Name: Óptica no lineal sin etiquetas para el estudio de defectos dependientes de tubulina en mielina central (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Aprende a detectar oligodendrocitos con microtúbulos mediante microscopía de generación de segundo armónico en modelos de tubulinopatía. Este método avanza el estudio de la dinámica microtubular en enfermedades neurológicas.

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Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) a través de las siguientes subvenciones: infraestructura 226450 a VP-CIO, infraestructura 255277 a V.P., y FORDECYT-PRONACES/194171/2020 a V.H. Reconocemos el apoyo de Juvenal Hernández Guevara en CIO en la realización del video.

Todos los procedimientos descritos se realizaron en cumplimiento con las leyes y códigos aprobados en el título séptimo del Reglamento de la Ley General de Salud en Investigación en Salud del Gobierno de México (NOM-062-ZOO-1999) y de acuerdo con las recomendaciones de la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Experimentación y fueron aprobados por el comité institucional de bioética en investigación de la Universidad de Guanajuato y la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla.
1. Ajustes del microscopio
<ol><li>Encienda el sistema de microscopía.</li>
	<li>Encienda el láser pulsado para garantizar que estará listo para lase a un nivel de potencia óptimo y constante después de la extracción y preparación de la muestra.</li>
	<li>Sintoniza el láser a 810 nm. Para estudiar los microtúbulos tisulares se utiliza el 10%-20% de la potencia láser disponible, que, en el sistema descrito, corresponde a 13-26 mW medidos en el plano focal posterior del objetivo.</li>
	<li>Asegúrese de que el microscopio esté alineado con Köhler (Archivo suplementario 1), con el objetivo que se utilizará para la obtención de imágenes de SHG. NOTA: Esto es importante ya que, en la configuración comercial utilizada en este trabajo, la detección se realiza en modo de transmisión y a través del condensador.</li>
	<li>Elimine los filtros no deseados de la ruta de detección óptica (Figura 1A).</li>
	<li>Asegúrese de que el diafragma del condensador esté completamente abierto para garantizar que no se detenga innecesariamente la luz a este nivel.</li>
	<li>Prepare un objetivo de inmersión en aceite de apertura numérica (NA) de 25x/0,8 con una pequeña gota de aceite de inmersión en el objetivo. NOTA: Este objetivo se utilizó para que coincida mejor con el condensador NA, que era 0.55 (idealmente, NAcond≥ NAobj).</li>
</ol>2. Controles preliminares del microscopio
NOTA: Realice los controles preliminares del microscopio una vez, a menos que se modifique la configuración.
<ol><li>Imagen de almidón de maíz seco intercalado entre portaobjetos de vidrio con parámetros SHG para generar imágenes de SHG que revelan la dirección de polarización del láser. Siga los pasos indicados en el Archivo complementario 2, excepto la potencia del láser, que es inferior al 5% para el almidón de maíz.</li>
	<li>Tome una imagen de granos de almidón de maíz dispersos y marque la orientación de los lóbulos SHG en el plano x-y. Esta orientación corresponde a la orientación del láser (Figura 2A).</li>
	<li>Como control, tome otra imagen de la misma muestra, insertando en la trayectoria óptica una placa de media onda (posición mostrada en la Figura 1A) para alterar la dirección de oscilación del láser. La imagen resultante muestra lóbulos de señal SHG girados (Figura 2B, C).</li>
	<li>Si utiliza un tipo diferente de filtro de paso de banda para el SHG, asegúrese de que tenga propiedades de transmisión óptimas comparando las imágenes (Figura 2D, E) y las intensidades de señal píxel por píxel a lo largo de un escaneo de línea (Figura 2F).</li>
</ol>3. Extracción de tejidos
NOTA: Utilice siempre herramientas limpias para realizar los procedimientos quirúrgicos.
<ol><li>Use ratas taiep de 6 a 12 meses de edad y controles Sprague-Dawley (WT) de la misma edad.</li>
	<li>Anestesiar a los animales con una inyección i.p. de una mezcla de ketamina-xilazina (0,125 mg/Kg y 5 mg/Kg) diluida en una solución estéril de NaCl al 0,9%.<ol><li>Verifique los reflejos del dolor y proceda solo si están ausentes.</li>
	</ol></li>
	<li>Sacrificar el animal a través de la decapitación.</li>
	<li>Una vez que la cabeza esté aislada, abra los huesos de la bóveda craneal cuidadosamente a lo largo de la línea media, comenzando desde el punto más caudal en la parte superior hacia la nariz, desde las cavidades orbitales hacia la línea media, y luego desde el punto más caudal hasta debajo del cerebro y el cerebelo. NOTA: Los cortadores de huesos y Rongeurs permiten la eliminación adecuada de los huesos de la cabeza sin dañar las estructuras cerebrales.</li>
	<li>Liberar el cerebro y el cerebelo del hueso. Los dos hemisferios podrían separarse. Si los hemisferios están divididos, use una mitad para las imágenes de SHG y fije la otra mitad en paraformaldehído al 3,7% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 20 minutos dentro de una campana química para su posterior seccionamiento y tinción.</li>
</ol>4. Sección de vibratoré
<ol><li>Prepare una bandeja tampón de vibratomo llena de solución salina equilibrada (HBSS) tibia (37 °C) de Hank's.</li>
	<li>Fije el cerebro a la placa de la muestra usando pegamento de cianoacrilato a través de un trozo de cinta adhesiva. La porción / región más caudal entra en contacto con el pegamento para que se puedan cortar las secciones coronales utilizables de la porción rostral opuesta.<ol><li>Permita ~10 s para que el pegamento polimerice para obtener una unión efectiva de la muestra. NOTA: Los mejores resultados se obtienen cuando el cerebro está orientado de manera que la cuchilla corta "de arriba a abajo" en lugar de "de lado a lado" (Figura 1B).</li>
	</ol></li>
	<li>Transfiera la placa de la muestra a su soporte magnético dentro de la bandeja intermedia.</li>
	<li>Comience a cortar secciones de 300-500 μm hasta que las rebanadas producidas abarquen toda la superficie del cerebro.</li>
	<li>En este punto, reduzca el grosor de la sección a 160 μm.</li>
	<li>Una vez cortada una sección completa de 160 μm a nivel del cuerpo calloso, recuperarla con una pipeta Pasteur de vidrio modificada con un orificio grande y flameado (Figura 1C).</li>
	<li>Transfiéralo a una placa de Petri limpia con HBSS nuevo y caliente o directamente sobre el soporte de vidrio para microscopía (cubreobjetos o plato con fondo de vidrio). NOTA: Para las condiciones experimentales descritas, agregar un cubreobjetos sobre la muestra es perjudicial para la imagen.</li>
</ol>5. Transferencia al microscopio
<ol><li>Si el microscopio está en una habitación diferente, prepare una caja aislada con paquetes de gel calentados para transferir las secciones de tejido mientras mantiene la temperatura. La caja también sirve para mantener las secciones calientes hasta que se visualizen.</li>
	<li>Coloque la muestra bajo el microscopio y asegúrese de que esté colocada correctamente debajo del objetivo mediante la observación directa a través de los oculares con luz transmitida. NOTA: El objetivo es alinear las estructuras emisoras previstas con la dirección de oscilación del láser para maximizar la señal SHG emitida (y, por lo tanto, detectada).</li>
	<li>Retire el exceso de HBSS para que una película líquida delgada cubra toda la muestra. Revise visualmente la película líquida cada pocos minutos para evitar la evaporación excesiva y el secado de la muestra. NOTA: En las condiciones descritas, una sección se utiliza durante no más de 20 minutos. El secado de la muestra provoca efectos artificóficos drásticos (Figura complementaria 1A). En lugar de agregar más HBSS, se recomienda el remojo periódico de la sección en un medio cálido y fresco si se necesitan tiempos de imagen más largos. También se recomienda el uso de cámaras de perfusión y pegamento o agarosa de bajo punto de fusión para inmovilizar el tejido cuando se van a realizar experimentos más largos.</li>
	<li>Prepare la etapa del microscopio para imágenes no escaneadas, lo que podría incluir cerrar todas las puertas de la cámara de incubación oscura o cubrir la cámara de incubación con una tela recubierta de poliuretano de nylon negro.</li>
</ol>6. Imágenes
<ol><li>Seleccione el modo de imagen "no descanado" a lo largo de la ruta de transmisión. De esta manera, se optimizará la captura de la débil señal SH de tubulina.</li>
	<li>Seleccione el objetivo LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA.</li>
	<li>Establezca una potencia láser entre 13 mW y 26 mW, con un tiempo de permanencia de píxeles de 12,6 μs. Tome imágenes de no más de 512 píxeles x 512 píxeles, con una velocidad de 5 y un promedio de 2, para un tiempo de adquisición promedio de aproximadamente 15 s. NOTA: El uso de potencias láser más altas y/o tiempos de permanencia más largos puede dañar la muestra (Figura suplementaria 1B).</li>
	<li>Tome imágenes primero con un filtro de paso corto de 485 nm (SP485) y, en un segundo paso, agregue un filtro de paso de banda nítido de 405 nm (BP405; Figura 3). Siga los pasos indicados en el Archivo complementario 2. NOTA: Las imágenes de campo de gran riesgo se pueden tomar a través del mismo detector utilizando la luz láser residual de una línea visible (los láseres de 405 nm o 488 nm funcionan mejor).</li>
</ol>7. Procesamiento del cerebelo
<ol><li>Primero, corte el cerebelo con un bisturí en dos hemisferios y luego péguelos al soporte del vibratomo por la porción media (la parte plana obtenida después del corte).</li>
	<li>Sección e imagen del cerebelo de la misma manera que se describió para el cerebro (secciones de 160 μm, mismos ajustes de vibratomo, misma cuchilla, mismos ajustes de microscopio, etc.). NOTA: Debido a la anatomía del cerebelo, su orientación en el momento de la sección no es crítica; En la mayoría de las rodajas generadas lejos de la superficie, habrá folia seccionada bien en la sustancia blanca.</li>
</ol>

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<li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monoclonal+antibody+against+the+type+II+isotype+of+beta-tubulin.+Preparation+of+isotypically+altered+tubulin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A monoclonal antibody against the type II isotype of beta-tubulin. Preparation of isotypically altered tubulin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 263 (6), 3029-3034 (1988).</li>
<li>Banerjee, A., Roach, M. C., Trcka, P., Luduena, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+monoclonal+antibody+specific+for+the+class+IV+isotype+of+beta-tubulin.+Purification+and+assembly+of+alpha+beta+II%2C+alpha+beta+III%2C+and+alpha+beta+IV+tubulin+dimers+from+bovine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Preparation of a monoclonal antibody specific for the class IV isotype of beta-tubulin. Purification and assembly of alpha beta II, alpha beta III, and alpha beta IV tubulin dimers from bovine brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (8), 5625-5630 (1992).</li>
<li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+%CE%B2v+tubulin+in+the+cochlea+and+cultured+cells+with+a+novel+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Localization of βv tubulin in the cochlea and cultured cells with a novel monoclonal antibody.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 505-514 (2008).</li>
<li>Cross, A. R., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinky+microtubules%3A+Bending+and+breaking+induced+by+fixation+in+vitro+with+glutaraldehyde+and+formaldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Kinky microtubules: Bending and breaking induced by fixation in vitro with glutaraldehyde and formaldehyde.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 20 (4), 272-278 (1991).</li>
<li>Van Steenbergen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+understanding+of+label-free+second+harmonic+imaging+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Molecular understanding of label-free second harmonic imaging of microtubules.</a> Nature Communications. 10 (1), 3530(2019).</li>
<li>Campagnola, P. J., Clark, H. A., Mohler, W. A., Lewis, A., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-harmonic+imaging+microscopy+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Second-harmonic imaging microscopy of living cells.</a> Journal of Biomedical Optics. 6 (3), 277(2001).</li>
<li>Campagnola, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+high-resolution+second-harmonic+generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).</li>
<li>Yu, C. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+microtubule+polarity+in+spindles+with+second-harmonic+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Measuring microtubule polarity in spindles with second-harmonic generation.</a> Biophysical Journal. 106 (8), 1578-1587 (2014).</li>
<li>Bancelin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+microtubules+polarity+in+mitotic+spindles+in+situ+using+Interferometric+Second+Harmonic+Generation+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Probing microtubules polarity in mitotic spindles in situ using Interferometric Second Harmonic Generation Microscopy.</a> Scientific Reports. 7, 6758(2017).</li>
<li>Dombeck, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+polarity+microtubule+assemblies+imaged+in+native+brain+tissue+by+second-harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Uniform polarity microtubule assemblies imaged in native brain tissue by second-harmonic generation microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7081-7086 (2003).</li>
<li>Psilodimitrakopoulos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+effective+orientation+of+the+SHG+source+in+primary+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Estimation of the effective orientation of the SHG source in primary cortical neurons.</a> Optics Express. 17 (16), 14418(2009).</li>
<li>Sharoukhov, D., Bucinca-Cupallari, F., Lim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+imaging+reveals+cytoskeletal+deficit+predisposing+the+retinal+ganglion+cell+axons+to+atrophy+in+DBA%2F2J%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Opthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Microtubule imaging reveals cytoskeletal deficit predisposing the retinal ganglion cell axons to atrophy in DBA/2J.</a> Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (13), 5292(2018).</li>
<li>Alata, M., Piazza, V., Eguibar, J. R., Cortes, C., Hernandez, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H-ABC+tubulinopathy+revealed+by+label-free+second+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">H-ABC tubulinopathy revealed by label-free second harmonic generation microscopy.</a> Scientific Reports. 12, 14417(2022).</li>
<li>Duncan, I. D., Lunn, K. F., Holmgren, B., Urba-Holmgren, R., Brignolo-Holmes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+taiep+rat%3A+A+myelin+mutant+with+an+associated+oligodendrocyte+microtubular+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">The taiep rat: A myelin mutant with an associated oligodendrocyte microtubular defect.</a> Journal of Neurocytology. 21 (12), 870-884 (1992).</li>
<li>Duncan, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+the+Tubb4a+gene+leads+to+microtubule+accumulation+with+hypomyelination+and+demyelination%3A+Tubb4a+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">A mutation in the Tubb4a gene leads to microtubule accumulation with hypomyelination and demyelination: Tubb4a Mutation.</a> Annals of Neurology. 81 (5), 690-702 (2017).</li>
<li>Garduno-Robles, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+features+in+a+rat+model+of+H-ABC+tubulinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">MRI features in a rat model of H-ABC tubulinopathy.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 555(2020).</li>
<li>Lopez-Juarez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+impairment+in+H-ABC+tubulinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Auditory impairment in H-ABC tubulinopathy.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (5), 957-968 (2021).</li>
<li>Alata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+evaluation+of+cerebellar+signs+of+H-ABC+tubulinopathy+in+a+patient+and+in+the+taiep+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Longitudinal evaluation of cerebellar signs of H-ABC tubulinopathy in a patient and in the taiep model.</a> Frontiers in Neurology. 12, 702039(2021).</li>
<li>Parodi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+microscopy%3A+From+fundamentals+to+applications+in+live+bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical microscopy: From fundamentals to applications in live bioimaging.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 585363(2020).</li>
<li>Lefort, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+biomedical+multiphoton+microscopy+and+its+laser+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">A review of biomedical multiphoton microscopy and its laser sources.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (42), 423001(2017).</li>
<li>Campagnola, P. J., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-harmonic+imaging+microscopy+for+visualizing+biomolecular+arrays+in+cells%2C+tissues+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms.</a> Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).</li>
<li>vander Knaap, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+syndrome+characterized+by+hypomyelination+with+atrophy+of+the+basal+ganglia+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Neuroradiology%22%5BJournal%5D)">New syndrome characterized by hypomyelination with atrophy of the basal ganglia and cerebellum.</a> American Journal of Neuroradiology. 23 (9), 1466(2002).</li>
<li>Stoller, P., Kim, B. -M., Rubenchik, A. M., Reiser, K. M., Da Silva, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization-dependent+optical+second-harmonic+imaging+of+a+rat-tail+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Polarization-dependent optical second-harmonic imaging of a rat-tail tendon.</a> Journal of Biomedical Optics. 7 (2), 205(2002).</li>
<li>Brown, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+gene+expression%2C+angiogenesis+and+physiological+function+in+tumors+using+multiphoton+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy.</a> Nature Medicine. 7 (7), 864-868 (2001).</li>
<li>Chakraborti, S., Natarajan, K., Curiel, J., Janke, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+the+tubulin+code%3A+From+the+tubulin+molecule+to+neuronal+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">The emerging role of the tubulin code: From the tubulin molecule to neuronal function and disease.</a> Cytoskeleton. 73 (10), 521-550 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

La microscopía SHG forma parte de un grupo de técnicas ópticas no lineales, que incluyen microscopía de excitación de dos fotones, microscopía de tercera generación armónica y microscopía de dispersión Raman anti-Stokes coherente, que han contribuido a ampliar la gama de aplicaciones de la microscopía óptica convencional a las ciencias de la vida20.
Específicamente, la mayor fortaleza y debilidad de la microscopía SHG se relaciona con la misma condición: el generador de...

La obtención de imágenes ópticas de estructuras citoesqueléticas en tejidos y preparaciones de órganos no es una tarea fácil. Los filamentos citoesqueléticos son ubicuos, por lo que si se realiza una tinción genérica, por ejemplo, contra alfa-tubulina o beta-actina o potencialmente queratina en una muestra epitelial, la señal probablemente se distribuirá de manera bastante homogénea en toda la muestra. Para restringir la tinción a un subconjunto más significativo de componentes celulares, se pueden usar ratones transgénicos con expresión dirigida1 o planear usar anticuerpos específicos de isoforma. Si bien muy pocos de estos últimos están en el mercado (y muy pocos existen en absoluto 2,3,4), un modelo animal transgénico podría estar disponible. Sin embargo, debe ser adquirido por el laboratorio y alojado adecuadamente, con todos los gastos involucrados en el proceso. Ciertos anticuerpos o productos químicos, por ejemplo, fármacos conjugados con fluoróforos como la faloidina o el paclitaxel, pueden ser parcial o totalmente incompatibles con el uso en células o tejidos vivos, lo que limita su aplicabilidad solo a estudios de muestras fijas.
En el caso de la tubulina, se debe tener en cuenta un aspecto adicional, que es la sensibilidad del polímero a la fijación. La fijación química convencional con formaldehído es conocida por no ser adecuada para preservar de manera óptima la integridad de los microtúbulos5. Además, un informe reciente confirma que la reticulación de formaldehído induce cambios sutiles en la ultraestructura del microtúbulo, similar a lo que sucede con la unión de algunos fármacos o moléculas fisiológicas como GTP6.
La visualización directa de microtúbulos en muestras no teñidas y no fijadas es, por lo tanto, a menudo deseable. Para lograr esto, una solución técnica es la microscopía7 de segunda generación armónica (SHG), que se basa en la capacidad de los haces de microtúbulos paralelos para actuar como armonóforos y emitir luz duplicada en frecuencia cuando se iluminan adecuadamente con un láser infrarrojo intenso y pulsado. Aunque se puede generar una segunda señal armónica más fuerte y estable a partir del colágeno y la miosina, que son los únicos otros dos materiales biológicos conocidos por ser capaces de duplicar la frecuencia, la señal de la tubulina se ha utilizado hasta ahora principalmente para estudiar los reordenamientos del huso mitótico 8,9,10 y la morfología de los microtúbulos axonales11,12,13.
En este trabajo, presentamos un uso novedoso de la microscopía SHG como herramienta de diagnóstico para distinguir los tejidos del sistema nervioso central (SNC) afectados por la tubulinopatía por tubulina beta 4 A (TUBB4A) de sus contrapartes sanas14. Algunas de las mutaciones que ocurren en esta isoforma predominantemente neural de tubulina, como las que causan hipomielinización y atrofia de los ganglios basales y cerebelo (H-ABC), inducen el sobrellenado de microtúbulos en los oligodendrocitos15,16; Las alteraciones citoesqueléticas, a su vez, están asociadas con efectos posteriores como la desmielinización, con un profundo deterioro de las vías motoras y sensoriales16,17,18,19. El modelo murino taiep utilizado en este trabajo muestra un contenido anormal de microtúbulos en los oligodendrocitos y recapitula la mayoría de los síntomas sensorio-motores de los pacientes con H-ABC17. El protocolo explica cómo visualizar estructuras como el cuerpo calloso y el cerebelo, que generalmente están altamente mielinizadas y que se ven gravemente afectadas en pacientes humanos, así como en la rata taiep 19, para resaltar las diferencias en las señales de SH entre tejidos sanos y mutantes.

<table><tbody><tr><td>Filtro de paso de banda de banda simple BrightLine(R) de 405/10 nm</td><td>Semrock</td><td>FF01-405/10-25</td><td>32 mm de diámetro, con anillo de carcasa</td></tr><tr><td>Nailon negro, tejido recubierto de poliuretano</td><td>Laboratorios de Thorlabs</td><td>BK5</td><td>5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Espesor&nbsp;</td></tr><tr><td>Cuchillas para vibrátomo</td><td>cualquier comercial; por ejemplo, la espada Wilkinson</td><td></td><td>&nbsp; Cuchillas de afeitar clásicas de acero inoxidable de doble filo</td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular, 35 mm</td><td>cualquier comercial; por ejemplo, Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM710NLO AxioObserver Z1</td><td>Microscopio invertido, el objetivo utilizado es LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA&nbsp;</td></tr><tr><td>Enfriador</td><td>cualquier comercial</td><td></td><td>Cualquier caja aislada de poliestireno podría funcionar, para mantener la muestra a unos 37 °C; C</td></tr><tr><td>Stach de maíz</td><td>por ejemplo, Maizena</td><td></td><td>Del supermercado</td></tr><tr><td>Cubreobjetos #1.5</td><td>cualquier comercial</td><td></td><td>Rectangular</td></tr><tr><td>Pegamento de cianoacrilato</td><td>por ejemplo, Loctite</td><td></td><td>Para pegar el cerebro a la cinta adhesiva</td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11412-11</td><td>Manipular secciones de tejido mediante la manipulación de las meninges</td></tr><tr><td>Tijeras finas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>14370-22</td><td>Para cortar la piel</td></tr><tr><td>Tijeras finas punta curva</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>14061-09</td><td>Para cortar a lo largo de la línea media</td></tr><tr><td>Formaldehído 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>Para diluir 1:10 en PBS</td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>16000-14</td><td>Para cortar el hueso</td></tr><tr><td>Paquetes de gel</td><td>cualquier comercial</td><td></td><td>Precalentado a 37 ° C, para ayudar a mantener la temperatura dentro del enfriador</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur de vidrio, modificada</td><td>cualquier comercial</td><td></td><td>Para transferir la sección de tejido</td></tr><tr><td>Hanks&prime; Solución salina equilibrada (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-076</td><td>Se puede preparar a partir de polvos</td></tr><tr><td>Hemostáticos de Kelly</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>13018-14</td><td>Para separar el hueso&nbsp;</td></tr><tr><td>Cinta adhesiva</td><td>cualquier comercial</td><td></td><td>Para proteger la superficie de la placa de la muestra</td></tr><tr><td>Módulo NDD, tipo C</td><td>Zeiss</td><td>000000-1410-101</td><td>Para detectar la señal, reduciendo la pérdida de luz. Alojamiento del juego de filtros 000000-1935-163 con el SP485</td></tr><tr><td>Alicates para huesos desplazados</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>16101-10</td><td>Para cortar el hueso</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td>Se puede preparar a partir de polvos o tabletas</td></tr><tr><td>Láser pulsado</td><td>Coherente</td><td>Visión camaleónica II</td><td>680&ndash; Láser sintonizable de 1080 nm</td></tr><tr><td>Escalpelo</td><td>cualquier comercial</td><td></td><td>Hoja recta con punta afilada</td></tr><tr><td>Pinzas de patrón estándar</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11000-18</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Vannas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>15018-10</td><td>Para cortar las meninges que quedan unidas tanto a la rodaja obtenida del corte de vibrátomo como a la sección pegada a la placa de la muestra.</td></tr><tr><td>Vibrátomo</td><td>cualquier comercial; por ejemplo, Leica</td><td>VT1200</td><td></td></tr></tbody></table>

Óptica no lineal sin etiquetas para el estudio de defectos dependientes de tubulina en mielina central

Label-Free Non-Linear Optics for the Study of Tubulin-Dependent Defects in Central Myelin

La visualización satisfactoria de los componentes citoesqueléticos en el cerebro es un desafío. La distribución ubicua de las redes de microtúbulos, microfilamentos y filamentos intermedios en todos los tejidos neurales, junto con la variabilidad en los resultados de las estrategias de fusión de proteínas fluorescentes y su aplicabilidad limitada a estudios dinámicos de anticuerpos y fármacos como vehículos cromóforos, hacen que los enfoques ópticos clásicos no sean tan efectivos como para otras proteínas. Cuando la tubulina necesita ser estudiada, la generación sin etiqueta de segundos armónicos es una opción muy adecuada debido a la organización no centrosimétrica de la molécula. Esta técnica, cuando se conjuga con microscopía, puede describir cualitativamente la distribución volumétrica de haces paralelos de microtúbulos en muestras biológicas, con la ventaja adicional de trabajar con tejidos frescos que no están fijados ni permeabilizados. Este trabajo describe cómo obtener imágenes de la tubulina con una configuración comercial de microscopía de segunda generación armónica para resaltar los microtúbulos en las estructuras enriquecidas con tubulina de los oligodendrocitos, como en la hipomielinización con atrofia de los ganglios basales y la tubulinopatía del cerebelo (H-ABC), un trastorno de mielina descrito recientemente.

Las imágenes obtenidas con esta metodología tienen un nivel de fondo intrínsecamente bajo debido al número muy limitado de armonóforos presentes en los tejidos biológicos, que es una de las ventajas significativas del método.
Cuando se obtienen imágenes de las fibras del cuerpo calloso, se pueden encontrar consistentemente estructuras cortas similares a fibras y elementos redondeados en el cerebro taiep (Figura 3B), mientras que el cuerpo calloso del cerebro control muestra una señal ...

En este artículo, presentamos un protocolo para detectar oligodendrocitos cargados de microtúbulos en un modelo de tubulinopatía a través de un enfoque simple e innovador de microscopía de segunda generación armónica.

The satisfactory visualization of cytoskeletal components in the brain is challenging. The ubiquitous distribution of the networks of microtubules, ...

La imagen de segunda generación armónica de muestras biológicas es una técnica óptica que permite la visualización de moléculas no centrosimétricas y sus ensamblajes sin necesidad de una etiqueta o un tinte. Las imágenes generadas con este método tienen bajo fondo ya que muy pocas moléculas biológicas podrían actuar como una fuerza harmona. Este protocolo describe la aplicación de la técnica para el diagnóstico por imágenes de Tubulina beta-4A en el modelo animal taiep.Las tubulinopatías son enfermedades descritas recientemente. Por esta razón, se dispone de una cantidad limitada de información sobre los mecanismos básicos que subyacen a la fisiopatología a nivel celular. Para comenzar, encienda el láser de pulso para asegurarse de que estará listo para lase a un nivel de potencia óptimo y constante.Para estudiar los microtúbulos tisulares se utiliza del 10 al 20% de la potencia láser disponible, que en el sistema descrito corresponde a 13 a 26 milivatios medidos en el plano focal posterior del objetivo. Antes de la obtención de imágenes, gire el láser a 810 nanómetros. Luego, asegúrese de que el microscopio esté alineado con Koehler con el objetivo utilizado para la segunda generación armónica, o imágenes SHG.Retire los filtros no deseados de la ruta de detección óptica y asegúrese de que el diafragma del condensador esté completamente abierto y que no se detenga la luz innecesariamente. Prepare un objetivo de inmersión en aceite de apertura numérica de 25x por 0.8 con una pequeña gota de aceite de inmersión en la lente. Siguiendo los pasos indicados en la tabla aquí, excepto para la potencia del láser que es inferior al 5% para el almidón de maíz.Imagen de almidón de maíz seco intercalado entre diapositivas de vidrio. con parámetros SHG para generar imágenes SHG, revelan la dirección de polarización del láser. Capture una imagen de granos de almidón de maíz dispersos y marque la orientación de los lóbulos SHG en el plano XY correspondiente a la orientación de polarización del láser.Para el control, tome otra imagen de la misma muestra insertando una placa de media onda en la trayectoria óptica para alterar la dirección de oscilación del láser. La imagen resultante muestra lóbulos de señal SHG girados. Si utiliza un filtro de paso de banda diferente para el SHG, asegúrese de que tenga propiedades de transmisión óptimas comparando las imágenes y las intensidades de la señal píxel por píxel a lo largo de la línea de escaneo.Prepare una bandeja tampón de vibratomo llena con una solución salina caliente de Hanks'Balanced o HBSS. Fije el cerebro a la placa de la muestra usando pegamento de cianoacrilato a través de un trozo de cinta adhesiva. La porción más caudal entra en contacto con el pegamento para que se puedan cortar las secciones coronales utilizables de la porción rostral opuesta.Transfiera la placa de la muestra a su soporte magnético dentro de la bandeja intermedia. Comience a cortar secciones de 300 a 500 micras hasta que las rebanadas abarquen toda la superficie del cerebro. Luego reduzca el grosor de la sección a 160 micras.Una vez cortada una sección de 160 micras a nivel del cuerpo calloso, recuperarla con una pipeta Pasteur de vidrio modificada con un orificio bridado grande. Transfiera la sección a una placa de Petri limpia con HBSS nuevo caliente o directamente sobre el cubrebocas o el plato con fondo de vidrio para microscopía. Coloque la muestra bajo el microscopio y colóquela adecuadamente debajo del objetivo mediante observación directa a través de los oculares con luz transmitida.Retire el exceso de HBSS para que una película líquida delgada cubra toda la muestra. Revise visualmente la película líquida cada pocos minutos para evitar la evaporación excesiva y el secado de la muestra. Prepare la etapa del microscopio para imágenes no escaneadas, lo que incluye cerrar todas las puertas de la cámara de incubación oscura o cubrir la cámara de incubación con una tela recubierta de poliuretano de nylon negro.Seleccione el modo de imagen no escaneado a lo largo de la ruta de transmisión. De esta manera, se optimizará la captura de la débil señal SH de tubulina. A continuación, seleccione el objetivo.A continuación, configure una potencia láser con un tiempo de permanencia de píxeles de 12,6 microsegundos. Tome imágenes de no más de 512 por 512 píxeles con una velocidad de cinco y un promedio de dos para un tiempo de adquisición promedio de 15 segundos. Capture imágenes primero con un filtro de paso corto de 485 nanómetros y, en un segundo paso, agregue un filtro de paso de banda nítido de 405 nanómetros.Corte el cerebelo con un bisturí en dos hemisferios y fíjelos al soporte del vibratomo por la porción media. Secciona e imagen del cerebelo usando los mismos ajustes de vibratoma, cuchilla y microscopio que se describen para el cerebro. Cuando se obtienen imágenes de las fibras del cuerpo calloso, se observan estructuras cortas similares a fibras y elementos redondeados en el cerebro taiep.En contraste, el cuerpo calloso del cerebro de control muestra una señal mucho más heterogénea e isotrópica en toda la región del cerebro. El origen de la señal diferencial se encuentra específicamente en el fenómeno de segunda generación armónica, ya que agregar el filtro de paso de banda estrecho solo disminuye la intensidad de la señal no específica de las imágenes de control, mientras que elimina selectivamente esta señal difusa baja alrededor del soma y las estructuras alargadas cortas en las imágenes taiep que siempre generan luz SH intensa. En el tejido de control de la sustancia blanca cerebelosa, se observó la ausencia completa de señal DAI.Las células de Purkinje son apenas visibles cuando se usa el filtro de paso corto, y las estructuras alargadas y redondeadas persisten en la imagen SH del tejido taiep. Un paso crítico para obtener la mejor imagen es cortar secciones de tejido lo más delgadas posible. Además, trabajar con secciones de tejido agudo requiere protocolos rápidos para prevenir el deterioro del tejido.Por lo tanto, es crucial configurar y verificar el sistema óptico de antemano. La señal de segundo armónico de los microtúbulos es más débil que la señal de segundo armónico del almidón. Por lo tanto, se debe usar más potencia láser para obtener imágenes de los microtúbulos.La potencia del láser debe aumentarse con cuidado porque, como se utiliza un objetivo de apertura numérica alta para la obtención de imágenes, la intensidad en la muestra aumentaría rápidamente Con las imágenes de segunda generación armónica, los cambios patológicos en la mielinómica central del modelo tubulinopático se identifican rápida y fácilmente. Las aplicaciones potenciales de esta técnica incluyen su uso para el estudio de los mecanismos básicos de la tubulinopatía H-ABC y para la evaluación de terapias farmacológicas para tratar a los pacientes. A largo plazo, la técnica tiene el potencial de convertirse en una herramienta de diagnóstico complementaria para ser utilizada intracranealmente o en biopsias frescas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En este video, describimos la técnica de microscopía de reflexión de interferencia (IRM) para visualizar microtúbulos que crecen en una superficie de cubreobjetos en presencia de un tampón adecuado. Al iluminarse con luz incidente, la interfaz cubreobjetos-tampón y la interfaz tampón-microtúbulos reflejan la luz, lo que se combina para crear un patrón de interferencia, lo que permite la visualización de los microtúbulos como imágenes de alto contraste sobre un fondo brillante.

Microscopía de reflexión de interferencias para la visualización sin etiquetas de la dinámica de los microtúbulos

Fuente: Piazza, V., et al., Óptica no lineal sin etiquetas para el estudio de defectos dependientes de tubulina en la mielina central. J. Vis. Exp. (2023)Este video demuestra el procedimiento para obtener imágenes de anomalías de microtúbulos en un corte de tejido cerebral de rata utilizando un microscopio de excitación de dos fotones. Emplea señales de generación de segundos armónicos (SHG) para detectar defectos de tubulina y reducir la producción de mielina.

Imágenes de segunda generación de armónicos en un modelo de rata para estudiar defectos de tubulina

Presentamos un protocolo que utiliza microscopía de lapso de tiempo de excitación de dos fotones para visualizar simultáneamente la dinámica de las lesiones de axones y mielinas en tiempo real. Este protocolo propuesto permite estudiar los factores intrínsecos y extrínsecos que pueden influir en el destino de los axones mielinizados centrales después de una lesión y contribuir a la discapacidad clínica permanente.

Una Ex Vivo Médula espinal inducida por láser Lesiones modelo para evaluar los mecanismos de degeneración axonal en tiempo real

Inmunomarcación para analizar poblaciones distintas de los microtúbulos en el cerebro en desarrollo del pez cebra se describen los métodos, que son ampliamente aplicables a otros tejidos. El primer protocolo describe un método optimizado de inmunomarcación microtúbulos estables y dinámicos. El segundo protocolo proporciona un método para la imagen y cuantificar nacientes microtúbulos específicamente.

Uso de inmunomarcación para analizar microtúbulos estables, dinámicos y emergente en el embrión de pez cebra

Aquí, presentamos un protocolo paso a paso de axones myelinated en un trozo de cerebro fija usando una nanoescala libre etiqueta técnica basado en reflectometría spectral de la proyección de imagen de la proyección de imagen.

Microscopía espectral reflectométrico en axones mielinizados en Situ

Aquí presentamos un método robusto y detallado de análisis de dinámica de microtúbulos en células sincronizadas en prometiafase utilizando microscopía confocal de disco giratorio de células vivas y procesamiento de imágenes basado en MATLAB.

Medición de microtúbulos dinámicos mediante microscopía de disco giratorio en husillos mitoticos Monopolar

Se ha presentado un protocolo para la obtención de imágenes de los microtúbulos dinámicos in vivo utilizando la proteína de unión al extremo etiquetada fluorescentemente. Describimos los métodos para etiquetar, obtener imágenes y analizar los microtúbulos dinámicos en la neurona del microtúbulo lateral posterior (PLM) de C. elegans.

In vivo Evaluación de la dinámica y orientación de los microtúbulos en las neuronas caenorhabditis elegans

Este protocolo está dedicado a la visualización de microtúbulos plus-end mediante transfección de proteínas EB3 para estudiar sus propiedades dinámicas en cultivo celular primario. El protocolo se implementó en fibroblastos primarios de piel humana obtenidos de pacientes con enfermedad de Huntington.

Visualización dinámica de microtúbulos plus-end en el modelo de la enfermedad de Huntington basado en fibroblastos primarios de piel humana

Aquí, se presenta un ensayo de reconstitución in vitro basado en microscopía TIRF para cuantificar y comparar simultáneamente la dinámica de dos poblaciones de microtúbulos. Se describe un método para ver simultáneamente la actividad colectiva de múltiples proteínas asociadas a microtúbulos en haces de microtúbulos reticulados y microtúbulos individuales.

Visualización simultánea de la dinámica de microtúbulos reticulados y únicos in vitro mediante microscopía TIRF

Aquí, presentamos un protocolo para reconstituir haces de microtúbulos in vitro y cuantificar directamente las fuerzas ejercidas dentro de ellos utilizando trampeo óptico simultáneo y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Este ensayo permite la medición a nivel nanométrico de las fuerzas y desplazamientos generados por los conjuntos de proteínas dentro de las redes de microtúbulos activos.

Medición directa de las fuerzas dentro de haces de microtúbulos activos reconstituidos

Este artículo presenta un protocolo para la formación de conjuntos de microtúbulos en forma de tactoides utilizando MAP65, un reticulante de microtúbulos a base de plantas, y PEG como agente de apiñamiento.

Autoensamblaje de tactoides de microtúbulos

Aprende a detectar oligodendrocitos con microtúbulos mediante microscopía de generación de segundo armónico en modelos de tubulinopatía. Este método avanza el estudio de la dinámica microtubular en enfermedades neurológicas.

Óptica no lineal sin etiquetas para el estudio de defectos dependientes de tubulina en mielina central

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