Un enfoque in vitro para estudiar la disfunción mitocondrial: un modelo cibrido
9 de marzo de 2022
Los cibridos transmitocondiales son células híbridas obtenidas mediante la fusión de células agotadas de ADN mitocondrial (ADNmt) (células rho0 ) con citólogos (células enucleadas) derivadas de pacientes afectados por trastornos mitocondriales. Permiten la determinación del origen nuclear o mitocondrial de la enfermedad, la evaluación de la actividad bioquímica y la confirmación del papel patogénico de las variantes relacionadas con el ADNmt.
La generación cibernética sigue siendo el protocolo de vanguardia para comprender el papel patógeno de cualquier nueva mutación del ADN mitocondrial y correlacionar el porcentaje de atriplasmia con la gravedad de la enfermedad. Esta técnica permite realizar investigación bioquímica en un sistema nuclear homogéneo, en el que la aportación del fondo nuclear del paciente está ausente. Esta técnica permite validar la patogenicidad de una mutación del ADN mitocondrial.
y permite estudiar su impacto a nivel bioquímico Lavar los platos de 35 milímetros que contienen los fibroblastos dos veces utilizando dos mililitros de 1X PBS sin calcio y magnesio. Limpie la superficie exterior de los platos con etanol al 70% y espere hasta que el alcohol se evapore. Retire las tapas de los platos y los tapones de rosca de las botellas.
Coloque cada plato sin la tapa boca abajo en la parte inferior de cada botella centrífuga de 250 mililitros. Agregue lentamente 32 mililitros de un medio de nucleación a cada botella permitiendo que el medio entre en el plato y entre en contacto con las células. Retire las burbujas de los platos con una pipeta de pasto de vidrio largo, curvando la punta en una llama de bunsen.
Cierre cada botella con el tapón de rosca y transfiéralas a la centrífuga. Centrifugar durante 20 minutos a 37 grados centígrados y 8.000 x G.Aspirar el medio de las botellas y desecharlo. Retire los platos invirtiendo las botellas en una gasa estéril previamente rociada con etanol al 70%.
Limpie la superficie exterior de los platos y sus tapas con etanol al 70%, y cierre los platos después de que el etanol se evapore. Antes de continuar, verifique la formación de citoplastos utilizando un microscopio invertido para células vivas. Busque fibroblastos extremadamente alargados debido a la extrusión de sus núcleos inducida por la citocalasina.
A cada plato de 35 milímetros agregue 1, 000, 143 celdas de fila cero. Re-suspendido en dos mililitros de medio de cultivo suplementado con 5% FBS. Deje los platos durante tres horas en una incubadora de dióxido de carbono humidificado para asentar las 143 celdas cero de la fila en los fantasmas.
Después de tres horas de incubación, aspire y deseche el medio. Lave las células de adherencia dos veces con dos mililitros de DMEM medio de glucosa alta sin suero o MEM, luego aspire y deseche el medio. Agregue 500 microlitros de solución de polietilenglicol a las células e incube durante exactamente un minuto.
Aspire y deseche la solución de polietilenglicol. Lave las células tres veces con dos mililitros de DMEM alto glucosa sin suero o con MEM. Agregue dos mililitros de medio de fusión e incube durante la noche en la incubadora a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono.
Tripsinizar las células en las placas de cultivo restantes Contarlas y sembrarlas en una o más placas de Petri Agregue de 50 a 100 células por plato en el cultivo suplementado hasta que aparezcan clones. Luego déjalos crecer durante varios días. Usando un microscopio estereoscópico, recoja los clones de la placa de Petri con cilindros de clonación o una punta de pipeta.
Trate de evitar agrupar diferentes clones y transfiéralos a una placa de 96 pocillos, cada uno de los cuales contiene 200 microlitros de medio de cultivo suplementado. Los cibridos se generaron a partir de fibroblastos derivados de un paciente portador del heteroplásmico M2343A2G Una de las mutaciones más comunes del ADN mitocondrial asociadas con miopatía mitocondrial, acidosis láctica encefalopatía y episodios similares a los accidentes cerebrovasculares. El análisis de un número variable de repeticiones en tándem mostró que el ADN cibernético es idéntico a las células de la fila cero, lo que confirma el reemplazo del ADN cibernético del paciente con el genoma 143 B.
El polimorfismo de longitud de fragmento de restricción, o análisis de secuenciación, se puede utilizar para evaluar la presencia de la mutación del ADN mitocondrial y el porcentaje de heteroplasmia. Al intentar este protocolo, es importante verificar el activo genético correcto del nucleón y el ADN mitocondrial, así como la cantidad de ADN mitocondrial en los cibridos repoblados.
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Descripción general
Los citoplasmas transmitocondriales son células híbridas creadas mediante la fusión de células agotadas de ADN mitocondrial con citoplasmas procedentes de pacientes con trastornos mitocondriales. Este enfoque ayuda a determinar el origen de las enfermedades y a evaluar las actividades bioquímicas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Genética mitocondrial
Antecedentes
- Los citoplasmas transmitocondriales son esenciales para el estudio de las enfermedades mitocondriales.
- Permiten el análisis de las contribuciones nuclear y mitocondrial a la enfermedad.
- Esta técnica es fundamental para validar la patogenicidad de las mutaciones en el ADN mitocondrial.
- Comprender el impacto bioquímico de las mutaciones es vital para el manejo de la enfermedad.
Objetivo del estudio
- Investigar el papel patógeno de nuevas mutaciones en el ADN mitocondrial.
- Correlacionar el porcentaje de heteroplasmia con la gravedad de la enfermedad.
- Realizar investigaciones bioquímicas en un entorno nuclear controlado.
Métodos Utilizados
- Fusión de células rho 0 con citoplasmas anucleados.
- Ensayos bioquímicos para evaluar la función mitocondrial.
- Validación de mutaciones en el ADNmt mediante análisis de citoplasmas híbridos (cybrids).
- Uso de PBS y etanol para la preparación de células.
Resultados principales
- Creación exitosa de citoplasmas transmitocondriales.
- Identificación de actividades bioquímicas asociadas a mutaciones del ADN mitocondrial.
- Correlación establecida entre niveles de heteroplasmia y resultados de la enfermedad.
- Confirmación del papel patógeno de variantes específicas del ADN mitocondrial.
Conclusiones
- Los citoplasmas transmitocondriales son eficaces para estudiar las enfermedades mitocondriales.
- Este método mejora la comprensión de las mutaciones del ADNmt y sus efectos.
- La investigación futura puede basarse en estos hallazgos para desarrollar terapias dirigidas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los modelos citoplásmidos transmitocondriales permiten una disección precisa de las contribuciones genéticas mitocondriales frente a las nucleares en la disfunción del OXPHOS, un punto crítico en la investigación de enfermedades mitocondriales. Este enfoque proporciona una desvinculación mecanicista y la validación de dianas para mutaciones del ADN mitocondrial, apoyando la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento y la investigación traslacional. La capacidad del sistema citoplásmido para aislar y caracterizar la patogenicidad sustenta decisiones de cartera ajustadas al riesgo en programas para trastornos mitocondriales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de la patogenicidad de las mutaciones del ADN mitocondrial en un entorno nuclear controlado.
- Apoya la validación funcional de dianas al distinguir los defectos de la OXPHOS inducidos por ADNmt de los inducidos por ADNn.
- Facilita la eliminación de riesgos mecanicistas para nuevas variantes mitocondriales antes de realizar inversiones posteriores.
- Ofrece una plataforma para correlacionar los niveles de heteroplasmia con fenotipos relevantes para la enfermedad.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Establece líneas de citoplasmones validadas para ensayos bioquímicos y genéticos reproducibles.
- Permite la medición cuantitativa de la actividad del OXPHOS y del impacto de las mutaciones.
- Apoya la estandarización de ensayos y la reproducibilidad entre laboratorios en la investigación mitocondrial.
- Prepara sistemas celulares robustos para la selección de compuestos dirigidos a la disfunción mitocondrial.
Investigación Translacional y Preclínica
- Alinea modelos citoplásmicos relevantes para la enfermedad con el desarrollo traslacional de biomarcadores.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento genético hasta la validación preclínica de dianas mitocondriales.
- Permite el avance ajustado al riesgo de intervenciones candidatas basado en evidencia mecanicista.
- Apoya la reducción predictiva de riesgos para carteras de enfermedades mitocondriales.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El modelo citoplásmido se integra en el continuo de descubrimiento a preclínico al permitir la comprobación de hipótesis, la validación de dianas y la aclaración mecanicista de los trastornos mitocondriales.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis nulas sobre la patogenicidad de mutaciones en el ADN mitocondrial y aclara los factores genéticos responsables de la disfunción OXPHOS.
- Selección: Proporciona líneas citoplásmicas estandarizadas y reproducibles para ensayos bioquímicos cuantitativos.
- Análisis: Ofrece mediciones cuantitativas de heteroplasmia y actividad OXPHOS para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos genéticos con la validación en modelos preclínicos y la alineación de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable para el descubrimiento continuo de dianas mitocondriales y biomarcadores.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la investigación de enfermedades mitocondriales.
- Valor operativo: Estandariza la generación y caracterización de citoplasmas para garantizar la reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones informadas de avance o interrupción y una gestión eficiente del portafolio en términos de capital.
- Impacto en el portafolio: Apoya la priorización y el avance de programas para trastornos mitocondriales ajustados al riesgo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en fusión celular, genética mitocondrial y desarrollo de ensayos bioquímicos.
- Exige acceso a infraestructura especializada para cultivo celular, centrifugación y análisis molecular.
- Necesita una estandarización rigurosa entre equipos de los protocolos de generación y validación de citoplasmones.
- Puede requerir adaptaciones para diferentes tipos celulares o fondos genéticos relevantes para enfermedades.
- La verificación de los componentes genéticos nucleares y mitocondriales es esencial para la fidelidad del modelo.
