Name: Uso de un espectrómetro de movilidad de iones cíclicos para experimentos de movilidad de iones en tándem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprende a realizar espectrometría de movilidad de iones en tándem para discriminar isómeros y clasificar glicanos en grupos estructurales. Este método complementa la espectrometría de masas en análisis biomolecular.

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S.O. agradece a la Agencia Nacional de Investigación de Francia la financiación de su doctorado (beca ANR-18-CE29-0006).

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

El SELECT SERIES Cyclic IMS es una poderosa herramienta que permite seleccionar una población iónica definida, de una movilidad m/z e iónica dada, sin necesidad de separación cromatográfica aguas arriba. El instrumento ofrece la posibilidad de generar un mapa de fragmentación bidimensional de esta población iónica, del que se pueden extraer los espectros MS/MS e IMS/IMS. Sin embargo, el usuario debe tener en cuenta varios puntos críticos que requieren atención durante el proceso experimental.
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La caracterización química completa de las biomoléculas es clave para comprender sus propiedades biológicas y funcionales subyacentes. Con este fin, las ciencias "ómicas" se han desarrollado en los últimos años, con el objetivo de la caracterización a gran escala de estructuras químicas en concentraciones biológicas. En proteómica y metabolómica, la EM se ha convertido en una herramienta central para desentrañar la heterogeneidad estructural que se encuentra en los medios biológicos, especialmente gracias a su sensibilidad y capacidad para proporcionar información estructural a través de la EM en tándem (EM / EM). En las estrategias de EM/EM, un ion se selecciona de acuerdo con su masa, luego se fragmenta y, finalmente, se adquieren las masas de sus fragmentos para establecer una huella digital de la molécula. Los espectros MS/MS pueden, en particular, utilizarse para hacer coincidir bases de datos espectrales1,2, o reconstruir tentativamente las estructuras madre3,4. Bajo el supuesto de que espectros similares pertenecen a compuestos similares, los datos de MS/MS también se pueden utilizar para construir redes moleculares (MNs) que conecten especies relacionadas a través de una puntuación de similitud5,6.
Sin embargo, debido a la propiedad inherente de la EM de detectar la relación masa-carga (m/z) de los iones, la técnica es ciega a una serie de características estructurales que caen dentro del rango del (estereo)isomerismo. Por ejemplo, los carbohidratos están hechos de varias subunidades de monosacáridos, muchas de las cuales son estereoisómeros o incluso epímeros (por ejemplo, Glc vs. Gal o Glc vs. Man). Estas subunidades están unidas por enlaces glicosídicos, que pueden diferir por la posición del enlace (regioisomerismo) y la configuración estérica del carbono anomérico (anomerismo). Estas características dificultan que la EM independiente distinga entre isómeros de carbohidratos7, y solo el regioisomerismo puede abordarse utilizando métodos de activación de alta energía8,9,10. Aunque la derivatización es una opción para interrumpir la equivalencia de los grupos estereoisoméricos11, requiere una extensa preparación de la muestra. Otra opción más sencilla es acoplar la EM con una dimensión analítica sensible al isomerismo, como la IMS.
Debido a que este protocolo está diseñado para usuarios que ya están familiarizados con los conceptos básicos de IMS, y debido a que las revisiones detalladas están disponibles en otros lugares12,13, solo se ofrece aquí una breve descripción de los principios de IMS. IMS es un método de separación en fase gaseosa que se basa en la interacción de iones con un gas tampón y un campo eléctrico, separando en última instancia los iones de acuerdo con sus conformaciones en fase gaseosa. Se pueden encontrar diferentes principios de IMS acoplados a MS en instrumentos comerciales: algunos operan en campos eléctricos altos y bajos alternantes (IMS asimétrico de campo, FAIMS), mientras que la mayoría opera dentro del límite de campo bajo, especialmente IMS de tubo de deriva (DTIMS, campo eléctrico linealmente decreciente), IMS de onda viajera (TWIMS, ondas de potencial simétricas) e IMS atrapado (TIMS, alto flujo de iones de captura de gas amortiguador contra campos eléctricos)13 . Los métodos de campo bajo permiten el acceso a un llamado CCS, una propiedad del par ion-gas que representa la superficie (en Å2 o nm2) del ion que interactúa con el gas tampón durante la separación. La CAC es teóricamente independiente del instrumento y, por lo tanto, es útil para generar datos que pueden reproducirse entre diferentes laboratorios14. Las separaciones de movilidad iónica pueden verse afectadas por varios parámetros y, en particular, por las fluctuaciones de la presión del gas y la temperatura del gas en la celda de movilidad. La calibración CCS es una forma de remediar esto, ya que tanto el calibrante como las especies de interés se verán afectados de manera similar13. Sin embargo, es obligatorio instalar el instrumento en una habitación con temperatura controlada y tener un sistema de control de presión de gas confiable.
Una evolución interesante de IMS es IMS/IMS, que fue introducido por primera vez en 2006 por el grupo de Clemmer como un análogo de MS/MS15,16. En IMS/IMS, un ion de interés se aísla selectivamente en función de su movilidad iónica; luego se activa (hasta una posible fragmentación), y se realiza un nuevo análisis IMS del ion o fragmentos activados. En el primer diseño instrumental, se colocaron dos células IMS en serie, separadas por un embudo iónico donde se encontraba la activación. Desde entonces, aunque se propusieron varias configuraciones IMS / IMS (para una revisión, consulte Eldrid y Thalassinos17), el primer espectrómetro de masas comercial con capacidad IMS / IMS solo estuvo disponible en 201918. Este instrumento mejoró sustancialmente el concepto inicial combinándolo con otro avance tecnológico: un diseño cíclico de la célula IMS.
La célula IMS cíclica teóricamente permite aumentar casi infinitamente la longitud de la trayectoria de deriva y, por lo tanto, el poder de resolución del instrumento19. Esto se logró por medio de una geometría de instrumento particular, donde la celda cíclica TWIMS se coloca ortogonalmente al eje óptico iónico principal. Una región de matriz multifunción en la entrada de la celda IMS permite controlar la dirección de la ruta iónica: (i) enviar iones hacia los lados para la separación IMS, (ii) hacia adelante para la detección de MS, o (iii) hacia atrás desde la celda IMS para ser almacenada en una celda de prearray. A partir de esta célula de almacenamiento previo al inicio, se pueden activar los iones y reinyectar los fragmentos en la célula IMS para la medición de la movilidad iónica, un enfoque que se ha utilizado con éxito para caracterizar estereoisómeros20. En última instancia, los datos recopilados contienen movilidad iónica e información m/z para el precursor y sus fragmentos.
En una publicación reciente que utilizó este diseño cíclico para análisis de glicanos (Ollivier et al.21), demostramos que el perfil de movilidad de los fragmentos contenidos en dichos datos IMS/IMS actúa como una huella dactilar de una biomolécula que puede ser utilizada en una estrategia de redes moleculares. La red resultante, llamada IM-MN, condujo a la organización de conjuntos de datos glucómicos de una manera estructuralmente relevante, mientras que la red construida únicamente a partir de datos de MS / MS (MS-MN) reveló poca información. Para complementar esta publicación y ayudar a los usuarios de Cyclic IMS a implementar este flujo de trabajo, este protocolo proporciona una descripción completa del protocolo utilizado para recopilar los datos. Este protocolo se centra únicamente en la generación de los datos IMS/IMS que los usuarios pueden utilizar para construir redes IM-MN (véase 21), o para cualquier otra aplicación de su elección. La construcción de IM-MN no se considerará en este documento, ya que los protocolos para redes moleculares ya están disponibles22. Se destacan los puntos cruciales que deben seguirse para generar adquisiciones IMS/IMS valiosas y reproducibles. Tomando el ejemplo de uno de los oligosacáridos estudiados por Ollivier et al. 21, se detallan los siguientes pasos: (i) preparación de la muestra, (ii) ajuste del instrumento Cyclic IMS, (iii) selección automática de picos de los datos y (iv) calibración CCS.

<table><tbody><tr><td>Mezcla de 33-&alfa;-L- más 23-&alfa;-L-Arabinofuranosil-xilotetraosa (XA3XX/XA2XX)</td><td>Megazyme Ltd., Wicklow, Irlanda</td><td>O-XAXXMIX</td><td>XA2XX + XA3XX mezcla</td></tr><tr><td>33-&alpha;-L-Arabinofuranosil-xilotetraosa (XA3XX)</td><td>Megazyme Ltd., Wicklow, Irlanda</td><td>O-XA3XX</td><td>XA3XX puro estándar</td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mL, Calidad Eppendorf, incoloros, 1.000 tubos</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemania</td><td>0030120086</td><td>Se utiliza para preparar la solución madre de carbohidratos y la dilución</td></tr><tr><td>FALCON 50 mL Tubo cónico de polipropileno 30 x 115 mm</td><td>Corning Science M&eacute; xico S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, México</td><td>352070</td><td>Se utiliza para preparar la solución madre acuosa de cloruro de litio LiCl 100 mM</td></tr><tr><td>(reactivo ACS, &ge; 99 %)</td><td>Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, Francia</td><td>310468</td><td>Se utiliza para dopar la muestra con litio</td></tr><tr><td>Major Mix IMS/Tof Calibration Kit Waters</td><td>Corp., Wilmslow, Reino Unido</td><td>186008113</td><td>Solución de calibración para MS e IMS</td></tr><tr><td>MassLynx 4.2 SCN1016 Release 6 (Waters Embedded Analyser Platform for Cyclic IMS 2.9.1 Release 9)</td><td>Waters Corp., Wilmslow, Reino Unido</td><td>721022377</td><td>Software de proveedor de IMS cíclico para el control de instrumentos y el procesamiento de datos</td></tr><tr><td>Metanol para HPLC PLUS Grado de gradiente</td><td>Reactivos Carlo-Erba, Val de Reuil, Francia</td><td>412383</td><td>Disolvente de alta pureza</td></tr><tr><td>MS Leucina Encefalina Kit</td><td>Waters Corp., Wilmslow, Reino Unido</td><td>700002456</td><td>Compuesto de referencia utilizado para la puesta a punto del espectrómetro de masas</td></tr><tr><td>SCHOTT DURAN Botella de vidrio de borosilicato de 100 ml</td><td>VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pensilvania, US 218012458</td><td></td><td>Se utiliza para preparar la solución de 500 &micro; M LiCl en 50:50 MeOH/Agua</td></tr><tr><td>SELECCIONAR SERIE Cíclico IMS</td><td>Waters Corp., Wilmslow, Reino Unido</td><td>186009432</td><td>Espectrómetro de masas de movilidad iónica equipado con una célula IMS cílica</td></tr><tr><td>Sitio web: http://mzmine.github.io/</td> <td>MZmine Development</td> <td>Team-Enlace</td> <td>para descargar el software MZmine</td></tr><tr><td>Sitio web:</td><td>https://github.com/siollivier/IM-MN INRAE, UR BIA, BIBS Facility, Nantes, Francia</td><td>-</td><td>Enlace a un script de R interno que contiene una función de calibración CCS</td></tr></tbody></table>

uso de un espectrómetro de movilidad de iones cíclicos para experimentos de movilidad de iones en tándem

Using a Cyclic Ion Mobility Spectrometer for Tandem Ion Mobility Experiments

La caracterización precisa de las estructuras químicas es importante para comprender sus mecanismos biológicos subyacentes y propiedades funcionales. La espectrometría de masas (EM) es una herramienta popular, pero no siempre es suficiente para revelar completamente todas las características estructurales. Por ejemplo, aunque los carbohidratos son biológicamente relevantes, su caracterización se complica por numerosos niveles de isomerismo. La espectrometría de movilidad iónica (SGI) es un complemento interesante porque es sensible a las conformaciones iónicas y, por lo tanto, al isomerismo. 
Además, los avances recientes han mejorado significativamente la técnica: la última generación de instrumentos IMS cíclicos ofrece capacidades adicionales en comparación con los instrumentos IMS lineales, como un mayor poder de resolución o la posibilidad de realizar experimentos de movilidad iónica en tándem (IMS / IMS). Durante IMS/IMS, un ion se selecciona en función de su movilidad iónica, fragmentado y reanalizado para obtener información sobre la movilidad iónica sobre sus fragmentos. Trabajos recientes mostraron que los perfiles de movilidad de los fragmentos contenidos en dichos datos IMS / IMS pueden actuar como una huella digital de un glicano en particular y pueden usarse en una estrategia de redes moleculares para organizar conjuntos de datos glucómicos de una manera estructuralmente relevante. 
El objetivo de este protocolo es, por lo tanto, describir cómo generar datos IMS / IMS, desde la preparación de la muestra hasta la calibración final de la sección transversal de colisión (CCS) de la dimensión de movilidad iónica que produce espectros reproducibles. Tomando el ejemplo de un glicano representativo, este protocolo mostrará cómo construir una secuencia de control IMS / IMS en un instrumento IMS cíclico, cómo contabilizar esta secuencia de control para traducir el tiempo de llegada de IMS en tiempo de deriva (es decir, el tiempo de separación efectivo aplicado a los iones) y cómo extraer la información de movilidad relevante de los datos sin procesar. Este protocolo está diseñado para explicar claramente los puntos críticos de un experimento IMS/IMS y, por lo tanto, ayudar a los nuevos usuarios de IMS cíclico a realizar adquisiciones sencillas y reproducibles.

Se eligió un pentasacárido arabinoxilano, XA2XX, como ejemplo para ilustrar este protocolo. Este compuesto está disponible comercialmente, pero solo como mezcla con otro pentasacárido arabinoxilano, XA3XX (XA3XX puro también está disponible comercialmente). Las estructuras de XA2XX y XA3XX se dan en la Figura Suplementaria S1. Como la proporción de XA2XX y XA3XX en la mezcla comercial es de ~50:50, se preparó una solución a 20 μ...

La espectrometría de movilidad iónica (SGI) es un complemento interesante de la espectrometría de masas para la caracterización de biomoléculas, en particular porque es sensible al isomerismo. Este protocolo describe un experimento en tándem IMS (IMS/IMS), que permite el aislamiento de una molécula y la generación de los perfiles de movilidad de sus fragmentos.

Uso de un espectrómetro de movilidad de iones cíclicos para experimentos de movilidad de iones en tándem

Accurate characterization of chemical structures is important to understand their underlying biological mechanisms and functional properties. Mass ...

El protocolo describe cómo registrar un perfil de movilidad iónica para los fragmentos producidos tras la activación de una molécula en el espectrómetro de masas, y discriminar entre estructuras isoméricas. El protocolo permite clasificar los glicanos en 11 grupos con respecto a algunas de sus características estructurales clave, y así proporcionar una información que de otro modo sería difícil de obtener. Puede servir para construir redes moleculares extremadamente genéricas y adecuadas para muchas familias moleculares, como metabolitos o fármacos de interés en muchas áreas de investigación.El enfoque aprovecha al máximo un nuevo concepto en espectrometría de movilidad iónica, y será útil cuando la espectrometría de masas por sí sola no discrimine entre dos estructuras. El experimento requiere un buen dominio de la espectrometría de masas y la movilidad iónica. Sin embargo, el experimentador debe tener éxito en la implementación del método si uno sigue cuidadosamente cada uno de los pasos.Demostrando el procedimiento estará Simon Ollivier, un estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para comenzar, configure una secuencia IMS de una sola pasada desde la página Sintonizar, coloque el instrumento en modo Movilidad y abra la ventana Control de secuencia cíclica. Seleccione Modo avanzado en la pestaña Funciones cíclicas de esta nueva ventana, seleccione Agregar paquete y, a continuación, Single/Multipass.Espere a que aparezca una secuencia de eventos de movilidad en la pestaña Secuencia de la misma ventana. Adapte la secuencia para que todos los iones calibrantes hagan una sola pasada alrededor de la pista de carreras cíclica IMS. No cambie el tiempo de inyección o el tiempo de expulsión y adquisición, sin embargo, reduzca el tiempo de separación a un milisegundo.Si algunos iones de la mezcla de calibración no caben en la ventana de tiempo de llegada mostrada, cambie la sincronización del IMS con el pulsador del analizador TOF de aceleración ortogonal aumentando el número de pulsaciones por contenedor en la pestaña Configuración de ADC. Para grabar una adquisición de dos minutos en la ventana Control de secuencia cíclica, haga clic en Adquirir para abrir la ventana emergente Configuración de adquisición, introduzca el nombre de archivo, la descripción y la duración de la adquisición, minutos y haga clic en Guardar. Cambie el instrumento al modo TOF desde la página MS Tune para comprobar la estabilidad de la señal.Registre una adquisición completa de la muestra de EM durante un minuto, lo que será útil para verificar el patrón isotópico y la presencia de contaminantes potenciales. Coloque el instrumento en modo MSMS desde la pestaña perfil Quad/MS de la página principal de Tune. Seleccione la masa del hierro objetivo en el campo de masa MSMS para el aislamiento en el cuadrupolo.Registre una adquisición de un minuto para comprobar el aislamiento del precursor al procesar los datos. Para realizar una selección basada en la movilidad del isómero de interés, cambie el instrumento al modo Movilidad en la ventana Control de secuencia cíclica, en la ficha Funciones cíclicas, seleccione Agregar paquete y, a continuación, Segmentación. Espere a que aparezca una secuencia compleja de eventos de movilidad en la ficha Secuencia.Coloque el evento Expulsar y adquirir justo después del primer evento Independiente y, a continuación, haga clic en Ejecutar. Busque los resultados de la separación inicial para que se muestren en tiempo real. Aumente la duración del primer evento Separado para una separación multipaso cambiando el valor de tiempo para este evento en la secuencia hasta que la resolución de los picos IMS sea satisfactoria.Registre una adquisición de un minuto como referencia. Haga clic en Pausar, coloque el evento Expulsar y adquirir debajo de los eventos Expulsar, Expulsar a pretienda y Mantener y expulsar. Ajuste la duración de los eventos para que el pico objetivo esté en la región Expulsar a Pre-Almacenar, y cualquier otro ion esté en la región Expulsar o Mantener y expulsar.Coloque el evento Expulsar y Adquirir al final de la secuencia debajo de los eventos Reinyect from Pre-Store y el segundo Eventos separados. Haga clic en Ejecutar para mostrar la población seleccionada. Compruebe la calidad del aislamiento.Registre una adquisición de un minuto como referencia. En la pestaña Secuencia, en la columna situada junto a los tiempos de eventos definidos por el usuario, busque los tiempos resumidos de todos los eventos. Tome nota de los Abdominales de tiempo que se encuentran en la línea del evento Reinject from Pre-Store para realizar la calibración CCS.Establezca la duración del evento Separado que procede directamente a expulsar y adquirir en un milisegundo. En la línea Reinyectar desde Pre-Store, marque la casilla Habilitar activación y optimice la fragmentación con el control integrado. Si la fragmentación no es satisfactoria con el control incorporado, desmarque la casilla Habilitar activación y proceda a optimizar manualmente los voltajes de reinyección, aumente el gradiente previo a la matriz y reduzca el voltaje de desplazamiento de la matriz hasta que los resultados sean satisfactorios.Para registrar una adquisición de dos minutos en la ventana emergente Adquisición, marque la opción Retener tiempo de deriva para generar un archivo que contenga solo los tiempos de llegada, en lugar de M sobre Z etiquetado como _dt.raw. Después de realizar el análisis de EM de la mezcla de pentasacáridos arabinoxilano, el espectro mostró un patrón isotópico con un solo pico en M sobre Z 685.24, lo que sugiere que los dos compuestos son de naturaleza isomérica. Los aductos de los pentasacáridos se separaron a través de la célula cíclica IMS, y tres picos se separaron con diferentes tiempos de llegada.El XA3XX puro muestra los picos en 83 y 90 milisegundos, mientras que el XA2XX exhibe un pico en 94 milisegundos. Después de la primera etapa de separación de IMS, se expulsaron iones pertenecientes a XA3XX, y se seleccionó el pico a 94 milisegundos para el análisis IMS-IMS. Se realizó una separación de tres pasadas después de volver a inyectar el ion sin activación, y se obtuvo un pico para XA2XX a 199 milisegundos.Los datos IMS-IMS MS generados se descontorlicaron utilizando la hora de llegada y las dimensiones M sobre Z, generando los espectros IMS-IMS. Los picos por encima del 0,2% de intensidad relativa se exportaron para la calibración de CCS, lo que resultó en un espectro IMS-IMS calibrado por CCS-IMS centrado. Siempre es importante verificar el aislamiento del ion precursor, de lo contrario, el espectro puede provenir de una mezcla del compuesto de interés y los contaminantes.Anteriormente utilizamos espectros IMS-IMS para construir redes y clasificar compuestos, pero también podrían usarse para buscar en bases de datos identificaciones de compuestos. Esta técnica es muy reciente, pero esperamos que sea extremadamente útil en glucómica, así como en cualquier contexto donde los analistas se enfrenten a moléculas isoméricas.

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Investigación

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Química

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