Aislamiento y análisis funcional del endotelio arteriolar del parénquima cerebral de ratón

Este método proporcionará una mejor comprensión de la función del endotelio arteriolar parenquimatoso que vincula directamente el flujo sanguíneo intracerebral con el combustible de la actividad neuronal y glial en todo el cerebro. Una clara ventaja técnica sobre el endotelio arteriol es la resolución mejorada de las dimensiones morfológicas y la señalización de calcio y electricidad entre las células endoteliales intracerebrales individuales y sus respectivos orgánulos. Inicialmente, el aislamiento y el examen del endotelio intracerebral serán muy desafiantes.

Sin embargo, es posible dominar esta técnica con mucha práctica acompañada de paciencia y dedicación. Lave el cerebro aislado con una solución de disección fría en un vaso de precipitados o una placa de Petri para eliminar la sangre restante de la superficie del cerebro. Coloque el lado del cerebro ventral boca arriba en una cámara que contenga solución de disección fría para aislar las arteriolas parenquimatosas.

Para aislar las arteriolas parenquimatosas, asegure el cerebro aislado con alfileres de acero en solución de disección en frío en una placa de Petri que contenga un recubrimiento de polímero de silicio con infusión de carbón de más de 50 centímetros de profundidad. Corte un rectángulo de tejido cerebral de ambos hemisferios con tijeras de disección afiladas y alineadas alrededor del MCA mientras se asegura de que la parte superior del segmento de tejido esté más allá del punto de ramificación del círculo de Willis. Asegure el tejido cerebral en el plato con el MCA mirando hacia arriba con pasadores de acero.

Haga con cuidado una incisión poco profunda cerca de los pasadores y retire la pia con pinzas pequeñas, pelando suavemente de un extremo hacia el otro. Asegure cuidadosamente la pia aislada con arteriolas parenquimatosas ramificadas de MCA en el plato con los alfileres y diseccione cuidadosamente las arteriolas parenquimatosas. Corte las ramas distales restantes y asegúrese de que la arteriola esté limpia sin tejido adherido.

Use esta arteriola intacta limpia para la digestión enzimática. Alternativamente, corte cada arteriola en dos trozos para la digestión enzimática para preparar tubos endoteliales si lo desea. Para la digestión parcial de los segmentos arteriolares, coloque los segmentos arteriolares intactos en un mililitro de solución de disociación en un tubo de vidrio de 10 mililitros que contenga papaína, ditioeritritol, colagenasa y elastasa.

Incubar segmentos arteriolares a 34 grados centígrados durante 10 a 12 minutos. Para aislar el tubo endotelial arteriolar, coloque la pipeta de trituración unida con el inyector de micro jeringa en la solución de disociación en la cámara y colóquela cerca de un extremo del segmento del vaso digerido. Establezca una velocidad dentro del rango de uno a tres nanolitros por segundo en el controlador de la bomba para una trituración suave.

Mientras mantiene un aumento de 100X a 200X, retire el segmento arteriolar en la pipeta y luego inyecte para disociar las células adventicias y del músculo liso. Triturar el segmento del vaso hasta que todas las células del músculo liso se disocien y solo las células endoteliales permanezcan como un tubo intacto. Con los micromanipuladores, asegure cada extremo del tubo endotelial en la cubierta de vidrio en la cámara con pipetas de fijación de vidrio de borosilicato Para medir el potencial de la membrana endotelial, mientras observa a través del objetivo 4X, coloque cuidadosamente la punta del electrodo afilado justo sobre una celda del tubo endotelial arteriolar en la solución de sal fisiológica que fluye con un micro manipulador.

Aumente gradualmente la ampliación a 400X y reposicione la punta del electrodo según sea necesario. Usando el micromanipulador, inserte suavemente la punta de un electrodo afilado en una de las celdas del tubo endotelial y comience a grabar VM usando un electrómetro. Una vez que la VM en reposo endotelial sea estable de menos 30 a menos 40 milivoltios, aplique los agentes farmacológicos deseados por objetivo experimental.

Cargue el tubo endotelial con el rastreador de fluorescencia para la membrana plasmática u orgánulo deseado a 37 grados Celsius durante 15 a 30 minutos. Lave las células con una solución de sal fisiológica de superfusión fresca e imagine células vivas bajo el microscopio en la longitud de onda de excitación de los colorantes respectivos. La función endotelial se evaluó midiendo el calcio intracelular y el potencial de membrana en respuesta a un agente farmacológico MTA, un potente agonista del receptor purinérgico a 37 grados centígrados.

Tras la aplicación de un MTA micromolar, la concentración de calcio intracelular aumenta rápidamente con una hiperpolarización concomitante. Además, el endotelio intacto se incubó a 37 grados centígrados con rastreadores fluorescentes para su visualización para examinar la morfología celular. Las imágenes de células endoteliales vivas mostraron tinción conjunta para la membrana plasmática y los núcleos.

La membrana plasmática se tiñó junto con una tinción fluorescente del retículo endoplásmico por la cual las áreas de aparente superposición de ER dentro de las proximidades de la membrana plasmática aparecen de color naranja. El experimentador debe tener cuidado durante la disección y el aislamiento para evitar daños en las arteriolas porque una arteriola dañada definitivamente no producirá un tubo endotelial intacto. Después del procedimiento, las células se pueden utilizar para inmunohistoquímica fija con anticuerpos fluorescentes o tinción de células vivas de orgánulos y lípidos de membrana.

Esta técnica generará nueva información para comprender los mecanismos subyacentes al flujo sanguíneo cerebral a nivel fundamental para la fisiología y seleccionar las transiciones hacia la patología para la terapia.