Name: Ensayo mecánico de evitación de conflictos para medir el comportamiento del dolor en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-18T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Aprende el ensayo mecánico de evitación de conflictos para evaluar la sensibilidad al dolor en ratones. Este método rápido mide respuestas motivacionales y mejora la traslación de la investigación preclínica.

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GM cuenta con el apoyo de una beca de posgrado de NDSEG. VLT cuenta con el apoyo de la subvención NIH NIGMS #GM137906 y la Fundación Rita Allen. AJS cuenta con el apoyo de las subvenciones del Departamento de Defensa W81XWH-20-1-0277, W81XWH-21-1-0197 y la Fundación Rita Allen. Estamos agradecidos al Dr. Alexxai Kravitz de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington por diseñar y poner a disposición gratuitamente los archivos de impresora 3D para el piso de la cámara 2 y la placa de sonda.

Todos los experimentos que involucran el uso de ratones y los procedimientos seguidos en ellos fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales del MD Anderson Cancer Center y la Universidad de Stanford, en estricta conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud.
1. Construcción de MCA
<ol><li>Construir cámara 1 con las siguientes dimensiones: 125 mm x 125 mm x 125 mm (ancho x fondo x alto) a partir de acrílico blanco opaco de 3 mm de espesor utilizado para las paredes laterales, piso, techo. Use un acrílico transparente de 3 mm de espesor para la pared frontal. Pegue todos los lados con mucha anticipación usando adhesivo acrílico dedicado. PRECAUCIÓN: El adhesivo acrílico se considera material peligroso (inflamable, dañino para el vapor, puede ser dañino si se ingiere, puede irritar la piel o los ojos). Dichos adhesivos solo deben usarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante (es decir, con el EPP adecuado en un área bien ventilada).</li>
	<li>Conecte la tapa de la cámara 1 con una bisagra, de modo que los ratones se puedan colocar fácilmente y recuperar de la cámara. Conecte cinta de diodo emisor de luz (LED) autoadhesiva a la superficie interna de la tapa para proporcionar una iluminación de ~ 4800 lux.</li>
	<li>Cierre la cámara 1 del resto del MCA deslizando una lámina acrílica opaca dentro y fuera de su posición.</li>
	<li>Construya la cámara de prueba MCA, cámara 2, como una cámara sin iluminación de 270 mm de largo fabricada en acrílico rojo oscuro translúcido (3 mm de grosor) en todos los lados, con una tapa con bisagras en la parte superior. Coloque una rejilla de 13 x 31 de orificios de 2 mm en el piso de la cámara 2 a través de la cual pueda sobresalir una serie de sondas romas con puntas de 0,5 mm de diámetro (por ejemplo, pasadores de mapa embotados). NOTA: Pasadores contundentes con un bloque de papel de lija de 120 granos o similar. Límpielos en agua tibia con detergente antes de desinfectarlos con desinfectante esporcida.</li>
	<li>Ajuste la altura de las sondas colocando láminas acrílicas adicionales debajo de la placa base de la sonda (Figura 1). Con este enfoque, configure el dispositivo con tres ajustes: 0 mm, 2 mm y 5 mm de altura de sonda.</li>
	<li>Como alternativa a los pines de mapa embotados o materiales similares, utilice los archivos de la impresora 3D para imprimir el piso de la cámara 2 y la placa de la sonda (consulte el Archivo complementario 1: SpikeBed-MCA.stl, que se refiere a las sondas mecánicas, y el Archivo complementario 2: MCA_baseplate.stl que forma el piso de la cámara 2). NOTA: Si la impresión 3D no está disponible, pegue los pines de mapa a una hoja acrílica utilizando el mismo adhesivo acrílico utilizado para construir las paredes del dispositivo.</li>
	<li>Imprima con un material lavable y biocompatible, como plástico nylon 12 o similar (recomendado).</li>
	<li>Construir cámara 3 con las siguientes dimensiones: 125 mm x 125 mm x 125 mm como una caja de acrílico rojo oscuro translúcida sin iluminación (en todos los lados), colocada en el extremo opuesto a la cámara 1. Coloque una tapa con bisagras en la cámara, similar a las cámaras 1 y 2. Esta cámara sirve como un área de escape oscurecida de las sondas mecánicas en la cámara 2.</li>
</ol>2. Habituación y pruebas de MCA en ratones
<ol><li>Al igual que con todos los experimentos que involucran resultados conductuales en animales, observe la aleatorización y el cegamiento apropiados para minimizar el sesgo potencial. NOTA: Los resultados representativos se generaron mediante el uso de ratones C57BL/6J machos y hembras de 8-12 semanas de edad (número de cepa 000664 de Jackson Laboratories). Los ratones fueron alojados socialmente, hasta 5 por jaula, con acceso a alimentos y agua ad libitum y un ciclo de luz de 07:00 h a 19:00 h. McA tuvo lugar en el período de luz, entre las 09:00 h y las 12:00 h.</li>
	<li>Un día antes de que se programen las pruebas de referencia, aclimate a los ratones a la unidad MCA durante 5 minutos (mínimo) a 15 minutos (máximo) con sus compañeros de jaula para facilitar la exploración social de todo el dispositivo.</li>
	<li>A lo largo del proceso, asegúrese de que los LED de la cámara 1 estén apagados, que la barrera entre las cámaras 1 y 2 se deje abierta y que las sondas se ajusten a una altura de cero (es decir, que no sobresalgan a través del piso de la cámara 2).</li>
	<li>Realizar una prueba basal de ratones (opcional) si el estudio incorpora animales de control negativos (es decir, cirugía simulada o controles de inyección de vehículos). Si lo desea, use una prueba de referencia para excluir cualquier valor atípico no lesionado que nunca cruce a la cámara 2, aunque esto no ha demostrado ser necesario. Si se utiliza, informe todos los criterios de exclusión y el número de ratones excluidos.<ol>
<li>Antes de comenzar las pruebas, configure una cámara de video capaz de grabar imágenes de 1080p en un trípode con una vista lateral de todo el dispositivo MCA. Ajuste el campo de visión de tal manera que el MCA llene la imagen grabada.</li>
		<li>Una vez que comience la grabación, sostenga una placa de borrado en seco de mano en el campo de visión de la cámara para etiquetar el inicio del video con información de identificación sobre la ejecución de la prueba del animal (por ejemplo, ID del mouse, altura de la sonda, fecha, punto de hora, etc.).</li>
		<li>Para la primera ejecución, establezca la altura de la sonda en cero. Transfiera el ratón que se va a probar de su jaula doméstica a la cámara 1 con la puerta de barrera en su lugar. Inicie un temporizador que esté visible en el material de archivo grabado. NOTA: El temporizador garantiza que los intervalos entre las diferentes partes de la prueba sean coherentes entre ejecuciones.</li>
		<li>Después de 10 s, encienda la cámara 1 LED. Después de que el ratón haya estado en la cámara iluminada durante 20 s, retire la barrera entre las cámaras 1 y 2.</li>
		<li>Observar al animal durante 2 min. Mida las latencias y / o los tiempos de permanencia con un cronómetro mientras la prueba está en curso. Alternativamente, las imágenes de video se pueden analizar una vez que se completan las pruebas. NOTA: Por razones de rendimiento y evitando la exposición prolongada a estímulos aversivos, el corte se fijó en 2 min.</li>
		<li>Medir uno o más de los varios resultados útiles que se han identificado (ver más abajo; Figura 1). Se recomienda analizar las 5 medidas de resultado al comenzar las pruebas, para determinar qué aspectos del comportamiento difieren en una configuración experimental dada.<ol>
<li>Opción I: Registre la latencia en la primera entrada a la cámara 2. Opción II: Registre la latencia para cruzar más de la mitad de la cámara 2. Opción III: Registrar el tiempo total de permanencia en la cámara 2. Opción IV: Registre la latencia para llegar a la cámara 3 (escape). Opción V: Similar a la opción II, registre el tiempo total de permanencia en cada cámara dentro de los 2 minutos y conviértalos en proporciones. NOTA: Dado que cada experimento es único y puede estar influenciado por factores biológicos y cambios de comportamiento exclusivos del modelo de enfermedad, los investigadores pueden experimentar con estas y otras medidas en sus propias manos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Una vez que se complete la prueba, devuelva el ratón a su jaula doméstica, limpie las cámaras MCA con etanol al 70% y deje que se seque por completo. NOTA: El boli fecal generalmente se puede limpiar de la cámara con relativa facilidad con toallas de papel antes del etanol / desinfectante. Si se necesita una limpieza más profunda, las cámaras 2 y 3 se pueden desmontar y sumergir en agua tibia y jabonosa.</li>
		<li>Después de ejecutar todos los ratones de una cohorte con la altura de la sonda establecida en cero, inserte una lámina de acrílico de 3 mm debajo de la placa base de la sonda mecánica y repita los pasos 2.4.2 a 2.4.7 con una altura de sonda de 2 mm.</li>
		<li>Después de ejecutar todos los ratones con la altura de la sonda establecida en 2 mm, inserte una segunda lámina de acrílico de 3 mm debajo de la placa base de la sonda y repita los pasos 2.4.2 a 2.4.7 con una altura de sonda de 5 mm. NOTA: Un grupo de 8 ratones puede ser probado en aproximadamente 2 h utilizando este enfoque. Use grupos más pequeños si se requiere un tiempo más preciso después de la droga (por ejemplo, para un experimento de curso de tiempo de drogas).</li>
		<li>Realice una limpieza final con un desinfectante al final de una sesión de prueba.</li>
	</ol></li>
	<li>Repetir las pruebas después de inducir hipersensibilidad al dolor y/o con tratamiento farmacológico.</li>
	<li>Compare el rendimiento de cada ratón al inicio del estudio con su rendimiento después de inducir el dolor. Evaluar el impacto de una intervención farmacológica comparando animales tratados con vehículos con animales tratados con fármacos en el mismo punto temporal.</li>
	<li>Realizar análisis estadísticos no paramétricos (por ejemplo, la prueba U de Mann Whitney) si los animales alcanzan el límite de 2 minutos sin satisfacer la medida de resultado deseada, lo que resulta en datos no continuos.</li>
</ol>

<ol><li>Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+and+sensitive+method+for+measuring+thermal+nociception+in+cutaneous+hyperalgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia.</a> Pain. 32 (1), 77-88 (1988).</li>
<li>Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+tactile+allodynia+in+the+rat+paw%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw.</a> Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).</li>
<li>Sheahan, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+nerve+injury+minimally+affect+mouse+voluntary+behaviors+proposed+as+indicators+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Inflammation and nerve injury minimally affect mouse voluntary behaviors proposed as indicators of pain.</a> Neurobiology of Pain. 2, 1-12 (2017).</li>
<li>Wodarski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-centre+replication+of+suppressed+burrowing+behaviour+as+an+ethologically+relevant+pain+outcome+measure+in+the+rat%3A+a+prospective+multicentre+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Cross-centre replication of suppressed burrowing behaviour as an ethologically relevant pain outcome measure in the rat: a prospective multicentre study.</a> Pain. 157 (10), 2350-2365 (2016).</li>
<li>King, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unmasking+the+tonic-aversive+state+in+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Unmasking the tonic-aversive state in neuropathic pain.</a> Nature Neuroscience. 12 (11), 1364-1366 (2009).</li>
<li>Harte, S. E., Meyers, J. B., Donahue, R. R., Taylor, B. K., Morrow, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Conflict+System%3A+A+Novel+Operant+Method+for+the+Assessment+of+Nociceptive+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mechanical Conflict System: A Novel Operant Method for the Assessment of Nociceptive Behavior.</a> PLoS One. 11 (2), 0150164(2016).</li>
<li>Pahng, A. R., Edwards, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Pain+Avoidance-Like+Behavior+in+Drug-Dependent+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Measuring Pain Avoidance-Like Behavior in Drug-Dependent Rats.</a> Current Protocols in Neuroscience. 85 (1), 53(2018).</li>
<li>Odem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sham+surgeries+for+central+and+peripheral+neural+injuries+persistently+enhance+pain-avoidance+behavior+as+revealed+by+an+operant+conflict+test%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Sham surgeries for central and peripheral neural injuries persistently enhance pain-avoidance behavior as revealed by an operant conflict test.</a> Pain. 160 (11), 2440-2455 (2019).</li>
<li>LaBuda, C. J., Fuchs, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+behavioral+test+paradigm+to+measure+the+aversive+quality+of+inflammatory+and+neuropathic+pain+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">A behavioral test paradigm to measure the aversive quality of inflammatory and neuropathic pain in rats.</a> Experimental Neurology. 163 (2), 490-494 (2000).</li>
<li>LaBuda, C. J., Fuchs, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+and+gabapentin+decrease+mechanical+hyperalgesia+and+escape%2Favoidance+behavior+in+a+rat+model+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Morphine and gabapentin decrease mechanical hyperalgesia and escape/avoidance behavior in a rat model of neuropathic pain.</a> Neuroscience Letters. 290 (2), 137-140 (2000).</li>
<li>Vichaya, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motivational+changes+that+develop+in+a+mouse+model+of+inflammation-induced+depression+are+independent+of+indoleamine+2%2C3+dioxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Motivational changes that develop in a mouse model of inflammation-induced depression are independent of indoleamine 2,3 dioxygenase.</a> Neuropsychopharmacology. 44 (2), 364-371 (2019).</li>
<li>Hascoët, M., Bourin, M., Nic Dhonnchadha, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+light-dark+paradigm%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neuropsychopharmacology+%26+Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The mouse light-dark paradigm: a review.</a> Progress in Neuropsychopharmacology & Biological Psychiatry. 25 (1), 141-166 (2001).</li>
<li>Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+validation+of+voluntary+gait+and+mechanical+sensitivity+assays+associated+with+inflammatory+and+neuropathic+pain+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Pharmacological validation of voluntary gait and mechanical sensitivity assays associated with inflammatory and neuropathic pain in mice.</a> Neuropharmacology. 130, 18-29 (2018).</li>
<li>Huck, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+Contribution+of+Myeloid-Lineage+TLR4+to+the+Transition+to+Chronic+Pain%3A+A+Focus+on+Sex+Differences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temporal Contribution of Myeloid-Lineage TLR4 to the Transition to Chronic Pain: A Focus on Sex Differences.</a> Journal of Neuroscience. 41 (19), 4349-4365 (2021).</li>
<li>Pitzer, C., La Porta, C., Treede, R. D., Tappe-Theodor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+and+neuropathic+pain+conditions+do+not+primarily+evoke+anxiety-like+behaviours+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Inflammatory and neuropathic pain conditions do not primarily evoke anxiety-like behaviours in C57BL/6 mice.</a> European Journal of Pain. 23 (2), 285-306 (2019).</li>
<li>Sieberg, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathic+pain+drives+anxiety+behavior+in+mice%2C+results+consistent+with+anxiety+levels+in+diabetic+neuropathy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Pain+Reports%22%5BJournal%5D)">Neuropathic pain drives anxiety behavior in mice, results consistent with anxiety levels in diabetic neuropathy patients.</a> Pain Reports. 3 (3), 651(2018).</li>
<li>Meuwissen, K. P. V., van Beek, M., Joosten, E. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burst+and+Tonic+Spinal+Cord+Stimulation+in+the+Mechanical+Conflict-Avoidance+System%3A+Cognitive-Motivational+Aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromodulation%22%5BJournal%5D)">Burst and Tonic Spinal Cord Stimulation in the Mechanical Conflict-Avoidance System: Cognitive-Motivational Aspects.</a> Neuromodulation. 23 (5), 605-612 (2020).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses relevantes que revelar.

Al igual que con todas las pruebas de comportamiento, el manejo adecuado, la aleatorización y el cegamiento al tratamiento de los animales es esencial en todo momento. Dados los aportes multifactoriales en comportamientos complejos y toma de decisiones, es imperativo que los animales sean manejados, habituados y probados de la manera más consistente posible mientras se minimiza la angustia. También se debe tener cuidado para reproducir el momento de la colocación del mouse en la cámara 1, encender las luces LED y elimina...

El dolor es una experiencia compleja con componentes sensoriales y afectivos. Una reducción en el umbral de percepción del dolor y la hipersensibilidad a los estímulos térmicos y/o mecánicos son características clave de esta experiencia, que las pruebas de comportamiento del dolor evocadas por estímulos pueden capturar (como la prueba de sensibilidad al calor de Hargreaves y la prueba de von Frey de sensibilidad mecánica)1,2. Aunque tales pruebas dan resultados robustos y reproducibles, están limitadas por su dependencia de la retirada reflexiva de un estímulo nocivo percibido. Esto ha puesto en duda una dependencia continua de la investigación del dolor solo en estas pruebas. Con ese fin, los investigadores del dolor han estado explorando durante varios años pruebas de comportamiento alternativas / complementarias para su uso en modelos de dolor en roedores en un esfuerzo por capturar más de los componentes afectivos y / o motivacionales del dolor. Estas medidas no evocadas, voluntarias o no reflexivas (por ejemplo, correr con ruedas, actividad de madriguera, preferencia de lugar condicionado 3,4,5) se están implementando en un intento de mejorar la traducibilidad de la investigación preclínica del dolor.
El ensayo de evitación mecánica de conflictos (MCA) fue descrito originalmente por Harte et al. en 20166, se usa predominantemente en ratas 7,8 y representa una modificación de un enfoque anterior: el paradigma de evitación de escape del lugar. En este enfoque, un estímulo nocivo de la pata trasera se realiza en una cámara deseable (oscura) para impulsar el comportamiento intencional del animal para escapar / evitar dicha estimulación 9,10. En lugar de depender de la estimulación nociva manual de la pata trasera por parte de un observador, el ensayo MCA obliga a los ratones a negociar un estímulo potencialmente nocivo para escapar de un entorno aversivo y llegar a la cámara oscura. El conflicto/ evitación que da nombre al ensayo surge de estas dos motivaciones en competencia: escapar de las áreas brillantemente iluminadas y evitar la estimulación nociva de las patas. El ensayo MCA también comparte características con las pruebas de preferencia de lugar condicionadas, donde el emparejamiento del alivio del dolor con señales ambientales impulsa cambios en el comportamiento que reflejan una preferencia por el contexto de alivio del dolor / recompensa11.
Fundamentalmente hablando, todos estos ensayos comparten un enfoque similar: usar un cambio en la preferencia de un animal por un entorno aversivo sobre otro como un indicador de su estado afectivo / motivacional. El ensayo MCA es un paradigma de 3 cámaras que consiste en una cámara brillantemente iluminada seguida de una cámara media oscura con sondas de altura ajustable y una tercera cámara oscura sin ningún estímulo aversivo. Un ratón no herido suele estar motivado para escapar a una cámara oscura, dada la aversión innata de los roedores a la luz brillante12. En este ejemplo, la motivación natural para escapar de un entorno brillantemente iluminado supera la falta de inclinación a encontrar la estimulación de la pata trasera (las sondas de altura ajustable), que ocurre exclusivamente en el entorno oscuro. Por el contrario, un ratón que experimenta dolor (debido a la inflamación o la neuropatía, por ejemplo) puede optar por pasar más tiempo en el entorno brillantemente iluminado, ya que existe una motivación para evitar la desagradable experiencia táctil de las sondas mecánicas en el contexto de la hipersensibilidad táctil en curso.
En este artículo se describe una versión modificada del ensayo MCA. Hemos adaptado el método original (que se realizó en ratas6) para su uso en ratones. También hemos reducido el número de alturas de sonda probadas de seis a tres (0, 2 y 5 mm por encima de la altura del piso) para agilizar la adquisición de datos. Este enfoque ha sido probado a través de múltiples modelos de dolor, y validado con analgésicos conocidos, lo que indica que la hipersensibilidad al dolor y / o los cambios afectivos y motivacionales asociados están impulsando estos cambios en el comportamiento. Este enfoque es relativamente rápido de llevar a cabo y adaptable en comparación con otras medidas no reflexivas, que pueden llevar muchos días de habituación y entrenamiento 1,2. En conjunto con otras medidas de dolor, MCA puede generar información valiosa sobre los aspectos afectivos y motivacionales del dolor.

<table><tbody><tr><td>32.8ft 3000K-6000K Tiras de luces LED blancas sintonizables, luces de cinta LED súper brillantes regulables con 600 LED SMD 2835</td><td>Lepro</td><td>SKU: 410087-DWW-US</td><td>Para la cámara de iluminación 1. https://www.lepro.com/32ft-dimmable-tunable-white-led-strip-lights.html</td></tr><tr><td>'cama de espigas' y 'piso de la cámara 2</td>' impresas en 3D'Shapeways <td></td><td>N/A</td><td>Opcional, para sondas mecánicas como alternativa a los pines de mapa desafilados.</td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Varios</td><td>N/A</td><td>Para limpiar MCA entre ratones.</td></tr><tr><td>Bisagra acrílica 2</td><td>TAP Plastics</td><td>N/A</td><td>para fijar las tapas de las cámaras a las paredes traseras. https://www.tapplastics.com/product/plastics/handles_hinges_latches/acryl_hinge_2/122</td></tr><tr><td>Lámina acrílica Chemcast Cast,</td><td>Clear TAP Plastics</td><td>N/A</td> 3mm de <td>espesor. Para la pared frontal de la cámara 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_cast_clear/510</td></tr><tr><td>Chemcast Cast Acrílico de color transparente, rojo oscuro transparente - 50%</td><td>TAP Plastics</td><td>N/A</td><td>3mm de espesor. 50% de transmisión de luz. Para paredes y tapas de las cámaras 2 y 3. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_transparent_colors/519</td></tr><tr><td>Chemcast Translúcido & Acrílico fundido de color opaco, letrero blanco opaco - 0.1%</td><td>TAP Plastics</td><td>N/A</td><td>3 mm de espesor. Para las paredes laterales y la tapa de la cámara 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_color/341</td></tr><tr><td>Desinfectante (p. ej., cuatricidio)</td><td>Pharmacal Research Laboratories, Inc.</td><td>65020F</td><td>Para desinfectar el MCA al final de una sesión de prueba.</td></tr><tr><td>Rotuladores y pizarra de borrado en seco</td><td>Varios</td><td>N/A</td><td>Para añadir información experimental al principio de las secuencias de vídeo.</td></tr><tr><td>Mapa de pines</td><td>Varios</td><td>N/A</td><td>Opcional, para sondas mecánicas. Use papel de lija para desafilar las puntas afiladas antes de usar. Se puede utilizar en lugar de piezas impresas en 3D.</td></tr><tr><td>Toallas de papel</td><td>Varios</td><td>N/A</td><td>Para limpiar/desinfectar MCA.</td></tr><tr><td>SCIGRIP Weld-On #3 Cemento Acrílico</td><td>TAP Plásticos N</td><td>/A</td><td>Para ensamblar láminas acrílicas en cámaras y fijar bisagras. https://www.tapplastics.com/product/repair_products/plastic_adhesives/weld_on_3_cement/131</td></tr><tr><td>Cronómetro</td><td>Varios</td><td>N/A</td><td>Para registrar latencias de escape/tiempos de permanencia en tiempo real o a partir de video grabado.</td></tr><tr><td>Temporizador</td><td>Varios</td><td>N/A</td><td>Para garantizar el encendido del LED, la eliminación de la barrera y la finalización de la prueba se cronometran de manera consistente.</td></tr><tr><td>Cámara de vídeo</td><td>Varios</td><td>HDRCX405 Videocámara Handycam</td><td>Para grabar el comportamiento del ratón en el dispositivo MCA. Se puede sustituir por cualquier cámara de video de consumo con una resolución de 1080p.</td></tr><tr><td>Trípode</td><td>Famall</td><td>N/A</td><td>Cualquier trípode que pueda sostener la cámara a la altura de la mesa para grabar imágenes MCA es aceptable.</td></tr></tbody></table>

ensayo mecánico de evitación de conflictos para medir el comportamiento del dolor en ratones

Mechanical Conflict-Avoidance Assay to Measure Pain Behavior in Mice

El dolor comprende dimensiones sensoriales (nociceptivas) y afectivas (desagradables). En modelos preclínicos, el dolor se ha evaluado tradicionalmente mediante pruebas reflexivas que permiten inferencias sobre el componente nociceptivo del dolor, pero proporcionan poca información sobre el componente afectivo o motivacional del dolor. Por lo tanto, el desarrollo de pruebas que capturen estos componentes del dolor es muy importante. Por lo tanto, los investigadores necesitan usar ensayos conductuales no reflexivos para estudiar la percepción del dolor en ese nivel. La evitación mecánica de conflictos (MCA) es un ensayo de comportamiento voluntario no reflexivo establecido, para estudiar las respuestas motivacionales a un estímulo mecánico nocivo en un paradigma de 3 cámaras. Un cambio en la preferencia de ubicación de un ratón, cuando se enfrenta a estímulos nocivos competidores, se utiliza para inferir lo desagradable percibido de la luz brillante frente a la estimulación táctil de las patas. Este protocolo describe una versión modificada del ensayo MCA que los investigadores del dolor pueden usar para comprender las respuestas afectivo-motivacionales en una variedad de modelos de dolor de ratón. Aunque no se describen específicamente aquí, nuestros datos de MCA de ejemplo utilizan el adyuvante de Freund completo intraplantar (CFA), la lesión nerviosa evitada (SNI) y un modelo de fractura / yeso como modelos de dolor para ilustrar el procedimiento de MCA.

El ensayo MCA se ha utilizado con éxito con varios modelos de dolor de ratón mecánicamente distintos. La Figura 2 muestra datos en los que la medida de resultado de elección estaba cruzando el punto medio de la cámara 2 (Figura 2A). Los datos obtenidos mediante el uso del punto medio versus el escape en la cámara 3 son muy similares, ~ 40 s para la mitad del camino versus ~ 45 s para el escape de la cámara 3 en el modelo de lesión nerviosa evitada (SNI) de dolor...

El ensayo mecánico de evitación de conflictos se utiliza como una lectura no reflexiva de la sensibilidad al dolor en ratones que se puede utilizar para comprender mejor las respuestas afectivo-motivacionales en una variedad de modelos de dolor de ratón.

Ensayo mecánico de evitación de conflictos para medir el comportamiento del dolor en ratones

Pain comprises of both sensory (nociceptive) and affective (unpleasant) dimensions. In preclinical models, pain has traditionally been assessed using ...

Este método puede ayudar a responder preguntas sobre el estado efectivo o motivacional de los animales bajo diferentes condiciones de dolor. Es un paso importante en la mejora de la traducción de la investigación preclínica. La principal ventaja de esta técnica es que es relativamente rápida y fácil de realizar, pero aún así evalúa motivaciones complejas que influyen en el comportamiento relacionado con el dolor.Comience por construir las paredes laterales, el piso y el techo de la cámara uno utilizando un acrílico blanco opaco de tres milímetros de espesor. Para la pared frontal, use un acrílico transparente de tres milímetros de grosor. Coloque la tapa de la cámara uno con una bisagra para que los ratones se puedan colocar fácilmente y recuperar de la cámara.A continuación, conecte cinta de diodo emisor de luz autoadhesiva a la superficie interna de la tapa para proporcionar una iluminación de alrededor de 4, 800 lux. Deslice una lámina acrílica opaca dentro y fuera de su posición para cerrar la cámara uno del resto del dispositivo MCA. A continuación, construya una cámara dos sin iluminación de 270 milímetros de largo, la cámara de prueba MCA, utilizando acrílico rojo oscuro translúcido en todos los lados con una tapa con bisagras en la parte superior.Luego coloque una rejilla de 13 x 31 con orificios de dos milímetros en el piso de la cámara a través de la cual puede sobresalir una serie de sondas romas con puntas de 0,5 milímetros de diámetro. Ajuste la altura de las sondas colocando láminas acrílicas adicionales debajo de la placa base de la sonda. Con este enfoque, configure el dispositivo con alturas de sonda de cero, dos y cinco milímetros.Como alternativa a los pines de mapa embotados o materiales similares, utilice los archivos de la impresora 3D para imprimir el piso de la cámara dos y la placa de sonda con un material lavable y biocompatible como el plástico de nylon 12. Finalmente, construya una cámara oscura tres usando acrílico translúcido de color rojo oscuro en todos los lados con una tapa con bisagras similar a las cámaras uno y dos. Colóquelo en el extremo opuesto de la cámara uno para que sirva como un área de escape oscura de las sondas mecánicas en la cámara dos.Un día antes de programar la prueba de referencia, aclimate a los ratones a la unidad MCA durante 5 a 15 minutos con sus compañeros de jaula para facilitar la exploración social de todo el dispositivo. Asegúrese de que los LED de la cámara uno estén apagados, que la barrera entre las cámaras uno y dos se mantenga abierta y que las sondas no sobresalgan por el suelo de la cámara dos. A continuación, configure una cámara de video capaz de grabar imágenes de 1080 píxeles en un trípode con una vista lateral de todo el dispositivo MCA.Ajuste el campo de visión de tal manera que el MCA llene la imagen grabada. Una vez que comience la grabación, sostenga una placa de borrado en seco de mano en la vista de campo de la cámara para etiquetar el inicio del video con información de identificación sobre la ejecución de la prueba del animal. Para la primera ejecución, ajuste la altura de la sonda a cero y transfiera el ratón que se va a probar desde su jaula doméstica a la cámara uno con la puerta de barrera en su lugar.Inicie un temporizador que esté visible en el material de archivo grabado. Después de 10 segundos, encienda la cámara uno LED. Después de que el ratón haya estado en la cámara iluminada durante 20 segundos, retire la barrera entre las cámaras uno y dos.Observe al animal durante dos minutos y mida las latencias o los tiempos de permanencia con un cronómetro mientras la prueba está en curso. Registre la latencia en la primera entrada a la cámara dos, la latencia para cruzar más de la mitad de la cámara dos, el tiempo total de permanencia en la cámara dos, la latencia para llegar a la cámara tres y el tiempo total de permanencia en cada cámara en dos minutos y conviértalos en proporciones. Una vez completada la prueba, devuelva el ratón a su jaula doméstica.Limpie las cámaras MCA con etanol al 70% y deje que se seque por completo. Después de ejecutar todos los ratones de la cohorte con la altura de la sonda establecida en cero, inserte una lámina de acrílico de tres milímetros debajo de la placa base de la sonda mecánica y repita la ejecución con una altura de sonda de dos milímetros. Después de ejecutar todos los ratones con la altura de la sonda establecida en dos milímetros, inserte otra hoja de acrílico de tres milímetros debajo de la placa base de la sonda y repita la ejecución con una altura de sonda de cinco milímetros.Realice una limpieza final con un desinfectante al final de la sesión de pruebas. En el modelo completo de dolor inflamatorio inducido por adyuvantes de Freund, una inyección salina no cambia la latencia de escape en comparación con la línea de base. Los ratones inyectados con el adyuvante mostraron un aumento significativo en la latencia de escape cuatro días después de la inyección, pero solo cuando la altura de la sonda se elevó a cinco milímetros.Este aumento de la latencia no se observó en ratones que recibieron carprofeno 90 minutos antes del comienzo de las pruebas. El modelo de lesión nerviosa evitada del dolor neuropático aumentó significativamente la latencia para escapar en comparación con la línea de base cuando la altura de la sonda se estableció en cinco milímetros. Este aumento se evitó mediante la administración del analgésico opioide buprenorfina 90 minutos antes de la prueba.También se observó un aumento de la latencia de escape en ratones que no se sometieron a una ronda de referencia de pruebas de MCA antes de la lesión nerviosa. El aumento de la latencia de escape en ratones con lesión nerviosa evitada a cinco milímetros se evitó con gabapentina administrada 90 minutos antes de la prueba. En el modelo de fractura o fundición, la latencia para escapar de la cámara uno aumentó proporcionalmente a la altura de la sonda antes de la lesión.Después de la lesión, la latencia se mantuvo sin cambios en cero milímetros, pero aumentó significativamente en la altura de la sonda de dos milímetros y cinco milímetros para los machos y la altura de la sonda de cinco milímetros para las hembras en comparación con la línea de base. Lo más importante que debe recordar al intentar este procedimiento es asegurarse de que todos los ratones estén habituados al dispositivo MCA y mantener una aleatorización y cegamiento adecuados durante todo el estudio. Este método se puede utilizar junto con otras medidas de sensibilidad al dolor, incluyendo von Frey o preferencia de lugar condicional.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Las mediciones electrónicas de von Frey son una alternativa eficaz y mejorada a los filamentos clásicos de von Frey, ya que permiten una medición rápida y precisa de los cambios en los umbrales de retirada mecánica de los roedores a los estímulos de presión aplicados continuamente antes y después de un evento inflamatorio.

Medición de los cambios en la sensibilidad táctil en la pata trasera de ratones utilizando un aparato electrónico de von Frey

Se describe un protocolo para examinar el desarrollo de la hiperalgesia y la tolerancia en ratones inducida por opioides. Sobre la base de la medición de las respuestas nociceptivas térmicas y mecánicas de los animales no tratados previamente y tratados con morfina, que permite cuantificar el aumento en la sensibilidad al dolor (hiperalgesia) y disminuir en la analgesia (tolerancia) asociada con la administración de opiáceos crónica.

Evaluación de la hiperalgesia inducida por la morfina y analgésicos Tolerancia en ratones utilizando térmicas y mecánicas Modalidades nociceptivos

La osteoartritis (OA) o enfermedad degenerativa de las articulaciones, es una condición debilitante asociada con el dolor que queda sólo parcialmente controlado por analgésicos disponibles. Los modelos animales se están desarrollando para mejorar nuestra comprensión de los mecanismos del dolor relacionado con la OA. A continuación se describe la metodología para el modelo monoiodoacetate del dolor de la osteoartritis en el ratón.

El Modelo Monoiodoacetate del dolor de la osteoartritis en el ratón

En este trabajo ofrecemos detalles de los métodos de producción y control de calidad de una proteína de fusión recombinante de IL4-10. También mostramos cómo probar la efectividad de esta proteína para resolver el dolor en un modelo murino de dolor inflamatorio.

Desarrollo de proteínas recombinantes para el tratamiento de dolor crónico

Normalmente, el modelo de inyección del cuello del ratón se utiliza para evaluar los comportamientos de arañazos inducidos por pruritogen. Sin embargo, el modelo proporciona información sólo sobre la picazón, no el dolor. Aquí, un modelo de inyección de mejillas se introduce en ratones que se puede utilizar para medir simultáneamente el dolor y los comportamientos relacionados con la picazón.

Modelo de inyección de mejillas para la medición simultánea del dolor y los comportamientos relacionados con la picazón

Hemos desarrollado una medida evocada de dolor de la artritis y junto con un método estandarizado para medir el dolor espontáneo en diferentes modelos murinos de artritis inducida químicamente. Estas medidas son sensibles y reproducibles para diferentes tipos de dolor en las articulaciones.

Medidas espontáneas y evocadas de dolor en modelos murinos de dolor Monoarticular de la rodilla

Para desarrollar nuevas intervenciones terapéuticas para la prevención y el tratamiento del dolor de espalda, se requieren modelos animales para examinar los mecanismos y la efectividad de estas terapias desde una perspectiva traslacional. El presente protocolo describe la prueba BMS, un método estandarizado para evaluar la sensibilidad mecánica de la espalda en la rata.

Evaluación de la sensibilidad mecánica de la espalda en la rata para la investigación mecanicista del dolor de espalda crónico

Aquí se proporcionan métodos para la inducción simple y rápida de un modelo de dolor de espalda en ratones utilizando una inyección intraligamentosa de activador del plasminógeno urinario.

Modelo de dolor de espalda de ratón inducido por activador del plasminógeno de tipo uroquinasa

Este protocolo describe la evaluación de la hipersensibilidad mecánica en un modelo de rata de dolor orofacial neuropático utilizando un dispositivo de evaluación del dolor orofacial basado en operantes.

Evaluación de la hipersensibilidad mecánica inducida por lesión nerviosa en ratas mediante un ensayo de dolor operante orofacial

Aquí, presentamos un modelo de dolor inflamatorio modificado con la inyección de carragenina en ambas patas traseras para evaluar el efecto analgésico.

Un modelo de dolor inflamatorio modificado para estudiar el efecto analgésico en ratones

El protocolo describe cómo medir la hiperalgesia de rodilla en ratones. Mostramos ejemplos en modelos murinos de dolor agudo de rodilla, así como en modelos de osteoartritis (OA).

Evaluación de la hiperalgesia de rodilla en ratones mediante la medición de la aplicación de presión

Aprende el ensayo mecánico de evitación de conflictos para evaluar la sensibilidad al dolor en ratones. Este método rápido mide respuestas motivacionales y mejora la traslación de la investigación preclínica.

Ensayo mecánico de evitación de conflictos para medir el comportamiento del dolor en ratones

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