textiles, efluentes liberados de las industrias de pulpa y papel y curtido de cuero, productos derivados del petróleo, plásticos y pesticidas 28,29,30.
Ya se han publicado varios métodos de cribado para seleccionar cepas fúngicas biorremediativas. Por ejemplo, el medio de agar a base de paja se ha utilizado para detectar hongos de podredumbre blanca con alto potencial en la degradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP)31; y se han colocado pequeños trozos de madera podrida sobre agar de extracto de malta (MEA) para aislar los hongos que pudren la madera32. Sin embargo, la mayoría de los métodos que ya se han propuesto seleccionan hongos muy específicos para su actividad de interés. Esta investigación propone un enfoque más amplio para seleccionar hongos del suelo con un rango de acción más amplio. El método se basa en el recubrimiento inicial de diluciones en serie de muestras de suelo en un medio modificado con ácidos húmicos o lignocelulosa mezclada con antibióticos para seleccionar hongos con la capacidad de degradar estas sustancias recalcitrantes naturales. Los ácidos húmicos y la lignocelulosa, de hecho, son sustancias que son extremadamente resistentes a la biodegradación ya que tienen estructuras moleculares muy complejas, y esto les permite ser excelentes indicadores de la capacidad degradativa de los hongos probados33,34. Posteriormente, los hongos seleccionados en las primeras pruebas se examinan para identificar aquellos con el potencial de degradar contaminantes específicos como la vaselina, el aceite de motor usado y los plásticos. Finalmente, se realizan pruebas enzimáticas cualitativas para detectar cepas fúngicas capaces de producir enzimas implicadas en los procesos de biodegradación de sustancias recalcitrantes. Para ello se realizan ensayos de proteasa y esterasa, mientras que el ácido gálico y el guaiacol se utilizan como indicadores de la producción de lacasa y otras enzimas ligninolíticas35,36. Estos sustratos se utilizan porque se ha encontrado una fuerte correlación entre la capacidad de los hongos para oxidarlos a su forma de color marrón y la posesión de la capacidad ligninolítica 37,38,39.
A través de estos protocolos, es posible aislar cepas fúngicas con alto potencial degradativo y un amplio espectro de acción directamente de muestras de suelo. El aislamiento de estas cepas fúngicas podría ayudar a encontrar nuevos candidatos para fines de biorremediación.

<table><tbody><tr><td>Placa de 96 micropocillos</td><td>Greiner bio-one</td><td>650185</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>VWR</td><td>84609.05</td><td></td></tr><tr><td>Caldo Bushnell-Haas</td><td>Fluka</td><td>B5051</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Cloroanfenicol</td><td>Eurobio</td><td>GABCRL006Z</td><td></td></tr><tr><td>Clortetraciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>Y0001451</tr><tr><td>CoCl2&middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>CuCl2&middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3279</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.296</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3&middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>Filtro 0.2 y micro; m</td><td>Whatman</td><td>10462200</td><td></td></tr><tr><td>ácido gálico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7384</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio</td><td>Biosigma</td><td>VBS634</td><td></td></tr><tr><td>Viales de vidrio 15 mL</td><td>SciLabware</td><td>P35467</td><td></td></tr><tr><td>guaiacol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5502</td><td></td></tr><tr><td>Polietileno de alta densidad (PEAD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>434272</td><td></td></tr><tr><td>Ácidos húmicos</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>53680</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8281</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Lignocelulosa</td><td>/</td><td>/</td><td>Residuos de producción de bioetanol esterilizados</td></tr><tr><td>Esparcidor de células en forma de L</td><td>Laboindustria S.p.a</td><td>21133</td><td></td></tr><tr><td>agitador magnético</td><td>A.C.E.F</td><td>8235</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de extracto de malta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70146</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Micropipeta Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu; L</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta 200&nbsp; &mu; L</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&middot; 4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5005</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4&middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1651</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Neomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0401000</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1504489</td><td></td></tr><tr><td>peptona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83059</td><td></td></tr><tr><td>Tereftalato de polietileno (PET)</td><td>Goodfellow</td><td>ES306031</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Laboindustria S.p.a</td><td>21050</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina (Parafina líquida)</td><td>A.C.E.F</td><td></td><td></td></tr> 009661 <tr><td>Patata Caldo de Dextrosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6685</td><td></td></tr><tr><td>Poliestireno (PS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>331651</td><td></td></tr><tr><td>Poliuretano (PUR)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GF20677923 Cloruro</td><td></td></tr><tr><td>de polivinilo ( PVC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81388</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de halcón estéril</td><td>Greiner bio-one</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>Viales de vidrio estéril 20 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SU860051</td><td></td></tr><tr><td>Punto estéril 1000&nbsp; &mu; L</td><td>Gilson</td><td>F172511</td><td></td></tr><tr><td>Punto estéril 200&nbsp; &mu; L</td><td>Gilson</td><td>F172311</td><td></td></tr><tr><td>Bolsas estériles de polietileno</td><td>WHIRL-PAK</td><td>B01018</td><td></td></tr><tr><td>jeringa estéril</td><td>Rays</td><td>5523CM25</td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-6501</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de motor usado</td><td>/</td><td>/</td><td>mezcla compleja de hidrocarburos, aditivos para motores y metales, proporcionada por una empresa privada italiana</td></tr><tr><td>Viales 50 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33108-U</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0152</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento y cribado de la biodiversidad del suelo para hongos involucrados en la degradación de materiales recalcitrantes

Isolation and Screening from Soil Biodiversity for Fungi Involved in the Degradation of Recalcitrant Materials

La contaminación ambiental es un problema creciente, y la identificación de hongos involucrados en el proceso de biorremediación es una tarea esencial. El suelo alberga una increíble diversidad de vida microbiana y puede ser una buena fuente de estos hongos biorremediativos. Este trabajo tiene como objetivo la búsqueda de hongos del suelo con potencial de biorremediación mediante el uso de diferentes pruebas de cribado. Los medios de cultivo minerales suplementados con sustancias recalcitrantes como única fuente de carbono se utilizaron como pruebas de crecimiento. En primer lugar, las diluciones del suelo se enchaparon en placas de Petri con medio mineral modificado con ácidos húmicos o lignocelulosa. Las colonias de hongos en crecimiento se aislaron y probaron en diferentes sustratos, como mezclas complejas de hidrocarburos (vaselina y aceite de motor usado) y polvos de diferentes polímeros plásticos (PET, PP, PS, PUR, PVC). Las pruebas enzimáticas cualitativas se asociaron con las pruebas de crecimiento para investigar la producción de esterasas, lacasas, peroxidasas y proteasas. Estas enzimas están involucradas en los principales procesos de degradación del material recalcitrante, y su secreción constitutiva por las cepas fúngicas examinadas podría tener el potencial de ser explotada para la biorremediación. Se aislaron y probaron más de 100 cepas, y se encontraron varios aislados con buen potencial de biorremediación. En conclusión, las pruebas de detección descritas son un método fácil y de bajo costo para identificar cepas de hongos con potencial de biorremediación del suelo. Además, es posible adaptar las pruebas de detección de diferentes contaminantes, de acuerdo con los requisitos, agregando otras sustancias recalcitrantes a los medios de cultivo mínimos.

Los métodos de medios selectivos (Sección 1 del protocolo) permitieron cribar la rica biodiversidad del suelo y seleccionar los hongos con alto potencial de biorremediación. Con el ácido húmico y los medios de lignocelulosa, se aislaron más de 100 cepas de hongos. Estos hongos produjeron enzimas involucradas en la biodegradación de materiales recalcitrantes naturales, que tienen una estructura química que se asemeja a muchos contaminantes. Sin embargo, las cepas fúngicas aisladas con los medios selectivos necesitaron un ...

Aquí, presentamos un protocolo para el cribado de la biodiversidad del suelo para buscar cepas de hongos involucradas en la degradación de materiales recalcitrantes. En primer lugar, se aíslan cepas fúngicas capaces de crecer con ácidos húmicos o lignocelulosa. Su actividad se prueba tanto en ensayos enzimáticos como en contaminantes como hidrocarburos y plásticos.

Aislamiento y cribado de la biodiversidad del suelo para hongos involucrados en la degradación de materiales recalcitrantes

Environmental pollution is an increasing problem, and identifying fungi involved in the bioremediation process is an essential task. Soil hosts an ...

Este protocolo es significativo porque aísla cepas fúngicas con alto potencial degradativo directamente de muestras de suelo para ser consideradas como candidatas con fines de biorremediación. Este protocolo es un cribado de bajo coste para encontrar hongos con potencial de biorremediación. Además, da resultados que son fáciles de interpretar.Dado que esta técnica implica el manejo de microorganismos, es muy importante trabajar en esterilidad utilizando un gabinete de flujo laminar o un quemador Bunsen para evitar la contaminación. Para comenzar, muestree el suelo de interés y tamice el suelo con una malla de dos milímetros para eliminar las raíces y los restos de plantas. Debajo de un gabinete de flujo laminar, agregue un gramo del suelo tamizado en un tubo estéril de 15 mililitros.Luego, agregue 10 mililitros de agua desionizada estéril para hacer una dilución de 10 a menos uno. Agite el tubo horizontalmente durante 30 minutos. Antes de que la suspensión se asiente, tome un mililitro de 10 a la dilución menos uno con una pipeta estéril y transfiéralo a un espacio en blanco de nueve mililitros de agua desionizada para hacer una dilución de 10 a menos dos.Vórtice la suspensión a fondo. Del mismo modo, haga una dilución de 10 a menos tres de un tubo de dilución de 10 a menos dos. Para emplatar las diluciones del suelo en medios selectivos, recolecte 100 microlitros de la dilución de 10 a menos tres usando una micropipeta con un punto estéril y transfiérala a una placa de Petri de agar húmico.Distribuya la dilución uniformemente en la superficie del plato utilizando un esparcidor celular estéril, desechable y en forma de L. Prepare de cuatro a cinco de estos platos. Del mismo modo, prepare platos de lignocelulosa de un tubo de dilución de 10 a menos tres.Deje que los platos se sequen al aire durante 10 a 15 minutos antes de incubar a 25 grados centígrados en la oscuridad durante 15 días. Verifique todas las colonias de hongos presentes para ver si hay similitudes. Si es necesario, prepare una diapositiva para ser observada bajo un microscopio de luz.Debajo de un gabinete de flujo laminar o en un quemador Bunsen, aísle cada cepa fúngica elegida eliminando suavemente una pequeña parte del micelio de la colonia con una aguja de inoculación estéril. Transfiera la colonia aislada a un nuevo plato de agar de extracto de malta, o MEA. Transfiera 20 mililitros de Bushnell Haas, o medio BH, a viales de vidrio de 50 mililitros.Transfiera siete mililitros de agua desionizada a viales de 15 mililitros y agregue trozos de cubierta de vidrio roto en cada vial. Esterilizar los viales en autoclave a 121 grados centígrados durante 20 minutos. Para probar el crecimiento en vaselina, agregue un mililitro de vaselina a cada vial de BH de 50 mililitros con una pipeta estéril debajo del gabinete de flujo laminar.Mantenga algunos viales con solo BH como control negativo. Retire el micelio en la superficie del medio de la placa MEA con la cepa fúngica elegida con una aguja estéril y transfiéralo a un vial de vidrio de 15 mililitros con los resbalones de la cubierta rotos. Agite el vial en un mezclador de vórtice durante dos minutos, permitiendo que los resbalones de la cubierta rota corten el cubo de la colonia de hongos, haciendo una suspensión.Inocular cada vial de vaselina con suspensión de 200 microlitros. Haga dos réplicas para cada cepa fúngica. Para el control negativo, agregue 200 microlitros de suspensión fúngica en el vial que contenga solo medio BH.Además, mantenga el vial con vaselina sin ninguna inoculación fúngica para verificar si hay contaminación en el medio. Incubar los viales a 25 grados centígrados en la oscuridad y observarlos después de 15 y 30 días desde el inóculo. Para probar el crecimiento en aceite de motor usado, transfiera 500 microlitros de aceite de motor usado a la placa de Petri BHA y distribuya el aceite de manera uniforme.Luego, inocule la placa con cepa fúngica recolectando el micelio de las placas MEA. Para probar el crecimiento en plásticos, transfiera 200 microlitros de suspensión de hongos a una placa de 96 micropocillos. Haga tres réplicas de la combinación de cepa fúngica y plástico.Agregue 10 miligramos de un polvo de plástico diferente a cada pozo con la suspensión de hongos. Para el control negativo, agregue 200 microlitros de bh medio al pozo con la suspensión de hongos. Además, para cada polvo de plástico, llene un pozo con 200 microlitros de solución BH y 10 miligramos de cada polvo de plástico para verificar si hay contaminación.Incuba las placas a 25 grados centígrados en la oscuridad y obsérvalas después de 15 y 30 días. Para la prueba calorimétrica cualitativa de lacasas, prepare un litro de agar de dextrosa de papa, o PDA, y autoclave durante 20 minutos. Después del autoclave, cuando el medio se haya enfriado pero todavía esté líquido, agregue 400 microlitros de guaiacol debajo de una campana de flujo laminar y empáquelo en placas de Petri.Inocular la placa de guaiacol PDA con cepa fúngica recogiendo el micelio de la placa MEA. Para controles negativos, prepare placas de PDA con cada cepa de hongos y una placa con PDA y guaiacol. Incuba las placas a 25 grados centígrados en la oscuridad y obsérvalas después de siete días.Para la prueba cualitativa de esterasas, prepare un litro de tween 80 medio. Luego, coloque el medio en un agitador magnético sin calentar con una barra de agitación dentro del medio. Después de 10 minutos, cuando todo esté derretido, transfiera cinco mililitros del medio a viales estériles de 20 mililitros y autoclave.Agregue 200 microlitros de suspensión fúngica al vial esterilizado medio Tween 80. Para el control negativo, agregue cinco mililitros de medio BH en autoclave en un vial de 20 mililitros. Luego, agregue 200 microlitros de suspensión fúngica al vial.Incubar los viales a 25 grados centígrados en la oscuridad durante 21 días y observarlos cada siete días. Se evaluó el porcentaje de cepas de hongos capaces de crecer en vaselina, aceite de motor usado y polvos plásticos como su única fuente de carbono con diferentes grados de éxito. La capacidad de los hongos para explotar la vaselina se evaluó como la diferencia en el crecimiento de colonias entre el BH controlado y la vaselina que contiene.Casi el 75% de las cepas probadas pudieron usar vaselina como su única fuente de carbono y el 21% exhibió el máximo crecimiento. También se monitoreó el crecimiento de las placas que contienen solo BHA y en presencia de aceite de motor. Casi el 90% de las cepas crecieron en aceite de motor usado, con un 39% mostrando un crecimiento máximo.La formación de un halo rojo-marrón alrededor de la colonia de hongos indicó una mayor producción de lacasas y otras enzimas ligninolíticas. Aproximadamente el 60% de los hongos fueron capaces de producir lacasas. Además, el 17% de las cepas produjeron un intenso halo oscuro alrededor de la colonia en el medio guaiacol.La actividad de las esterasas se evaluó mediante la formación de un precipitado blanco en el medio Tween 80. Casi el 60% de las cepas mostraron actividad de esterasas y el 13% demostraron una mayor formación de precipitados. Este protocolo se puede adaptar para detectar hongos capaces de degradar cualquier contaminante agregando la sustancia recalcitrante de interés a un medio de cultivo mínimo.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Fuente: Villela, H. D. M. , et al. Prospección de cepas microbianas para biorremediación y desarrollo probiótico para la investigación y preservación de metaorganismos. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo muestra el aislamiento de bacterias marinas degradadoras de contaminantes mediante dilución en serie, selección de colonias y crecimiento en un medio que contiene EE2. Al utilizar EE2 como única fuente de carbono, el protocolo identifica cepas bacterianas capaces de metabolizar este contaminante...

Cribado de bacterias marinas para el aislamiento de cepas degradantes de contaminantes

Las películas de plástico con la etiqueta "biodegradable" están disponibles comercialmente para uso agrícola como coberturas. Labranza representa un método de tratamiento atractiva, pero la degradación en condiciones de campo es poco conocida. El propósito de este estudio fue desarrollar métodos para el aislamiento de hongos del suelo nativo y las bacterias que colonizan las películas de mantillo de plástico después del entierro de campo.

El aislamiento de los microorganismos del suelo nativo con potencial para romper biodegradables Mantillo películas de plástico utilizados en la agricultura

Aquí presentamos un protocolo basado en el sistema de cebo del gusano de la harina (Tenebrio molitor) que se utilizó para aislar y seleccionar hongos entomopatógenos (EPF) a partir de muestras de suelo. Se utiliza una fórmula efectiva de número de conidios (ECN) para seleccionar EPF altamente tolerante al estrés en función de las características fisiológicas para el control microbiano de plagas en el campo.

Aislamiento y selección de hongos entomopatógenos a partir de muestras de suelo y evaluación de la virulencia fúngica contra plagas de insectos

Las colonias de hongos entomopatógenos se aíslan de muestras de suelo tropical utilizando cebo Tenebrio , cebo Galleria , así como medio artificial selectivo, es decir, agar de dextrosa de papa enriquecido con extracto de levadura suplementado con cloranfenicol, tiabendazol y cicloheximida (medio CTC).

Comparación de métodos para aislar hongos entomopatógenos de muestras de suelo

Este protocolo es un método eficaz y rápido de cultivo de levaduras y el moho Aspergillus fumigatus a partir de grandes conjuntos de muestras de suelo en tan solo 7 días. Los métodos se pueden modificar fácilmente para acomodar una variedad de medios de incubación y temperaturas según sea necesario para los experimentos.

Aislamiento de levaduras y mohos cultivables de los suelos para investigar la estructura de la población de hongos

El aislamiento de microbios resistentes a metales pesados de las fuentes geotérmicas es un tema candente para el desarrollo de biosistemas de biorremediación y monitoreo ambiental. Este estudio proporciona un enfoque metodológico para aislar e identificar bacterias tolerantes a metales pesados de aguas termales.

Bioprospección de microorganismos extremófilos para hacer frente a la contaminación ambiental

El presente artículo tiene como objetivo proporcionar protocolos detallados y adecuados para el aislamiento de hongos endófitos asociados a plantas, la preservación a largo plazo de aislados, la caracterización morfológica y la extracción de ADN total para su posterior identificación molecular y análisis metagenómicos.

Aislamiento, caracterización y extracción de ADN total para identificar hongos endófitos en plantas micoheterótrofas

Este protocolo describe el diseño y uso de un chip de aislamiento (iChip) para el cultivo in situ de microbios recalcitrantes del suelo en su entorno natural. También describe el cultivo in situ de bacterias del suelo productoras de antimicrobianos. El protocolo se puede adaptar para recuperar bacterias de diversos nichos con otras propiedades deseables.

In situ Aislamiento y cultivo de bacterias recalcitrantes del suelo mediante un chip de aislamiento (iChip)

Este video muestra un procedimiento para aislar protoplastos intactos los tejidos de 14 días de edad, las plántulas de Arabidopsis. Dado que los protoplastos aislados permanecen intactos por lo menos durante 96 horas y están aislados de plantas en vez de un mes de edad, las plantas adultas, este procedimiento acelera pruebas que requieren protoplastos intactos.

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Una misión fundamental de la biología celular es definir los mecanismos que subyacen a la identidad de los orgánulos que hacen que las células eucariotas. Aquí proponemos un método para identificar los genes responsables de la integridad morfológica y funcional de los orgánulos de las plantas mediante microscopía de fluorescencia y la próxima generación de herramientas de secuenciación.

Fluorescencia microscopia de Selección y secuenciación de próxima generación: Herramientas útiles para la identificación de genes implicados en la integridad de los Orgánulos

Aprende a aislar hongos del suelo con potencial de biodegradación de contaminantes recalcitrantes como hidrocarburos y plásticos mediante medios selectivos y ensayos enzimáticos para aplicaciones de biorremediación ambiental.

Aislamiento y cribado de la biodiversidad del suelo para hongos involucrados en la degradación de materiales recalcitrantes

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