Cortar el tronco cerebral auditivo embrionario del pollo para evaluar gradientes tonotópicos y microcircuitos
12 de julio de 2022
Aquí presentamos un protocolo para obtener cortes auditivos no coronales del tronco encefálico del embrión de pollo para la investigación de propiedades tonotópicas y trayectorias de desarrollo dentro de un corte del tronco encefálico. Estos cortes incluyen secciones sagitales, horizontales y horizontales / transversales que abarcan regiones tonotópicas más grandes dentro de un plano de corte individual que las secciones coronales tradicionales.
Este método adquiere rebanadas vivas del tronco cerebral auditivo del pollo que abarca un gradiente más grande de región de frecuencia en la misma rebanada. Estas rodajas son adecuadas para experimentos electrofisiológicos y anatómicos con un eje tonotópico más grande. Esta metodología ayudará a comprender el desarrollo de microcircuitos en el tronco cerebral auditivo.
Mientras que la anatomía es específica del pollo, otras especies de aves como las codornices y los pájaros cantores tienen una anatomía similar. Para comenzar, esterilice los huevos con etanol al 70% e incubarlos a 38 grados centígrados y 50% de humedad. A continuación, establezca la tasa de burbujeo para el ACSF tal que el pH sea de 7.2 a 7.4 con una osmolalidad entre 300 y 310 miliosmolares por litro.
Luego mezcle cinco gramos de agarosa en 100 mililitros de dACSF. Disuelva la agarosa completamente usando un baño de agua o microondas hasta que la agarosa comience a burbujear. Vierta la agarosa derretida en una placa de Petri hasta un grosor de cinco milímetros y manténgala a temperatura ambiente para que se fije.
Después de cuajar, selle la placa de Petri y guárdela a cuatro grados centígrados. Corte la agarosa en bloques de cubículos para usarla en el momento de la disección. Primero, limpie el área de disección con etanol al 70%.
Pegue el bloque de agarosa de soporte o en ángulo en la bandeja de vibratomo. Coloque el huevo bajo una luz brillante y ubique el espacio lleno de aire en el lado más grande o más redondo del huevo, luego rompa la cáscara sobre el espacio lleno de aire y exponga el saco de membrana. Haga una incisión suave en el saco para exponer el pico.
Con un bisturí, tire suavemente del cuello y la cabeza fuera del huevo. Después de la decapitación, limpie el cabezal con dACSF refrigerado. Mantenga la cabeza firme en dACSF frío y haga una incisión rostrocaudal.
Comience la incisión detrás y entre los ojos y siga la longitud del cuello cosechado. Separe la piel para exponer el cráneo. Corte el cráneo detrás del ojo en dirección media a lateral.
Repita para ambos hemisferios. Corte la porción rostral del cráneo colocando la cuchilla detrás de los ojos y haciendo un corte rápido. Luego sumerja la cabeza en un plato de dACSF frío.
Usando un par de tijeras pequeñas, haga incisiones de línea media a lateral en la región caudal del cráneo para separar el cerebro sin causar daño tisular. Exponga suavemente el tronco encefálico y el cerebelo. Retraiga el área dorsal de todo el cráneo.
Retire el tronco encefálico y expóngalo con un cepillado suave con un pincel fino. Use fórceps curvos para limpiar el tronco encefálico de la conexión de tejidos y vasos sanguíneos. Separe el tronco encefálico del cerebelo cortando los pedúnculos y retirando los vasos sanguíneos con cuidado.
Recorte el tronco encefálico de vasos sanguíneos adicionales. Primero, coloque la hoja de vibratomo a lo largo del eje horizontal. Para cortes coronales, pegue el tronco encefálico en una bandeja de corte por el lado rostral, manteniendo el eje rostrocaudal vertical.
Para cortes sagitales, mantenga el eje medial lateral vertical. Para rodajas horizontales, pegue el lado ventral manteniendo el eje ventral dorsal vertical. Para lograr el plano horizontal sagital angular agudo, pegue el lado ventral del tronco encefálico de tal manera que el eje dorsal ventral sea vertical en el bloque de agarosa de la superficie de hipotenusa.
Pegue la superficie opuesta del bloque de agarosa frente a la bandeja de corte y mantenga el eje rostrocaudal paralelo al borde de la cuchilla. Como alternativa al corte de vibratomo, sumerja el tronco encefálico aislado en una agarosa de bajo punto de fusión al 4% a 40 grados centígrados en una placa de Petri de 35 por 10 milímetros. Después de que la agarosa se solidifique, corte el bloque de agarosa del cubículo con una cuchilla de afeitar afilada.
Pegue el bloque de agarosa en su lado rostral manteniendo vertical el eje rostrocaudal del tronco encefálico. Tome cortes coronales hasta que se vea la región NM. Retire el bloque de agarosa del pegamento con una cuchilla afilada.
Con una aguja fina, coloque suavemente 0,5 microlitros de colorante azul de toluidina en el NM para detectar los núcleos. Vuelva a montar este bloque en la bandeja de corte para rodajas sagitales u horizontales. Identificar los núcleos con respecto a la región teñida y seccionar el tronco encefálico.
Después de seccionar, coloque las rodajas recolectadas secuencialmente de 200 a 300 micras en una cámara cortada que contenga ACSF para equilibrarse durante una hora a temperatura ambiente. Las secciones coronales de tejido del tronco encefálico de un embrión de pollo E19 a 21 representan las regiones de isofrecuencia relativa de los núcleos auditivos del tronco encefálico desde la región auditiva de menor a mayor frecuencia característica. Las fibras nerviosas auditivas aferentes y la bifurcación de los axones NM fueron visibles.
También se observó Nucleus angularis. En las secciones rostrales, el núcleo ovárico superior se encuentra a lo largo de la región lateral ventral del corte coronal. En las secciones sagitales, se identificaron NM y núcleo laminaris o NL donde las fibras nerviosas auditivas entraron en el grupo de neuronas.
El núcleo ovárico superior se identificó en la región rostrolateral. Se observaron regiones auditivas de baja y alta frecuencia característica de NM y NL a lo largo del eje rostrocaudal. El corte más medial mostró los mechones axonales ipsilateral y contralateral y el punto final de la región auditiva.
En los cortes horizontales, NM y NL se identificaron hacia la línea media, y las neuronas se extendieron a lo largo del eje medial lateral. Los cortes del tejido del tronco encefálico en un ángulo agudo desde un plano horizontal mostraron los núcleos auditivos del tronco encefálico a través de una gran extensión diagonal. Las imágenes ampliadas mostraron el eje tonotópico de los núcleos auditivos a lo largo del eje rostromedial a caudolateral.
Asegúrese de que todo el proceso se realice en dACSF refrigerado con hielo burbujeado continuamente con oxígeno de carbohidratos. Este protocolo se utiliza para investigadores que investigan las propiedades anatómicas y biofísicas del desarrollo de microcircuitos del tronco encefálico, específicamente la relación entre los principales núcleos auditivos.
Resumen
Este estudio presenta un protocolo para obtener cortes de tronco encefálico auditivo no coronales de embriones de pollo, destinado a investigar propiedades tonotópicas y trayectorias de desarrollo. El enfoque permite examinar regiones tonotópicas más extensas dentro de un único corte de tronco encefálico en comparación con los métodos tradicionales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del desarrollo
- Electrofisiología
Antecedentes
- El desarrollo del tronco encefálico auditivo es fundamental para el procesamiento de las frecuencias sonoras.
- Los embriones de pollo constituyen un modelo adecuado debido a sus características anatómicas similares a las de otras especies aviares.
- Los métodos tradicionales de corte coronal limitan el análisis de los patrones tonotópicos.
- Este protocolo tiene como objetivo abordar estas limitaciones y mejorar la comprensión de los microcircuitos.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un método confiable para obtener cortes que mantengan las características in vivo del tallo encefálico auditivo.
- Facilitar el estudio de las trayectorias de desarrollo de las regiones de procesamiento auditivo.
- Mejorar la comprensión de las propiedades anatómicas y biofísicas de los circuitos del tallo encefálico auditivo.
Métodos Utilizados
- Adquisición de cortes vivos del bulbo raquídeo utilizando técnicas de corte con vibratomo.
- Uso de embriones de pollo como modelo biológico.
- Algunos pasos incluyen la esterilización, inclusión en agarosa y la disección cuidadosa de los tejidos del bulbo raquídeo.
- Los cortes de tejido del bulbo raquídeo se equilibran en ACSF antes del experimento.
- Enfoque en núcleos auditivos específicos y su organización tonotópica en cortes temáticos.
Resultados principales
- Demuestra la capacidad de producir cortes que abarcan múltiples regiones tonotópicas en un solo plano.
- Permite la observación de núcleos auditivos críticos, como el núcleo angular y el núcleo olivar superior.
- Destaca la organización de las fibras del nervio auditivo y sus funciones en la tonotopía.
Conclusiones
- Este protocolo permite estudios anatómicos y funcionales detallados del tallo encefálico auditivo.
- Facilita la comprensión de las relaciones entre diferentes núcleos auditivos y sus procesos de desarrollo.
- Implicaciones para investigaciones futuras sobre mecanismos de neurodesarrollo en especies aviares.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La conservación de los gradientes tonotópicos en cortes embrionarios del tallo cerebral auditivo de pollo permite una evaluación más completa del desarrollo de microcircuitos y de la organización neuronal específica por frecuencia. Este enfoque mejora la confianza predictiva en la validación temprana de dianas neurodesarrolladoras y apoya la continuidad traslacional en la investigación del sistema auditivo. La capacidad del método para mantener gradientes de frecuencia más amplios dentro de un único corte lo posiciona como una herramienta valiosa para la reducción de riesgos mecanicistas en carteras de I+D centradas en neurobiología.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la exploración de la organización tonotópica y del desarrollo de microcircuitos en regiones de frecuencia más amplias.
- Apoya la validación funcional de objetivos al preservar la diversidad anatómica y biofísica dentro de un solo corte.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas al permitir el análisis simultáneo de múltiples núcleos auditivos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona sistemas de tejidos validados para ensayos electrofisiológicos y anatómicos dirigidos a las vías auditivas.
- Mejora la reproducibilidad de los ensayos mediante la estandarización de la orientación de los cortes y la cobertura tonotópica.
- Permite la comparación cuantitativa de las propiedades neuronales a lo largo del eje tonotópico.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Se alinea con modelos relevantes para la enfermedad en el desarrollo y funcionamiento del sistema auditivo.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante el mantenimiento de gradientes similares a los in vivo.
- Reduce el riesgo de traslación al permitir un análisis de microcircuitos más fisiológicamente relevante.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este protocolo de corte se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica al permitir estudios mecanicistas tempranos, desarrollo de ensayos e investigación traslacional sobre circuitos del tallo cerebral auditivo.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la organización tonotópica y la maduración de microcircuitos.
- Selección: Proporciona cortes reproducibles que conservan los gradientes para ensayos electrofisiológicos y anatómicos posteriores.
- Análisis: Ofrece resultados cuantitativos para comparar propiedades neuronales entre regiones de frecuencia.
- Investigación Traducional: Mantiene fidelidad del desarrollo y de la anatomía para alinear modelos preclínicos.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un protocolo estandarizado y adaptable para diversas necesidades de investigación neurodesarrolladora.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad en la validación de objetivos del sistema auditivo.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización de la preparación de cortes del tronco encefálico.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción al permitir estudios mecanicistas robustos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de objetivos y modelos en neurodesarrollo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de disección embrionaria y corte con vibrátomo.
- Exige acceso a instrumentación especializada para la preparación y análisis de tejidos vivos.
- Necesita la estandarización entre equipos en cuanto a la orientación de los cortes y la identificación del eje tonotópico.
- Adaptable a otras especies aviares con anatomía del tallo cerebral auditivo similar.
- Depende del mantenimiento de condiciones fisiológicas durante todo el manejo y corte del tejido.
