Transformación natural, expresión de proteínas y crioconservación de la filamentosa Cyanobacterium Phormidium lacuna

Este protocolo describe cómo la cianobacteria filamentosa que pertenece a los oscilaoriales puede ser transformada por transformación natural. También muestra cómo se pueden estudiar diferentes tipos de movimiento. La transformación natural es la técnica de transformación más simple, si funciona.

Solo se requiere ADN, células y medio de crecimiento. Hasta ahora, ningún otro miembro oscilatorio podía ser transformado por la transformación natural. Esperamos que nuestros estudios estimulen a otros grupos a probar otros oscilatorios.

Para la transformación, haga una cultura de aspecto bueno y saludable y una buena preparación de ADN. Para los estudios de movimiento, siempre use un cultivo tratado con ultrasonido. El tratamiento debe ser fresco.

Demostrando el procedimiento estará Nora Weber, una técnica de mi laboratorio. Comience inoculando 50 mililitros de medio F2 líquido en cada uno de los dos matraces de 250 mililitros con un mililitro de filamentos de P.lacuna de un cultivo en funcionamiento. Cultivar en luz blanca bajo agitación durante unos cinco días a 25 grados centígrados.

Después de cinco días, homogeneice 100 mililitros de suspensión de células P.lacuna a 10, 000 RPM durante tres minutos y mida la densidad óptica a 750 nanómetros. Luego, centrifugue la suspensión celular durante 15 minutos a 6, 000 veces G.Retire el sobrenadante y suspenda el pellet en 800 microlitros del líquido restante y F2 + medio adicional. Tome ocho placas de agar F2 + Bacto que contengan 120 microgramos por mililitro de kanamicina y pipetee 10 microgramos de ADN en el medio de cada placa de agar.

Pipetee inmediatamente 100 microlitros de la suspensión celular sobre el ADN. Mantenga la placa de agar sin tapa en el banco limpio para permitir que el exceso de líquido se evapore. Cierre el plato y cultivarlo en luz blanca a 25 grados centígrados durante dos días.

Después de dos días, distribuya los filamentos de cada placa de agar en varias placas de agar F2 + Bacto frescas que contengan 120 microgramos por mililitro de kanamicina con un bucle de inoculación. Cultive las placas con luz blanca a 25 grados centígrados y revise los cultivos regularmente bajo un microscopio. Después de 14 a 28 días, identifique los filamentos marrones muertos y busque filamentos transformados bajo el microscopio.

Los filamentos transformados se ven sanos y verdes y son diferentes de la mayor parte de los filamentos. Transfiera cada filamento transformado a matraces de 50 mililitros con 10 mililitros de F2+ medio con 250 microgramos por mililitro de kanamicina. Cultivar en luz blanca a 25 grados centígrados en una coctelera y observar el crecimiento durante un máximo de cuatro semanas.

Transfiera los filamentos de nuevo al medio de agar que contiene 250 microgramos por mililitro de kanamicina y espere a que los filamentos crezcan. Luego, aumente la concentración de kanamicina nuevamente para acelerar la segregación. Para la expresión de GFP, observa filamentos individuales con un microscopio de fluorescencia a un aumento de 40X o 63X y captura una imagen de transmisión de campo brillante y una imagen de fluorescencia.

Cultive P.lacuna en medio F2 bajo agitación horizontal de 50 RPM en luz blanca durante unos cinco días hasta que la densidad óptica estimada a 750 nanómetros se convierta en 0,35. Guarde la muestra a cuatro grados centígrados. Homogeneizar los filamentos con ultrasonido durante un minuto a máxima potencia y ciclo de uno.

Mida la densidad óptica a 750 nanómetros y transfiera ocho mililitros del medio que contiene P.lacuna a una placa de Petri de seis centímetros. Espere unos minutos hasta que la muestra alcance la temperatura ambiente y luego cubra la placa de Petri con papel de celofán. Coloque un portaobjetos de microscopio en la mesa X-Y de un microscopio estándar con una cámara.

Encienda la luz del microscopio y mueva un objetivo 4X o 10X en el camino de la luz. Luego, coloque la placa de Petri en la parte superior de la diapositiva. Ajuste filamentos individuales o haces de filamentos por los movimientos X, Y y Z de la tabla.

Observe los movimientos de filamentos o haces individuales y registre los movimientos con una cámara de microscopio estándar. Asegúrese de que la lente del objetivo no toque el líquido. Pipetear 0,5 mililitros de una solución que contenga P.lacuna sobre la superficie del agar Bacto de una placa de Petri de seis centímetros.

Permita que el líquido entre en la superficie. Después de unos 20 minutos, cierre la placa de Petri y observe el movimiento de los filamentos en la superficie utilizando un objetivo 4X o 10X. Capture las grabaciones de lapso de tiempo utilizando una cámara ocular y un sistema minicomputador.

Los filamentos deben ser enfocados primero por el ojo y luego a través de la cámara ocular. Asegúrese de que el intervalo de tiempo entre las imágenes posteriores sea de cinco segundos a un minuto. Programe el script Linux de la mini-computadora para controlar la grabación de lapso de tiempo.

Prepare soportes LED donde se montan los LED de cinco milímetros para irradiar un área de 20 milímetros cuadrados de abajo hacia arriba. Mida y ajuste las intensidades del LED. Asegúrese de que todo el entorno esté en una habitación oscura o en un recipiente cerrado y oscuro.

Coloque ocho mililitros del medio que contiene P.lacuna en una placa de Petri de seis centímetros, cierre la placa de Petri con la tapa y colóquela en un soporte LED para que el LED esté en el centro de la placa de Petri. Después de dos días, capture una imagen de la placa de Petri con una cámara de teléfono inteligente dirigida directamente a la posición del tratamiento de luz. Utilice un soporte y una hoja blanca como fondo para garantizar la misma distancia y condiciones de luz para cada imagen.

Abra el software ImageJ, haga clic en Archivo, Abrir y seleccione el archivo. Luego, haga clic en Enter. Seleccione el botón recto y presione el botón izquierdo del mouse para dibujar una línea desde un extremo de la placa de Petri hasta el extremo opuesto.

Asegúrese de que la línea pase a través del centro del círculo de filamentos. Haga clic en Analizar y medir para ver la longitud de la placa de Petri. Luego, haga clic en Analizar y trazar perfil en el menú ImageJ.

Calcule un valor promedio para la intensidad de píxeles fuera del círculo y otro valor promedio para la intensidad de píxeles dentro del círculo. Apunte el ratón en la posición Y entre estos valores para estimar los valores X de ambos lados del círculo. Anote ambos valores y calcule la diferencia.

A continuación, seleccione el botón recto y dibuje una línea en el valor máximo medio de la intensidad del píxel. Finalmente, haga clic en Analizar y luego en Medir para obtener la longitud del círculo celular interno. La integración y segregación de inserto después de la transformación de P.lacuna con PAK1 se muestra aquí.

Una prueba de PCR con cebadores externos alrededor de una semana después de la transformación generalmente tiene dos bandas en el gel de electroforesis, una con el tamaño de la banda de tipo salvaje y una banda de migración más lenta que indica la inserción del cassette de resistencia. Aquí, los carriles 1 a 4 representan productos de PCR de filamentos después de siete días, 11 días, 14 días y 17 días del aislamiento de un filamento resistente, y el carril 5 representa el producto de PCR de tipo salvaje. En la muestra de siete días, el inserto está presente en una pequeña fracción de los cromosomas.

Esta fracción aumenta hasta los 17 días, donde no se ve ninguna banda de tipo salvaje; es decir, la segregación es completa. Esta imagen representa el vector pMH1 para la expresión de sfGHP bajo el control del promotor endógeno de ficocianina beta. La secuencia homóloga de P.lacuna, la columna vertebral del vector pUC19 y la inserción con sfGFP y resistencia a la kanamicina se muestran aquí.

En pMH1, el gen sfGHP se coloca tres primos del gen de la ficocianina beta; por lo tanto, es impulsado por el promotor beta endógeno cpc. Aquí se muestran imágenes de fluorescencia de filamentos de tipo salvaje de P.lacuna y después de la transformación con PAK1, PAK2, PAK3 y pMH1. La expresión de sfGFP es impulsada por el promotor cpc 560, el promotor a2813, el promotor psbA2S o el promotor beta endógeno cpc.

Las imágenes fusionadas presentadas aquí muestran la motilidad de Phormidium lacuna. El movimiento en la superficie del agar se muestra aquí. El intervalo de tiempo fue de un minuto.

El movimiento en el medio líquido se presenta aquí. El intervalo de tiempo fue de 10 segundos. La transformación natural es un método simple.

Simplemente mezcle el ADN plásmido con un cassette de resistencia en secuencias homólogas con las células y deje que las células crezcan en un medio con antibióticos. Los genes pueden ser inactivados y las proteínas pueden ser sobreexpresadas. Esto es importante para cualquier investigación básica y para los estudios biotécnicos.

En cianobacterias unicelulares donde también se establece la transformación natural, se abordaron estudios moleculares sobre fotosíntesis o fotorreceptores, etcétera.