Name: En Ovo Inyección intravascular en embriones de pollo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Aprende la técnica de inyección intravascular in ovo en embriones de pollo para biología del desarrollo. Este método permite introducir plásmidos y células germinales primordiales en vasos sanguíneos embrionarios.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31972547). Agradecemos la edición de Jing Wang y la voz en off de Malik Donlic en la Universidad Estatal de Washington, Estados Unidos.

Todos los procedimientos relacionados con el cuidado y el uso de animales se ajustaron a las directrices del Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos (NIH Pub. No. 85-23, revisado en 1996) y los protocolos de embriones de pollo fueron aprobados por el Comité de Ética de Animales experimentales y manejo de animales de laboratorio de la Universidad de Yangzhou, China (No.201803124).
1. Recolección y preparación de óvulos fertilizados
NOTA: A diferencia de los mamíferos, el pollo tiene millones de folículos en un solo ovario, pero solo unos pocos de estos folículos son lo suficientemente maduros como para ovular. Cada folículo contiene un ovocito o célula germinal. Tan pronto como el folículo madura y libera su yema, se incorpora al embudo de la trompa de Falopio. A medida que el folículo entra en el abdomen yugular del oviducto, el semen se une al huevo en el cuerpo de la gallina, y el calcio en el cuerpo de la gallina forma una cáscara que envuelve el huevo fertilizado, formando un huevo de cáscara blanda en el cuerpo. La cáscara de calcio se espesa gradualmente hasta que se produce el huevo.
<ol><li>Recolecte óvulos fertilizados de un vendedor o institución local, que se pueden almacenar a 16 ° C durante 1 semana. NOTA: La alta temperatura de almacenamiento ayudará al embrión a desarrollarse, mientras que la baja temperatura disminuirá la viabilidad del embrión. Los embriones no se desarrollarán si el tiempo de almacenamiento es demasiado largo.</li>
	<li>Frote la cáscara del huevo suave y lentamente con etanol al 75% antes de transferir los huevos a la incubadora.</li>
	<li>Coloque los huevos de lado, cuidadosamente en una rejilla en una incubadora a 37.8 ° C y 60% de humedad. Después de 60 h de incubación (etapa 17 de HH), los embriones desarrollarán vasos sanguíneos visibles y el corazón comenzará a latir15. NOTA: Después de 2 días de incubación, aparecen pequeños puntos primordiales, la etapa temprana del corazón. Este proceso se llama cherrybeading. A ~ 2.5 días, el corazón y otros segmentos del cuerpo se forman con vasos visibles.</li>
</ol>2. Preparación antes de la inyección
<ol><li>Prepare capilares de vidrio que se utilizarán como agujas. Antes de la inyección, tire de los capilares de vidrio de 90 mm con un diámetro exterior de 1 mm y un diámetro interior de 0,6 mm con el extractor. Rompe las puntas con fórceps (el ángulo del capilar de vidrio suele ser de 45°) y esteriliza los capilares bajo luz UV durante 2 h.</li>
	<li>Prepare materiales exógenos como plásmidos, lentivirus envasados y PGC.<ol>
<li>Mezcle suavemente el plásmido pEGFP-N1 (un plásmido que expresa GFP mejorado, 1μg / μL) con liposoma en una proporción de 1: 3 (m / v). Añadir agua para obtener una concentración final de ADN de 10 ng/μL. Deje reposar la mezcla de ADN a 37 °C durante 20 min antes de la inyección.</li>
		<li>Descongelar los virus en hielo antes de la inyección. El título de lentivirus utilizado para la inyección debe ser superior a 5 x 106 Tu/mL.</li>
		<li>Diluir los PGC parentales o de gónadas modificadas (E4.5, HH etapa 24) a 2,000-5,000 células / μL. NOTA: Aquí hemos mostrado el procedimiento de inyección usando azul tripano.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Ventanas
<ol><li>Antes de exponer los embriones, esterilícelos limpiando suave y suavemente la superficie de las cáscaras de huevo con alcohol al 75% con una bola de algodón, asegurándose de esterilizar el borde romo de los huevos a fondo.</li>
	<li>Después de la esterilización, golpee suavemente el extremo romo con fórceps para crear una pequeña ventana (0,5 cm x 0,5 cm) en la superficie de la cáscara del huevo para exponer el embrión. Retire la membrana embrionaria y luego coloque el óvulo en el soporte bajo el microscopio de disección.</li>
</ol>4. Inyección
<ol><li>Busque vasos sanguíneos bajo el microscopio y ajuste el enfoque del microscopio de disección para localizar el embrión, y luego encuentre el vaso sanguíneo listo para la inyección.</li>
	<li>Llene la aguja de vidrio con la solución exógena (plásmido, lentivirus o PGC) usando una pipeta lentamente, evitando burbujas de aire en la aguja.</li>
	<li>Apunte la aguja con solución exógena al vaso sanguíneo, con la aguja paralela al vaso sanguíneo que se inyecta.</li>
	<li>Inserte suavemente la aguja llena en el recipiente y encienda la bomba para expulsar la solución (generalmente el volumen inyectado es de ~ 1-5 μL) bajo el microscopio. La presión de la bomba de aire debe ser lo suficientemente baja como para evitar la destrucción de los vasos, ya que la presión de aire excesivamente alta dañaría los vasos sanguíneos, lo que llevaría a un flujo de alta velocidad.<ol>
<li>Una vez que la solución exógena se inyecta en el vaso, asegúrese de que el color del vaso se convierta en el color de la solución y se recupere a rojo en 2-5 s, lo que indica que la solución exógena se entrega con éxito al vaso. En este punto, la solución ingresa a la arteria, y con el latido del corazón circula de regreso al embrión a través de la arteria y luego a la vena. NOTA: Hay dos sitios de inyección para inyección vascular (Figura 1B): uno es la cabeza, donde la solución exógena se inyecta desde la vena en la cabeza del embrión y en el corazón a través del flujo sanguíneo, luego circula a todo el embrión con el corazón latiendo (Figura 1B, Flecha 1). Otra es a través de la aorta dorsal de la sangre embrionaria; la solución exógena se inyecta y se extiende a todo el embrión (Figura 1B. Flecha 2) con el latido del corazón embrionario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de la inyección, retire el óvulo del microscopio estereoscópico y deje caer 200 μL de solución de penicilina dentro de la cáscara del huevo. Cortar un trozo de cinta médica de 3 cm de largo y sellar la ventana. Raspe suavemente la cinta con tijeras para exprimir las burbujas de aire y luego corte otra pieza para sellar la abertura.</li>
	<li>Etiquete y coloque el huevo inyectado de nuevo en la incubadora e incube hasta la etapa de desarrollo requerida o la eclosión.</li>
</ol>

<ol><li>Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+embryo+as+a+model+in+epigenetic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Chicken embryo as a model in epigenetic research.</a> Poultry Science. 100 (7), 101164(2021).</li>
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<li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMGCS1+promotes+male+differentiation+of+chicken+embryos+by+regulating+the+generate+of+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22All+Life%22%5BJournal%5D)">HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol.</a> All Life. 14 (1), 577-587 (2021).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin1z+induces+the+male+pathway+in+the+chicken+by+down-regulating+Tcf4%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4.</a> Gene. 780, 145521(2021).</li>
<li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+viable+chicken+by+allogeneic+transplantation+of+primordial+germ+cells+induced+from+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 2989(2021).</li>
</ol>

No se declararon conflictos de intereses.

El método de inyección in ovo intravascular de embriones de pollo está optimizado para materiales exógenos (vectores, virales o PGC) que se transfieren al embrión. Basándonos en este método, construimos modelos de embriones de pollo con sobreexpresión o interferencia genética estable (SpinZ, JUN, UBE2I, etc.) 17,18,19. Estos modelos bien establecidos demuestran la viabilidad de este enfoque. Además, no solo transferimo...

Los embriones de pollo se han utilizado ampliamente durante siglos en aplicaciones biológicas, inmunológicas, patológicas y de desarrollo 1,2,3. Tienen muchas ventajas inherentes sobre otros modelos animales en el estudio de la toxicología y la biología celular4. Los embriones de pollo son fácilmente accesibles y pueden manipularse in vitro y observarse directamente en cualquier etapa del desarrollo, lo que proporciona un práctico sistema de modelo de investigación embrionaria.
En general, los métodos actuales de administración de embriones de pollo, como la electrotransfección y la inyección de cavidad subgerminal, tienen limitaciones como el requisito de equipos especializados y un programa diseñado, y la ineficiencia debido a la presencia de yema y albúmina 5,6,7. Aquí mostramos un método de manejo simple y eficiente para entregar materiales exógenos en embriones de pollo. Esta puede ser una herramienta poderosa utilizada en el estudio de la biología del desarrollo. Los materiales inyectados se propagan a todo el embrión a través de la circulación sanguínea. Durante el desarrollo temprano de los embriones de pollo, los PGC podrían migrar a través de la sangre, colonizar la cresta genital y luego convertirse en gametos, que proporcionan un valioso camino posible para entregar materiales exógenos8. Ahora, este método ha sido ampliamente utilizado en el estudio de la función génica, la biología embrionaria y del desarrollo, y la producción de pollos quiméricos y transgénicos 9,10,11.
La inyección intravascular in ovo en embriones de pollo es un método bien establecido y de uso común 12,13,14. En este documento, mostramos una descripción completa de este protocolo que incluye materiales de inyección, sitios, dosis y resultados representativos.

<table><tbody><tr><td>Macromicroscopio de fluorescencia</td><td>OLYMPUS</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio</td><td>Narishige</td><td>G1</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>12566014</td><td>liposoma</td></tr><tr><td>pEGFP-N1 vector</td><td>Clontech</td><td>#6085-1</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 Kit enlazador de células fluorescentes rojas&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL</td><td></td></tr><tr><td>pLVX-EGFP vector de lentivirus</td><td>Addgene</td><td>128652</td><td></td></tr><tr><td>Microinyector neumático</td><td>Narishige</td><td>IM-11-2</td><td></td></tr><tr><td>Extractor</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Tinte azul de tripano</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

en ovo inyección intravascular en embriones de pollo

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

Como un sistema modelo clásico de biología embrionaria, el embrión de pollo se ha utilizado para investigar el desarrollo embrionario y la diferenciación. La entrega de materiales exógenos en embriones de pollo tiene una gran ventaja para estudiar la función génica, la reproducción transgénica y la preparación de quimeras durante el desarrollo embrionario. Aquí mostramos el método de inyección intravascular in ovo mediante el cual los materiales exógenos como los vectores plásmidos o las células germinales primordiales modificadas (PGC) pueden transferirse a embriones de pollo de donantes en etapas tempranas de desarrollo. Los resultados muestran que la inyección intravascular a través de la aorta dorsal y la cabeza permite que los materiales inyectados se difundan en todo el embrión a través del sistema circulatorio sanguíneo. En el protocolo presentado, la eficacia de la introducción de plásmidos exógenos y vectores lentivirales, y la colonización de PGC exógenos inyectados en la gónada receptora, se determinaron mediante la observación de fluorescencia en los embriones. Este artículo describe procedimientos detallados de este método, proporcionando así un excelente enfoque para estudiar la función génica, la biología embrionaria y del desarrollo, y la producción de pollos quiméricos de gónadas. En conclusión, este artículo permitirá a los investigadores realizar in ovo inyección intravascular de materiales exógenos en embriones de pollo con gran éxito y reproducibilidad.

Mostramos aquí la inyección intravascular in ovo de embriones de pollo. En la Figura 1 se muestra un proceso esquemático de la inyección intravascular; en nuestro estudio, utilizamos varias soluciones exógenas para probar y verificar la inyección.
Para visualizar mejor los materiales inyectados, se inyectó Trypan Blue (0,4%) como trazador en el embrión. Se observó que el marcador (azul) se difunde a todo el embrión a través de la circulación sang...

El objetivo general de este artículo es describir cómo realizar la inyección intracelular ovo de materiales exógenos en embriones de pollo. Este enfoque es muy útil para estudiar la biología del desarrollo de los embriones de pollo.

En Ovo Inyección intravascular en embriones de pollo

As a classical model system of embryo biology, the chicken embryo has been used to investigate embryonic development and differentiation. Delivering ...

Hola, soy Kai Jin de la Universidad de Yangzhou. En nombre de nuestro grupo de investigación voy a presentar una poderosa herramienta del embrión de pollo en la investigación del desarrollo. El embrión de pollo es un modelo de desarrollo clásico que se ha utilizado para investigar el desarrollo y la diferenciación, de hecho, las medidas extrañas del laboratorio en embriones de pollo son una herramienta valiosa para la biología del desarrollo, como la transfección genética, la reproducción transgénica y la preparación transmural gonadal.En nuestro laboratorio, hemos establecido los métodos de inyección de tipo mu, pero para muchos investigadores, el detalle de la inyección no está claro y es difícil de alinear. Así que en este video, vamos a mostrar los detalles de la inyección vascular durante la etapa temprana del desarrollo embrionario de pollo en ovo. No dude en ponerse en contacto con nosotros si está interesado en ello.Aquí, mostramos los detalles del protocolo. Recolección y preparación de óvulos fertilizados. Primero, a diferencia de los mamíferos, el pollo tiene millones de folículos en un solo ovario, pero solo unos pocos de estos folículos son lo suficientemente maduros como para ovular.Cada folículo contiene un ovocito o célula germinal. Tan pronto como el folículo madura y libera su yema, se incorpora al embudo de la trompa de Falopio. A medida que el folículo entra en el abdomen yugular del oviducto, el semen se une al huevo en el cuerpo de la gallina y el calcio en el cuerpo de la gallina forma una cáscara que envuelve el huevo fertilizado formando un huevo de cáscara suave en el cuerpo.Las cáscaras de calcio se espesan gradualmente hasta que se produce el huevo. Recoja el óvulo fertilizado, académicamente llamado huevos embrionarios y colóquelos cuidadosamente en un estante en una incubadora a 37.8 grados Celsius y 60% de humedad. Los embriones se incuban en condiciones adecuadas.Después de dos días de incubación, aparecen pequeños puntos rojos pulsantes llamados corazones primordiales. Este proceso se llama batido de cerezas. Alrededor de los 2,5 días, los vasos sanguíneos son visibles y se han formado los segmentos del corazón y el cuerpo.Preparación de agujas y plásmidos. Utilizamos capilares de vidrio como agujas. Antes de la inyección, prepare capilares de vidrio con el diámetro exterior de un milímetro y el diámetro interno de 0,6 milímetros.Los materiales exógenos suelen ser plásmidos, lentivirus empaquetados y células germinales primordiales, o PGC. En este video, usamos el azul tripano para mostrar el rastro de los materiales inyectados. Ventanas. Antes de exponer los embriones, necesitamos esterilizar los embriones para evitar la contaminación por gérmenes.Esto se hace limpiando suavemente la superficie de los embriones con una bola de algodón con 75% de alcohol en el sitio de la abertura del huevo. Después de la desinfección, golpee suavemente el extremo romo de la cáscara del huevo con fórceps y corte cuidadosamente un agujero de 0,5 centímetros por 0,5 centímetros en la superficie de la cáscara del huevo con las pinzas para exponer el embrión. Inyección intravascular in-ovo.Mire la vista bajo el microscopio, ajuste el enfoque del microscopio para localizar primero el embrión y luego encuentre los vasos sanguíneos del embrión de pollo listos para la inyección. Apunte la aguja con la sustancia exógena al vaso sanguíneo, observando que la aguja es paralela al vaso sanguíneo que se inyecta. Inserte la aguja suavemente en el vaso sanguíneo y luego encienda la bomba de aire.En este punto, la sustancia extraña ingresa a la arteria y, con el latido del corazón, circula de regreso al embrión a través de la arteria y luego a la vena. Hay dos tipos de inyecciones vasculares. La primera es una inyección en la cabeza donde la sustancia extraña se inyecta desde una vena en la cabeza del embrión y fluye de regreso al corazón.La otra es una inyección aórtica dorsal donde la sustancia extraña circula al embrión con el latido del corazón. Con el latido del corazón embrionario y la circulación de la sangre podemos ver claramente que el material extraño es recibido por los capilares al final de la arteria, en la vena y luego regresa al embrión desde la vena, lo que indica que el material extraño inyectado se entrega efectivamente a cada parte del embrión. Después de la inyección, retire el óvulo del estereomicroscopio, corte un trozo de cinta médica de tres centímetros de largo con tijeras pequeñas y conecte la cinta a la abertura.Raspe suavemente la cinta con las tijeras para exprimir las burbujas de aire y luego corte otro trozo de cinta para sellar la abertura en una cruz. Después de sellar la abertura, los embriones inyectados se colocan cuidadosamente de nuevo en la incubadora. Aquí mostramos las imágenes representativas de embriones de pollo post inyección.La primera imagen muestra el resultado de la inyección de plásmido lentivirus. La fluorescencia verde bajo un microscopio de fluorescencia estereoscópica indica la expresión exitosa del plásmido inyectado en embriones. Esto sugiere la viabilidad de la inyección intravascular de plásmidos en embriones de pollo.La segunda imagen muestra los resultados de la inyección de PGC. Los PGC fueron etiquetados con RFP. En esta imagen pudimos ver los PGC inyectados que son los puntos rojos aquí, ubicados en la gónada de los receptores.Esto indica que los PGC del donante pudieron entrar y colonizar en la gónada de los receptores de manera efectiva. En conclusión, este protocolo presenta el proceso de inyección intravascular in-ovo de materiales exógenos, plásmidos o PGC en embriones de pollo. El método que se muestra aquí es fácil de seguir y aprender y vale la pena la aplicación en muchos campos.Esto es todo lo que me gustaría compartir con ustedes. Espero que este enfoque facilite su trabajo como una poderosa herramienta de investigación en el establecimiento de embriones de pollo y la biología del desarrollo. Gracias por ver este video y buena suerte con su investigación.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

De pollo en la electroporación in ovo es una técnica que permite la manipulación genética del embrión aviar. Las aplicaciones más comunes de esta técnica incluyen el análisis funcional de los genes y la posible potenciador de los elementos. Este video muestra la electroporación del tubo neural en embriones de pollo HH 10. Técnica de inyección y la adecuada manipulación de los huevos se discuten.

En Electroporations Ovo de embriones de pollo HH Etapa 10

En este trabajo se presenta un método para el trasplante de células madre humanas en varias regiones del sistema nervioso central del embrión de pollo. Esto proporciona...

Xenotrasplante de células madre humanas en el embrión de pollo

Usando la punta fina micropipetas se inyecta el plásmido de ADN en subdominios de somitas pollo o tubos neurales. La concentración del plásmido se ajusta a generar solo las células transfectadas. A continuación, permitir que las células se desarrollan en poblaciones clonales.

Transfección de células individuales en embriones de pollo

El objetivo general de este video es mostrar cómo llevar a cabo la inyección específica de retina...

En electroporación in ovo en la retina de embriones de pollo

Este video muestra el procedimiento de inyectar células cancerosas por vía intravenosa en la vasculatura de la membrana corioalantoidea del pollo para generar un modelo de metástasis de cáncer CAM. Las células inyectadas eventualmente forman colonias dispersas de células cancerosas individuales, lo que permite el estudio de la invasión del cáncer y la metástasis.

Inyección intravenosa de células cancerosas en la vasculatura de la membrana corioalantoidea de pollo: un procedimiento para establecer un modelo de cáncer de membrana corioalantoidea para estudiar la invasión y metástasis del cáncer

La expresión ectópica es una técnica para dilucidar el papel microRNAs en el desarrollo del cerebro. Sin embargo, la focalización en áreas específicas mediante electroporación in ovo es un reto. Aquí, se muestra una forma eficiente a las regiones del cerebro medio ventral y dorsal selectiva electroporar.

En Expression in ovo de microARN en ventral del polluelo Midbrain

Las neuronas auditivas del tronco encefálico de aves y mamíferos están especializadas en la codificación neural rápida, un proceso fundamental para las funciones auditivas normales. Estas neuronas surgen de precursores distintos de embriones hindbrain. Presentamos técnicas que utilizan electroporación para expresar genes en el cerebro posterior de embriones de pollo para estudiar la función génica durante el desarrollo auditivo.

En Ovo electroporación en el tronco encefálico auditivo del pollo

En este método, los tejidos cardíacos embrionarios son quirúrgicamente microdissected, disociado, etiquetado fluorescente e implantado en los tejidos embrionarios de host. Esto proporciona una plataforma para el estudio de la organización del desarrollo nivel individuo o tejido bajo condiciones hemodinámicas ectópicas o alteración paracrina/yuxtacrina entornos.

Sistema basado en la microinyección en Vivo implantación de cardiomiocitos embrionarios en el embrión aviar

Este protocolo describe tres métodos sobre cómo obtener y utilizar embriones de pollo de 5 a 8 días de edad y su membrana corioalantoidea (CAM) como modelo in vivo para estudiar imágenes de ultrasonido con contraste y administración de fármacos mediada por microburbujas.

La preparación de embriones de pollo ex ovo y vasos de membrana corioalantoicos como modelo in vivo para imágenes de ultrasonido con contraste y estudios de administración de fármacos mediados por microburbujas

Los embriones de pollo, como modelo de desarrollo clásico, se utilizan en nuestro laboratorio para evaluar las cardiotoxicidades del desarrollo después de la exposición a diversos contaminantes ambientales. Los métodos de exposición y los métodos de evaluación morfológica/funcional establecidos se describen en este manuscrito.

Uso del embrión de pollo como una herramienta poderosa en la evaluación de cardiotoxicidades del desarrollo

Aprende la técnica de inyección intravascular in ovo en embriones de pollo para biología del desarrollo. Este método permite introducir plásmidos y células germinales primordiales en vasos sanguíneos embrionarios.

En Ovo Inyección intravascular en embriones de pollo

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