Administración intraductal y visualización por rayos X de la solución ablativa a base de etanol para la prevención y el tratamiento local del cáncer de mama en modelos de ratón

El cáncer de mama es el cáncer más prevalente y la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer para las mujeres en los Estados Unidos. Los enfoques de prevención actuales son limitados y vienen con una variedad de efectos secundarios adversos. Se necesitan nuevas intervenciones para la prevención primaria. Hemos desarrollado un método para la administración intraductal de una solución ablativa a base de etanol al epitelio mamario de ratón para la prevención del cáncer de mama.

La inyección directamente en la abertura del pezón permite dirigirse a las células epiteliales que recubren el árbol ductal con un daño mínimo en el tejido colateral. Este método permite obtener imágenes simultáneas in vivo utilizando nanopartículas de óxido de tantalio como agente de contraste de alta resolución. Este método puede adaptarse para su uso con otros agentes de contraste de rayos X y varios tratamientos preventivos con diferentes soluciones químicas o ablativas térmicas.

El primer paso involucrado con este método de prevención del cáncer de mama guiado por imágenes es inducir un tratamiento antiinflamatorio prolongado a través de la dosificación oral de carprofeno utilizando tazas de gel de sucralosa preparadas en el laboratorio. Preparamos al animal mediante el uso de crema depilatoria para eliminar el pelaje de la zona que rodea los pezones a inyectar. Luego, las inyecciones intraductales se realizan con la ayuda de un estereoscopio para localizar y visualizar mejor la abertura del pezón para la inserción de la aguja.

Después de la administración de la solución, los animales son fotografiados por micro-CT o fluoroscopia para determinar qué tan exitosas fueron las inyecciones. Las micro-tomografías computarizadas se pueden procesar para crear reconstrucciones en 3D del árbol ductal mamario inyectado para un análisis más detallado del llenado exitoso y otras métricas. Primero, prepare el carprofeno en la concentración requerida.

Hacemos una solución de trabajo de dos mg por ml para inyectar 0,5 ml y lograr una dosis final de un mg por taza. Puede agregar colorante alimentario estéril a la mezcla para confirmar mejor la mezcla completa del medicamento en la sucralosa de la taza. A continuación, coloque las tazas en un baño de agua a 60 grados centígrados durante 15 minutos.

Retire las tazas y séquelas para minimizar la posibilidad de contaminación. Use toallitas de etanol o etanol al 70% para limpiar la superficie de la tapa de la taza y dejar secar. Use una jeringa para inyectar la cantidad necesaria de solución de carprofeno a través de la tapa.

En este caso, necesitamos inyectar 500 microlitros para el resultado deseado. Coloque una pegatina sobre el orificio de la aguja y agite la taza durante 15 segundos antes de vórtice durante 15 segundos adicionales. Revise la taza para una mezcla homogénea buscando grupos de azul oscuro.

Las tazas pueden refrigerarse hasta por un mes. La preparación del animal debe ocurrir dos o tres días antes del procedimiento intraductal. Comience anestesiando al animal usando isoflurano.

Transfiera el ratón anestesiado a un cono nasal que continúa entregando isoflurano. Aplique lubricante para los ojos al ratón mientras está en el cono de la nariz y luego coloque el mouse sobre su espalda. Use un aplicador con punta de algodón para aplicar crema depilatoria en el área de las glándulas mamarias que planea inyectar.

Frote el aplicador hacia arriba y hacia abajo a través de la piel del animal en el área deseada para ayudar a un aflojamiento más rápido del pelaje. Es importante dejar la crema en el ratón durante el menor tiempo posible para evitar quemar la piel. Después de 10 a 30 segundos de aplicación, use agua tibia en una gasa para eliminar completamente la crema.

Use de dos a cuatro enjuagues para asegurar la eliminación completa antes de secar la piel con una gasa limpia. Verifique las áreas de eliminación de pieles para confirmar una buena visibilidad y acceso a los pezones. Repita el procedimiento depilatorio si es necesario.

Coloque el ratón en una jaula de recuperación limpia en una almohadilla de calentamiento para recuperarse de la anestesia. Dé una taza de carprofeno para preparar a los ratones en su jaula doméstica después de la recuperación. Comenzará nuevamente anestesiando al animal con anestesia con isoflurano y moverá el ratón a un cono nasal una vez que haya sido completamente inducido.

Se aplicará lubricante para los ojos antes de colocar al animal boca arriba para inyecciones. Puede ser útil pegar con cinta adhesiva las piernas cerca de las glándulas mamarias que se inyectarán, pero no es necesario. Prepare la jeringa con el volumen deseado de solución inyectable más un microlitro en caso de que algunos derrames después de la extracción de la aguja.

Puede ser útil llenar con volumen adicional para probar la aguja para detectar el flujo libre de la solución inmediatamente antes de la inyección. Si se inyecta más de una glándula mamaria, puede ahorrar tiempo para rellenar previamente varias jeringas si están disponibles. Tenga cuidado de no hacer esto demasiado pronto si la solución es propensa a obstruirse cuando se deja sentada.

Prepare el pezón eliminando cualquier piel muerta visible con fórceps de punta fina si es posible. No es necesario eliminar toda la piel muerta si no está bloqueando la abertura del pezón y es resistente a los tirones. Esto a veces puede causar lesiones e hinchazón en el pezón si la piel muerta se fija a la piel viva con demasiada fuerza.

Con el bisel de la aguja visible, inserte la aguja en la abertura del pezón con la ayuda de guía de las pinzas de punta fina. Dependiendo de la longitud y firmeza del pezón, es posible que no siempre sea posible sostener el pezón mientras se guía en la aguja. A veces es necesario maniobrar el pezón con la aguja para permitir que los fórceps tiren del pezón hacia arriba sobre la aguja en lugar de guiar la aguja hacia abajo en el pezón.

Una vez que el bisel de la aguja esté completamente rodeado por el pezón y en el conducto principal, comience a inyectar lentamente la solución. La velocidad deseada es de aproximadamente 40 microlitros por minuto. Evite inyectar más rápido que esto para prevenir posibles daños al árbol ductal.

Después de la inyección completa, espere 30 segundos antes de retirar la aguja del pezón con la ayuda de los fórceps. Esto minimizará cualquier fuga del pezón. Evalúe el área para detectar cualquier signo de una inyección fallida.

Una apariencia abovedada puede indicar una inyección de almohadilla de grasa o un traumatismo en el área. A menudo es posible ver que se está produciendo una inyección en la almohadilla de grasa si la solución contiene tinte o si está buscando cuidadosamente una cúpula en el sitio de inyección, como se puede ver aquí. Proceda a inyectar las glándulas mamarias restantes requeridas para su experimento de manera similar, observando los volúmenes de inyección y cualquier incidencia de fuga.

Algunas áreas del ratón pueden ser más difíciles de inyectar debido a problemas como la colocación incómoda de la mano o la interferencia respiratoria. Por ejemplo, un inyector diestro probablemente tendrá más dificultades para inyectar las glándulas en la parte superior derecha del ratón que se ve aquí. Estos se mueven más debido a la proximidad a los pulmones y puede ser difícil encontrar una buena colocación de la mano con el cuerpo del animal en la forma de apoyar la muñeca en la superficie.

A algunos les puede resultar más fácil reposicionar el ratón si el cono de la nariz lo permite. Al inyectar una solución que contiene etanol, se debe tener cuidado para evitar la intoxicación sistémica por alcohol. Esto requiere saber cuánto etanol se puede inyectar en una sesión y administrar la solución IP que contiene sacarosa durante el procedimiento para contrarrestar los efectos.

Después del procedimiento intraductal, los animales pueden ser recuperados en una jaula limpia en una almohadilla térmica o trasladados al sistema micro-CT para obtener imágenes de árboles ductales llenos. El ratón también debe recuperarse después de cualquier sesión de imagen. Después de mover el animal inyectado al sistema de micro-TC, continúe administrando isoflurano para mantener la anestesia durante la obtención de imágenes.

Puede ser útil estandarizar la posición de las imágenes pegando con cinta adhesiva las piernas cerca del sitio para obtener la imagen. Por ejemplo, pegar las patas traseras hacia abajo en una posición extendida puede evitar que el hueso de las piernas impida la vista de las glándulas inyectadas. Pegar las patas delanteras con cinta adhesiva en una posición extendida hacia arriba puede ayudar de manera similar a ver las glándulas superiores.

También hemos encontrado que la cinta adhesiva a través del abdomen del ratón puede ayudar a reducir el artefacto respiratorio para las glándulas inferiores. Hay muchos parámetros de escaneo aceptables para la visualización del árbol ductal. Siempre se debe tener cuidado para garantizar que la dosis de radiación resultante de estas exploraciones no exceda los límites de radiación para una cepa determinada de ratones.

La dosificación de radiación se puede reducir en gran medida al ver la fluoroscopia y observar el éxito de la administración en lugar de adquirir imágenes con tiempos de exposición más largos. Nuestros parámetros de escaneo estándar son aceptables para imágenes repetidas si solo se adquieren escaneos estándar cortos de dos minutos. Las exploraciones más largas de mayor resolución de hasta 14 minutos son aceptables como procedimiento terminal antes de la eutanasia.

Estas exploraciones más largas no son aceptables para estudios longitudinales, ya que pueden causar enfermedad por radiación en el animal. A este animal se le inyectó una solución de etanol que contenía 100 milimolares de contraste de óxido de tantalio en las glándulas cuatro y nueve. La adquisición actual es una exploración de alta resolución de 14 minutos de las glándulas inferiores inyectadas.

La fluoroscopia del animal nos permite ver la arquitectura del árbol ductal resaltada por el contraste dentro de la solución inyectable. El sistema micro-CT que utilizamos tiene un software incorporado que permite la creación de copias rápidas para evaluar el éxito de la inyección sin análisis formal. Esta característica tiene un control deslizante de contraste simple que permite una reducción razonable de la señal al ruido.

La limitación de estas representaciones es que se aplican los mismos umbrales de señal a toda la imagen. Esto permite que las señales brillantes que claramente no forman parte del árbol ductal, como el hierro en la dieta, permanezcan en la rendición. Se pueden realizar mejores representaciones formales utilizando un software de análisis más sofisticado que permite la segmentación del área de interés.

Para obtener la mejor representación del único árbol ductal, recomendamos segmentar la almohadilla de grasa mamaria para un mayor procesamiento de imágenes. Este proceso requiere trazar los límites de la almohadilla de grasa a lo largo del grosor completo del animal. Hemos encontrado que rastrear cada tercer corte y propagar el objeto es suficiente para capturar la totalidad del conducto.

Este puede ser un proceso subjetivo, que requiere el cumplimiento de los estándares de laboratorio para el rastreo para garantizar un resultado similar de todas las personas que analizan los escaneos. La familiaridad con la anatomía puede ayudar con las llamadas de juicio sobre qué áreas incluir. Después de propagar rastros, es posible calcular el umbral de la representación dentro de un cierto rango para mostrar solo el contraste contenido dentro de la glándula mamaria.

Esta debe ser la solución dentro del árbol ductal, así como cualquier fuga en las inmediaciones. Un rango de 300 a 3, 000 HU tiende a funcionar bien en el caso de soluciones que contienen óxido de tántalo. Un ejemplo de una copia completamente procesada se puede ver aquí en múltiples aspectos.

Dependiendo de cómo se oriente el animal en el micro-CT, puede ser necesario reorientar los archivos DICOM en el software de análisis para representar un posicionamiento anatómico intuitivo con la cabeza del animal en la parte superior de la imagen. También puede ser difícil determinar qué glándula se está viendo si no tiene cuidado de rotar la imagen de manera similar cada vez. Se pueden realizar mediciones adicionales, como el volumen o la longitud, una vez que haya creado una reconstrucción del árbol ductal.

La validación para una entrega exitosa a través de este procedimiento se puede demostrar no solo mediante representaciones micro-CT en 3D como se describe aquí, sino también a través de soportes enteros de doble tinción con azul Evans inyectado que se superpone a todo el árbol ductal resaltado con alumbre de carmín. La microscopía confocal 3D puede resaltar la arquitectura del árbol ductal en una glándula despejada teñida con e-cadherina. La variabilidad de cepa a tensión y de ratón a ratón y la anatomía del pezón pueden dificultar más o menos la inyección de glándulas.

Este es un ejemplo de un pezón ideal para inyección con un perfil alto para facilitar el agarre. Los pezones con perfiles más bajos, como este, pueden ser más difíciles de cannular con éxito. Estas diferencias pueden hacer que sea más probable lograr una inyección exitosa sin trauma o doming como se ve aquí o más probable que no tenga éxito, como lo demuestra la apariencia abovedada de esta inyección de almohadilla de grasa.

Cuando se trata de la prevención del cáncer de mama, actualmente se están empleando dos tácticas principales. La primera, la espera vigilante, no implica una verdadera intervención. Las personas que siguen este camino son monitoreadas regularmente para detectar cualquier bulto en el tejido mamario que indique que se está produciendo la formación de cáncer.

La detección de la enfermedad provocaría entonces el tratamiento. La mastectomía profiláctica es un procedimiento más invasivo que elimina todas las células epiteliales de las que puede surgir el cáncer de mama junto con el estroma circundante. Esta cirugía puede tener efectos secundarios adversos graves y rara vez se selecciona como una opción profiláctica para individuos con riesgo bajo o moderado de enfermedad.

Nuestro enfoque implica la ablación epitelial local a través de la inyección de una solución ablativa directamente en el árbol ductal mamario. Este método reduce el daño colateral y probablemente sería una opción más atractiva para las personas que no tienen un riesgo grave de enfermedad. La adición de contraste para imágenes inmediatas después de la inyección también hace que esto sea fácilmente traducible a la clínica.