Name: Cultivos primarios de astrocitos de rata y microglia y su uso en el estudio de la esclerosis lateral amiotrófica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Aprende a preparar cultivos primarios de astrocitos y microglia de rata para estudiar la señalización de calcio intracelular en el contexto de la esclerosis lateral amiotrófica utilizando el modelo hSOD1 G93A.

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Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Desarrollo Tecnológico República de Serbia Contrato No. 451-03-9/2021-14 / 200178, el proyecto FENS - NENS Education and Training Cluster "Trilateral Course on Glia in Neuroinflammation", y la subvención EC H2020 MSCA RISE # 778405. Agradecemos a Marija Adžić y Mina Perić por proporcionar las imágenes de inmunohistoquímica y a Danijela Bataveljić por su ayuda con la redacción en papel.

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directivas de la UE sobre la protección de los animales con fines científicos y con el permiso de la Comisión de Ética de la Facultad de Biología de la Universidad de Belgrado (número de aprobación EK-BF-2016/08). En cuanto al material del paciente (sueros para IgGs), se recolectó para el examen clínico de rutina con el consentimiento informado del paciente de acuerdo con el Código de Ética de la Asociación Médica Mundial (Declaración de Helsinki) para experimentos con humanos. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Centro Clínico de Serbia (No. 850/6).
1. Preparación del cultivo celular primario
<ol><li>Aislamiento del tejido cerebral NOTA: El aislamiento debe realizarse en hielo, utilizando soluciones heladas.<ol><li>Utilizar cachorros recién nacidos de 1 a 3 días de edad para cultivo celular neonatal primario33. NOTA: Para el estudio aquí presentado, se utilizó Sprague Dawley hSOD1G93A y ratas no transgénicas. Para el genotipado, se utilizaron colas de rata para la posterior extracción de ADN y PCR.</li>
		<li>Espolvorea la cabeza del cachorro con etanol al 70% e inmediatamente decapitarla rápidamente usando tijeras.</li>
		<li>Abra la piel con tijeras de ángulo pequeño para exponer el cráneo. Abra el cráneo haciendo un corte desde el foramen magnum hacia las órbitas. A continuación, haga un corte perpendicular en la línea media. Retire el cerebro del cráneo y colóquelo en una placa de Petri que contenga solución salina tamponada con fosfato (PBS). NOTA: Limpie las herramientas entre cachorros para evitar la contaminación cruzada entre cachorros transgénicos y no transgénicos. El aislamiento de las cortezas del resto del cerebro debe hacerse bajo un microscopio estereoscópico.</li>
		<li>Usando la punta de los fórceps, rasgue las conexiones entre ambos hemisferios. Luego, separe los hemisferios con pinzas curvas empujando suavemente un hemisferio desde el centro hacia un lado.</li>
		<li>Retire las meninges rasgándolas cuidadosamente con fórceps rectas y curvas.</li>
		<li>Retire el hipocampo pellizcándolo con un fórceps curvo. Deseche el hipocampo o úselo para otra preparación de cultivo celular. NOTA: Se deben realizar pasos adicionales debajo de la campana de flujo laminar para garantizar condiciones estériles.</li>
	</ol></li>
	<li>Homogeneización y disociación tisular<ol><li>Transfiera una corteza a un tubo de 15 ml lleno de 3 ml de PBS frío. Pipet la suspensión hacia arriba y hacia abajo con una punta de 1 mL, completando 10-15 golpes hasta que la suspensión se vuelva homogénea. NOTA: Tenga mucho cuidado de no producir burbujas en este proceso.</li>
		<li>Centrifugar a 500 × g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 3 ml de PBS frío pipeteándolo hacia arriba y hacia abajo con una punta de 1 ml. Repita el paso de centrifugación. NOTA: Todas las soluciones utilizadas a partir de este punto deben precalentarse a 37 °C.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 2 ml de medio de águila modificado (DMEM) completo de Dulbecco suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) y antibióticos (penicilina y estreptomicina). Transfiera el homogeneizado a un tubo de 2 ml.</li>
		<li>Pase el homogeneizado a través de agujas de 21 G y 23 G (tres veces cada una) para hacer una suspensión de células individuales. NOTA: Tenga mucho cuidado de no producir burbujas en este proceso.</li>
	</ol></li>
	<li>Verter la suspensión celular preparada a partir de una corteza en una placa de Petri de 60 mm de diámetro o en un matraz T25 (con la superficie pretratada con un recubrimiento polipeptídico para el crecimiento de células adherentes) que contenga 3 ml de DMEM completo. Agite ligeramente la placa de Petri para que la suspensión se distribuya uniformemente.</li>
	<li>Cultivar las células en la incubadora en una atmósfera humidificada de 5% de CO2/95% de aire a 37 °C.</li>
	<li>Cambie el medio 48 h después del aislamiento y reemplace el medio cada 3 días.</li>
	<li>Para promover el crecimiento de astrocitos, cuando las células alcanzan una confluencia del 70% -80%, lávelas con PBS precalentado para eliminar las células gliales sueltas y los rastros de FBS en el medio.<ol><li>Tripsinizar la capa subyacente de astrocitos añadiendo 1 ml de solución de tripsina precalentada (tripsina al 0,25%, EDTA al 0,02% en PBS, filtrada estéril).</li>
		<li>Colocar el plato en la incubadora a 37 °C durante 2-5 min.</li>
		<li>Revise las células bajo el microscopio. Cuando comiencen a desprenderse, agregue 4 ml de DMEM completo.</li>
		<li>Recoja la suspensión celular y transfiérala a un tubo de 15 ml. Centrifugar a 500 × g durante 5 min.</li>
		<li>Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 mL de medio completo. Contar las células con un hemocitómetro.</li>
		<li>Replacar las células a una densidad de 104 células/cm2 en 5 ml de DMEM completo fresco.</li>
	</ol></li>
	<li>Cambiar el medio cada 3 días. Para minimizar la presencia de otros tipos de células gliales, después de que los astrocitos alcancen el 50% de confluencia y antes de cada reemplazo de medios, lave las células con DMEM completo.<ol><li>Aspirar el medio sobrenadante con una pipeta de 1 ml y dispensar suavemente sobre la capa de células varias veces. Asegúrese de que toda la superficie de la capa celular esté cubierta durante este paso de lavado.</li>
	</ol></li>
	<li>Una vez que las células alcancen el 80% de confluencia (generalmente después de 14 días), repita la tripsinización y la recolección de astrocitos como se describe en el paso 1.6.</li>
	<li>Semilla 5 × 103 de astrocitos en un cubreobjetos de vidrio circular de 7 mm recubierto con poli-L-lisina (50 μg/ml). Úsalos en experimentos después de 48 h.</li>
	<li>Para promover la microglía, después del paso 1.7, permita que las células gliales alcancen una capa confluente34. Cuando las células microgliales aparezcan en la parte superior de la capa de astrocitos (después de 10-15 días, reconocidas por sus cuerpos más pequeños y ovalados y procesos más cortos), agite la placa de Petri en un agitador orbital durante 2 h a 220 rpm.</li>
	<li>Dispersión y siembra de células microgliales<ol><li>Lave ligeramente las células desprendidas y sueltas aspirando el medio sobrenadante con una punta de pipeta de 1 ml y dispense suavemente sobre la capa de células varias veces. Asegúrese de cubrir toda la superficie de la capa celular durante este paso de lavado, recoja el medio con las células desprendidas y transfiéralo a un tubo de 15 ml.</li>
		<li>Centrifugar a 500 × g durante 5 min. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 mL de medio.</li>
		<li>Pase la suspensión celular a través de una aguja de 21 G para obtener una suspensión de una sola celda. NOTA: La mayoría de los métodos publicados utilizan tripsina o papaína para disociar el tejido; sin embargo, las agujas de 21 G tienen la ventaja de prevenir la sobredigestión de las células, lo que permite una disociación más suave.</li>
		<li>Contar las células con un hemocitómetro. Semilla 5 × 103 células microgliales en un cubreobjetos de vidrio circular de 7 mm recubierto con poli-L-lisina (50 μg/ml). Úsalos en experimentos después de 48 h. NOTA: Es difícil obtener un cultivo microglial puro por agitación, ya que las células precursoras de oligodendrocitos y los astrocitos todavía pueden estar presentes en un número variable dependiendo de la experiencia del experimentador. El protocolo inmunocitoquímico utilizado para estimar la presencia de diferentes poblaciones celulares en cultivos gliales ha sido descrito en otra parte35.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Inmunocitoquímica
<ol><li>Enjuague las celdas chapadas en cubreobjetos en PBS, 2 x 1 min.</li>
	<li>Fijar las células en paraformaldehído al 4% durante 20 min a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Lavar en PBS 3 x 5 min.</li>
	<li>Incubar en una solución bloqueante que contenga 10% de suero de burro normal (NDS)/1% de albúmina sérica bovina (BSA)/0,1% de Triton X-100 durante 45 min a RT.<ol><li>Añadir 50 μL de solución de bloqueo por cubreobjetos de 10 mm de diámetro.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar anticuerpos primarios en 1% NDS/1% BSA/0,1% TritonX-100 en las siguientes diluciones: ratón anti-GFAP 1:300, cabra anti-Iba1 1:500. Incubar las células con anticuerpos primarios durante la noche a +4 °C.</li>
	<li>Enjuagar en PBS, 3 x 10 min.</li>
	<li>Incubar con los anticuerpos secundarios conjugados con un fluoróforo: burro anti-ratón (excitación 488 nm [1:200)) o burro anti-cabra (excitado a 647 nm [1:200)). Incubar las células durante 2 h a RT en la oscuridad.</li>
	<li>Lavar en PBS, 7 x 5 min.</li>
	<li>Incubar las células con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1:4.000) durante 10 min a RT.</li>
	<li>Lavar en PBS 5 x 5 min.</li>
	<li>Monte los cubreobjetos en portaobjetos de microscopio utilizando una solución de montaje; Use una gota por cubreobjetos. NOTA: Las diluciones de anticuerpos pueden variar dependiendo del productor. Los usuarios deben determinar diluciones óptimas para sus experimentos.</li>
</ol>3. Imágenes de video de lapso de tiempo
NOTA: Las soluciones que contienen el tinte fluorescente deben protegerse de la luz directa. Antes de comenzar el experimento de imágenes, asegúrese de que el cubreobjetos de vidrio no se mueva al encender la perfusión.
<ol><li>Preparación de soluciones y células<ol><li>Preparar la solución extracelular (ECS) para la obtención de imágenes: 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de CaCal 2, 2 mM de MgCl2, 10 mM de D-glucosa y 10 mM de HEPES. Ajuste el pH a 7.4. Asegúrese de que la osmolaridad sea de 280-300 mOsm/kg y prepare ECS sin Ca2+: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glucosa, 10 mM HEPES y 0.1 mM EGTA.</li>
		<li>Preparar las soluciones de prueba: 100 μM ATP disuelto en ECS, 1 μM Thg en ECS sin Ca2+ y 0,1 mg/mL ALS IgG en ECS8.</li>
		<li>Transfiera un cubreobjetos a un plato con ECS para lavar el DMEM completo. Preparar la solución de carga de colorante diluyendo 1 mM de solución madre de Fluo-4 AM con ECS hasta la concentración final de 5 μM de Fluo-4 AM.<ol><li>Coloque el cubreobjetos con células en la solución de carga de tinte durante 30 minutos a RT en la oscuridad. Lave las celdas en ECS durante 20 min.</li>
		</ol></li>
		<li>Si las células no están cargadas adecuadamente (es decir, si el nivel basal de fluorescencia es demasiado bajo, <5% del rango dinámico de la cámara con un tiempo de exposición superior a 400 ms), aumente el tiempo de carga hasta 45 min a 1 h a 37 °C. Alternativamente, mezcle la solución madre de Fluo-4 AM con un volumen igual de detergente al 20% (p/v) (Pluronic) en DMSO antes de diluir en ECS, haciendo que la concentración final de Pluronic sea ~0.02%. NOTA: Los ejemplos experimentales de este estudio se realizaron con IgG humana aislada de sueros sanguíneos de pacientes con ELA como se describió anteriormente 4,5,11. Cada experimento se realizó con muestras de IgG de un solo paciente.</li>
	</ol></li>
	<li>Imágenes de vídeo NOTA: En este protocolo, el sistema de imágenes de video se combinó con una lámpara de arco corto de xenón, un sistema policromador y un microscopio de epifluorescencia invertido equipado con agua, glicerina y objetivo de inmersión en aceite. Las imágenes de lapso de tiempo se realizaron utilizando un sistema de cámara digital.<ol><li>Encienda los componentes de la configuración de imágenes 15 minutos antes del experimento para permitir que el sistema alcance la temperatura de trabajo.</li>
		<li>Coloque el cubreobjetos en la cámara de grabación con 1 ml de solución de trabajo (ECS o ECS sin Ca2+).</li>
		<li>Para elegir el protocolo de imágenes correcto, abra el software de imágenes y, en el panel Adquisición, elija los pares de filtros para Fluo4-AM con una longitud de onda de excitación a 480 nm, un espejo dicroico a 505 nm y una longitud de onda de emisión a 535 nm.</li>
		<li>Elija el campo de visión teniendo cuidado de tener un número constante de células a lo largo del experimento. Ajuste el tiempo de exposición y la ganancia del detector adecuadamente, de tal manera que la señal no esté saturada. Elija el modo pseudocolor para la adquisición. Para obtener instrucciones más detalladas, consulte el manual proporcionado por el fabricante.</li>
		<li>Ajuste la frecuencia de muestreo a 1 Hz (1 fotograma por segundo).</li>
		<li>Comience la imagen adquiriendo el nivel basal de fluorescencia durante 3-5 minutos para la determinación de la línea de base (F0). Asegurar un flujo constante de la solución de trabajo.</li>
		<li>Detenga el flujo de la solución de trabajo y cambie a la solución de prueba durante el período de tiempo deseado (consulte también las barras de tiempo en los ejemplos de la Figura 2 y la Figura 3). Entre cada solución de prueba, lave las celdas con un flujo constante de la solución de trabajo durante 3-5 minutos.</li>
		<li>Mantenga el volumen de la solución en la cámara de grabación en ~1 ml organizando una succión constante desde la parte superior de la solución (ver Figura 2E). NOTA: Para aplicar el tratamiento directamente a las células fotografiadas, se colocó un sistema de administración personalizado hecho de una pipeta de vidrio (0,8 mm de diámetro interior) a ~350 μm de distancia y ~1 mm por encima de las células, en un ángulo de 45° combinado con el sistema de intercambio de solución que contiene válvulas de pellizco y un controlador electrónico de válvulas (ver Figura 2E).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Análisis de datos
<ol><li>Defina una región de interés (ROI) que corresponda a la celda individual.<ol><li>Elija la trama con la intensidad de señal más alta (es decir, de la aplicación de ATP) y rodee una celda utilizando la herramienta poligonal de aplicación. Repita para todas las células en el campo adquirido. Elija cinco ROI en segundo plano con la herramienta Círculo.</li>
		<li>Para medir la intensidad media de la señal de una sola celda y el fondo para cada período de tiempo, seleccione todos los ROI y utilice el comando Multimedida en ROI Manager en ImageJ o cualquier comando equivalente en software comercial (consulte la Tabla de materiales).</li>
	</ol></li>
	<li>Exporte los valores medios de intensidad de señal de los ROI como una hoja de cálculo.</li>
	<li>Promedia cinco ROI de fondo y resta el fondo promediado de cada fotograma de la intensidad media del ROI del fotograma adquirido al mismo tiempo.</li>
	<li>Para normalizar los datos obtenidos a la señal de referencia, use la ecuación (1): ΔF/F 0 = (F - F 0)/F0 (1) donde F es la intensidad de la señal de cada marco de tiempo después de la resta de fondo, y F0 es la fluorescencia Fluo-4 de referencia. NOTA: En este estudio se utilizó un código personalizado.</li>
	<li>Para analizar la actividad del calcio, determine varios parámetros4: la amplitud del pico de calcio (ΔF / F 0), el cambio integrado (tiempo integral, superficie bajo el registro de respuesta) del transitorio de calcio (ΔF / F 0 × s), el tiempo transcurrido hasta el pico transcurrido desde el inicio de la estimulación hasta el máximo de calcio transitorio (s), aumento del tiempo transcurrido desde el inicio de la estimulación hasta el valor de ΔF / F 0 que alcanza el 50%-80% de la(s) amplitud(es) máxima(s), anchura-anchura completa de un transitorio a amplitud (s) media-máxima(s), frecuencia de respuestas si son repetitivas (Hz).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Este artículo presenta el método de cultivo de células primarias como una herramienta rápida y "dentro del presupuesto" para estudiar diferentes aspectos de la (fisio)fisiología celular, como la ELA en el modelo hSOD1G93A de rata. Por lo tanto, la técnica es adecuada para estudios a nivel unicelular que pueden extrapolarse e investigarse más a fondo a un nivel superior de organización (es decir, en rodajas de tejido o en un animal vivo). El cultivo celular como técnica, sin embargo, tiene algunas advertencias....

Las técnicas de cultivo celular han dado lugar a numerosos avances en diversos campos de la neurofisiología celular en la salud y la enfermedad. En particular, los cultivos celulares primarios, recién aislados del tejido neuronal de un animal de laboratorio, permiten al experimentador estudiar de cerca el comportamiento de diversas células en diferentes medios bioquímicos y configuraciones fisiológicas. El uso de diferentes indicadores fisiológicos fluorescentes, como los colorantes sensibles al Ca2+ en combinación con la microscopía de video de lapso de tiempo, proporciona una mejor comprensión de los procesos biofísicos y bioquímicos celulares en tiempo real.
La ELA es una enfermedad neurodegenerativa devastadora que afecta a las neuronas motoras superiores e inferiores1. La enfermedad tiene una patogénesis compleja de tipo familiar, pero principalmente de forma esporádica (90% de los casos)2. Es bien sabido que los mecanismos autónomos no celulares contribuyen a la fisiopatología de la ELA, principalmente debido al papel esencial de las células gliales3. La ELA también se caracteriza bien como una enfermedad neuroinflamatoria con la participación de factores humorales y celulares de inflamación.
La inmunoglobulina G es ampliamente utilizada como marcador molecular en la ELA y otras enfermedades neurodegenerativas. El estudio del nivel sérico de este marcador puede indicar la presencia y el estadio de la neuroinflamación en la enfermedad 4,5,6, mientras que su presencia en el líquido cefalorraquídeo puede indicar una ruptura de la barrera hematoencefálica7. Las IgG también fueron identificadas como depósitos en las neuronas motoras de la médula espinal de pacientes con ELA7. Sin embargo, este abordaje ha mostrado algunas inconsistencias en la correlación del nivel de IgG con el estadio y las características de la enfermedad6.
La IgG aislada de sueros de pacientes con ELA (ALS IgG) puede inducir una respuesta al calcio enastrocitos 8 naïve y la liberación de glutamato en las neuronas, apuntando a un efecto excitotóxico, un sello distintivo de la patología de ELA9. Sin embargo, los estudios en el modelo de rata hSOD1G93A ALS (que contiene múltiples copias de la mutación SOD1 humana10) mostraron una serie de marcadores de estrés oxidativo en células neurogliales cultivadas 11, tejidos 12,13,14 o animales vivos 13. Cabe destacar que los astrocitos cultivados del modelo de rata ALS fueron más propensos al estrés oxidativo inducido por el peróxido que la astroglía de compañeros de camada no transgénicos11.
Las células microgliales en cultivo se ven afectadas por la ELA IgG de una manera menos aparente. A saber, una línea celular microglial BV-2 mostró un aumento en la señal de marcadores fluorescentes de estrés oxidativo en respuesta a la aplicación de solo 4/11 muestras de pacientes con ELAIgG 15. Es bien sabido que la microglía participa en muchas patologías neuroinflamatorias, añadiendo estrés oxidativo y fase de progresión tardía en el mecanismo autónomo no celular de ALS16,17. Sin embargo, los datos con ALS IgG indicaron que estas células pueden no ser tan reactivas como los astrocitos a estos factores humorales de la inflamación de la ELA. Se han realizado varios estudios con astrocitos primarios de modelos murinos de ELA, no solo en cachorros sino también en animales sintomáticos, ya sea en el cerebro o en la médula espinal 18,19,20,21. Esto también es cierto para los cultivos primarios microgliales, aunque en menor medida que los astrocitos y principalmente de regiones cerebrales en la etapa embrionaria22,23,24.
Utilizamos imágenes de video de lapso de tiempo de Ca2+ en células en cultivo principalmente como un medio para seguir los transitorios intracelulares de este ion como un marcador fisiológico de excitotoxicidad. Así, mediante la caracterización biofísica de estos transitorios (amplitud, área bajo transitorio, tiempo de subida, frecuencia) el investigador puede obtener parámetros diagnósticos experimentales a partir de diversos modelos celulares de neurodegeneración. Por lo tanto, esta técnica ofrece una ventaja de una evaluación fisiológica cuantitativa de IgG como biomarcadores de enfermedades. Existe una gran cantidad de literatura sobre el papel de las IgG y el Ca2+ en la inducción de la ELA. La mayoría de estos estudios se realizaron mediante la inducción de ELA mediante la inyección de IgG de pacientes en animales de experimentación 25,26,27,28,29, que luego mostraron elevación intracelular de Ca 2+ y depósitos de IgG. Una línea de estudios exploró el efecto de las IgG de ELA en la sinapsis motora in vitro30,31,32. En el contexto anterior, la técnica presentada aquí pone el foco en las células gliales como actores importantes en el mecanismo autónomo no celular de la ELA y cuantifica su potencial respuesta excitotóxica a las IgG como factores humorales de neuroinflamación. Este enfoque puede tener una aplicación más amplia en la prueba de otros factores humorales como sueros enteros, LCR o citoquinas en diferentes sistemas de cultivo celular y en modelos celulares de inflamación general.
Este documento describe cómo preparar cultivos primarios de células gliales, astrocitos y microglía de las cortezas de ratas Sprague Dawley y cómo usar aún más estas células para estudiar la fisiopatología de la ELA con IgG derivada de sueros del paciente. Los protocolos se detallan para la carga de colorante de células cultivadas (Figura 1) y las grabaciones de cambios de Ca2+ en experimentos de imágenes de video de lapso de tiempo. Ejemplos de grabaciones de video mostrarán cómo reaccionan las células gliales a la IgG ALS en comparación con el ATP, este último activando los receptores de membrana purinérgica. Se muestra por primera vez un ejemplo de cómo los astrocitos aislados del cerebro de rata hSOD1G93A ALS reaccionan con una respuesta de Ca 2+ más pronunciada a la IgG de ELA en comparación con los controles no transgénicos y cómo relacionar este proceso con las diferencias en la operación de almacenamiento de Ca2+. También se muestra un ejemplo de imágenes de calcio en células microgliales con un desafío agudo con ELA IgG, con solo una respuesta modesta de calcio intracelular.

<table><tbody><tr><td>Tubo de 15 mL</td><td>Sarstedt, Alemania</td><td>62 554 502</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 2 mL</td><td>Sarstedt, Alemania</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de 21</td> G <td>Nipro, Japón</td><td>HN-2138-ET</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de 23 G</td><td>Nipro, Japón</td> Jeringa de 5 mL <td>HN-2338-ET</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nipro, Japón</td><td>SY3-5SC-EC</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio circular de 6 mm</td><td>Menzel Glasser, Alemania</td><td>630-2113</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 60 mm</td><td>ThermoFisher Sientific, Estados Unidos</td><td>130181</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, Alemania</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td>AxioObserver A1</td><td>Carl Zeiss, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich, Alemania</td><td>B6917</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma-Aldrich, Alemania</td><td>2110</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, Alemania</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Sigma-Aldrich, Alemania</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich, Alemania</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Anti burro-cabra AlexaFluor 647 IgG anticuerpo</td><td>Invitrogen, Estados Unidos</td><td>A-21447</td><td></td></tr><tr><td>Burro-anti ratón AlexaFluor 488 Anticuerpo IgG</td><td>Invitrogen, EE. UU.</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, Alemania</td><td>EDS-100G</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, Alemania</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>" Sistema de cámara digital evolve"-EM 512</td><td>Photometrics, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, EE. UU.</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Fiji ImageJ Software</td><td>Código abierto bajo la Licencia</td><td></td><td></td>Pública General GNU Juego de</tr><tr><td>filtros FITC</td><td>Chroma Technology Inc., EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sondas moleculares Fluo-4 AM</td><td>, EE. UU</td>. <td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-Iba1</td><td>Fujifilm Wako Chemicals, EE. UU.</td><td>011-27991</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biowest, Francia</td><td>P5455</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de intercambio de soluciones de alta velocidad</td><td>ALA Scientific Instruments, EE. UU</td><td></td><td></td></tr><tr>.<td>Incubadora</td><td>Memmert GmbH + Co. KG, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich, Alemania</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Software Matlab</td><td>Math Works, EE.UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti-GFAP</td><td>Merck Millipore, EE.UU.</td><td>MAB360</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 40-88</td><td>Sigma-Aldrich, Alemania</td><td>324590</td><td></td></tr><tr><td>Suero de burro normal</td><td>Sigma-Aldrich, Alemania</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich, Alemania</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina y Estreptomicina</td><td>ThermoFisher Sientific, EE. UU.</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich, Alemania</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich, Alemania</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Dihidrógeno fosfato de potasio</td><td>Reactivos Carlo Erba, España</td><td>Agitador de 471686</td><td></td></tr><tr><td>DELFIA PlateShake</td><td>PerkinElmer Life Sciencies, Estados Unidos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich, Alemania</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich, Alemania</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico heptahidratado</td><td>Carl ROTH GmbH</td><td>X987.2</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich, Alemania</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargine</td><td>Tocris Bioscience, Reino Unido</td><td>1138</td><td></td></tr><tr><td>Triton X - 100</td><td>Sigma-Aldrich, Alemania</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich, Alemania</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>Vapro Osmómetro de Presión de Vapor 5520</td><td>Wescor, ELITechGroup Inc., EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imágenes ViiFluor</td><td>Visitron System Gmbh, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de policromador VisiChrome</td><td>Visitron System Gmbh, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Configuración de alto rendimiento VisiView</td><td>Visitron System Gmbh, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lámpara de arco corto de xenón</td><td>Ushio, Japón</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cultivos primarios de astrocitos de rata y microglia y su uso en el estudio de la esclerosis lateral amiotrófica

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Este protocolo demuestra cómo preparar cultivos primarios de células gliales, astrocitos y microglía de las cortezas de ratas Sprague Dawley y cómo usar estas células con el fin de estudiar la fisiopatología de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en el modelo hSOD1G93A de rata. Primero, el protocolo muestra cómo aislar y cultivar astrocitos y microglia de cortezas de ratas postnatales, y luego cómo caracterizar y probar la pureza de estos cultivos mediante inmunocitoquímica utilizando el marcador de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de los astrocitos y el marcador microglial ionizado de la molécula adaptadora de unión al calcio 1 (Iba1). En la siguiente etapa, se describen métodos para la carga de colorantes (Fluo 4-AM sensible al calcio) de células cultivadas y las grabaciones de cambios de Ca2+ en experimentos de imágenes de video en células vivas.
Los ejemplos de grabaciones de vídeo consisten en: (1) casos de imágenes de Ca2+ de astrocitos cultivados expuestos agudamente a inmunoglobulina G (IgG) aislados de pacientes con ELA, mostrando una respuesta característica y específica en comparación con la respuesta al ATP como se demostró en el mismo experimento. Los ejemplos también muestran un aumento transitorio más pronunciado en la concentración de calcio intracelular evocado por ALS IgG en astrocitos hSOD1G93A en comparación con los controles no transgénicos; (2) imágenes de Ca 2+ de astrocitos cultivados durante una depleción de las reservas de calcio por thapsigargin (Thg), un inhibidor no competitivo de la ATPasa del retículo endoplásmico Ca 2+, seguida de una entrada de calcio operada por el almacén provocada por la adición de calcio en la solución de registro, lo que demuestra la diferencia entre la operación de almacenamiento de Ca2+ en hSOD1G93A y en astrocitos no transgénicos; (3) Las imágenes de Ca 2+ de la microglía cultivada muestran predominantemente una falta de respuesta a la IgG de ELA, mientras que la aplicación de ATP provocó un cambio de Ca2+. Este documento también enfatiza posibles advertencias y precauciones con respecto a la densidad celular crítica y la pureza de los cultivos, eligiendo la concentración correcta del colorante Ca2+ y las técnicas de carga de colorante.

Caracterización de diferentes tipos de células gliales en cultivo Por lo general, toma de 15 a 21 días producir astrocitos para experimentos, mientras que las células microgliales tardan de 10 a 15 días en crecer. Se realizó inmunotinción para evaluar la pureza celular del cultivo. La Figura 1 muestra la expresión del doble marcaje del marcador astrocítico GFAP y el marcador microglial Iba1 en cultivos respectivos.
Se sabe que las imágenes de c...

Presentamos aquí un protocolo sobre cómo preparar cultivos primarios de células gliales, astrocitos y microglía de cortezas de rata para imágenes de video de lapso de tiempo de Ca2+ intracelular para la investigación sobre fisiopatología de la esclerosis lateral amiotrófica en el modelo de rata hSOD1G93A .

Cultivos primarios de astrocitos de rata y microglia y su uso en el estudio de la esclerosis lateral amiotrófica

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Este protocolo permite revelar el patrón de señalización de calcio intercelular que caracteriza la respuesta de cada tipo de célula tanto en la salud como en la enfermedad. Esta técnica permite una caracterización biofísica rápida y detallada del comportamiento celular complejo. Planeamos usar esta señalización de calcio inducida por IgG como una huella digital para la medicina personalizada de enfermedades neuroinflamatorias.En el entorno de la vida real, no es fácil ver y seguir todos los procesos y eventos, especialmente los que suceden bajo el microscopio. Por lo tanto, los datos visuales son importantes. Después de decapitar a los cachorros de uno a tres días de edad, exponga el cráneo abriendo la piel con pequeñas tijeras en ángulo.Luego abra el cráneo cortando el foramen magnum hacia las órbitas y haga un corte perpendicular en la línea media. Retire el cerebro del cráneo y colóquelo en una placa de Petri que contenga PBS. Use la punta de los fórceps para rasgar las conexiones entre ambos hemisferios y separe los hemisferios con pinzas curvas empujando suavemente un hemisferio desde el centro hacia un lado.Use fórceps rectos y curvos para extraer las meninges rasgándolas cuidadosamente. Luego retire el hipocampo pellizcándolo con pinzas curvas y deséchelo, o úselo para otra preparación de cultivo celular. A continuación, transfiera la corteza a un tubo de 15 mililitros que contenga tres mililitros de PBS frío y homogeneice el tejido pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 10 a 15 veces con una punta de un mililitro.Centrifugar las células a 500 g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en tres mililitros de PBS frío pipeteando con una punta de un mililitro. Centrifugar una vez más, y resuspender el pellet en dos mililitros de DMEM completo suplementado con 10% FBS y antibióticos.Después de transferir el homogeneizado a un tubo de dos mililitros, pase el homogeneizado a través de agujas de calibre 21 y 23 para hacer una suspensión de células individuales. Vierta la suspensión celular preparada a partir de una corteza en una placa de Petri de 60 milímetros que contenga tres mililitros de DMEM completo y agite ligeramente la placa de Petri, de modo que la suspensión se distribuya uniformemente. Incubar las células en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono y 95% de aire a 37 grados centígrados.Para promover el crecimiento de astrocitos, retire los medios viejos y lave la célula con PBS precalentado para eliminar las células gliales sueltas y los rastros de FBS una vez que alcancen una confluencia del 70 al 80%. Luego tripsinizar la capa subyacente de astrocitos agregando un mililitro de solución de tripsina precalentada e incubar a 37 grados centígrados durante dos a cinco minutos. Use un microscopio para verificar si las células comienzan a desprenderse y agregue cuatro mililitros de DMEM completo.Recoja la suspensión celular y transfiérala a un tubo de 15 mililitros. Luego centrifugar el tubo a 500 g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio completo.Contar las células con un hemocitómetro. A continuación, prepare el plato de cultivo y agregue el medio de cultivo. Replaque las células a una densidad de 10 a la cuarta células por centímetro cuadrado en cinco mililitros de DMEM completo fresco y lave las células con DMEM completo antes de cada reemplazo de medios.Después de alcanzar el 70 al 80% de confluencia, repita la tripsinización y siembre cinco veces 10 a los terceros astrocitos en un cubrecubierto de vidrio circular recubierto de poli-L-lisina de siete milímetros. Deje que se adhieran durante 10 minutos y agregue DMEM completo. Úsalos en experimentos después de 48 horas.Después de preparar los cultivos microgliales, para promover la microglía, permita que las células gliales se confluenten y la microglía aparecerá en la parte superior de la capa de astrocitos después de 10 a 15 días. Agite la placa de Petri en un agitador orbital durante dos horas a 220 RPM. Ahora, lave ligeramente las células separadas y sueltas aspirando el sobrenadante con una punta de pipeta de un mililitro.Dispense suavemente el sobrenadante sobre la capa de células varias veces, asegurándose de cubrir toda la superficie de la capa celular durante este paso de lavado. Recoja el medio con las células desprendidas y transfiéralo a un tubo de 15 mililitros. Centrifugar, resuspender y contar las células como se demostró anteriormente.Semilla cinco veces 10 a la tercera microglia en un cubrecubierto de vidrio circular recubierto de poli-L-lisina de siete milímetros. Déjelos unidos durante 10 minutos y agregue DMEM completo. Úsalos en experimentos después de 48 horas.Para lavar el DMEM completo, transfiera una cubierta a un plato con solución extracelular. Preparar la solución de carga de colorante diluyendo un milimolar Fluo-4 AM con solución extracelular para lograr la concentración final de cinco micromolares. Coloque el cubreobjetos con células en la solución de carga de tinte durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, y lave las células en solución extracelular durante 20 minutos.Coloque el cubreobjetos en la cámara de grabación con un mililitro de solución de trabajo. Elija el campo de visión que tenga un número constante de celdas a lo largo del experimento. Comience la imagen y determine la línea de base adquiriendo el nivel basal de fluorescencia durante tres a cinco minutos.A continuación, detenga el flujo de la solución de trabajo y cambie a la solución de prueba durante el tiempo deseado. Entre cada solución de prueba, lave las células con un flujo constante de la solución de trabajo durante tres a cinco minutos. Mantenga el volumen de la solución en la cámara de grabación a un mililitro organizando una succión constante desde la parte superior de la solución.Elija el fotograma de intensidad de señal más alto y rodee una celda con la aplicación de herramienta Poligonal. Después de rodear todas las celdas en el campo adquirido, elija cinco regiones de interés en segundo plano utilizando la herramienta Círculo. Luego mida la intensidad media de la señal de una sola celda y el fondo para cada período de tiempo.Seleccione todas las regiones de interés y utilice el comando Multi-Measure en ROI Manager en ImageJ, o cualquier comando equivalente en software comercial. Después de importar los datos en el software MATLAB, promedie cinco ROI de fondo y reste el fondo promedio de cada fotograma de la intensidad media del ROI de los fotogramas adquiridos simultáneamente. Más tarde, analice la actividad del calcio determinando la amplitud del pico de calcio, el cambio integrado del transitorio de calcio, el tiempo hasta el pico, el tiempo de subida, el ancho medio y la frecuencia.GFAP se utiliza para visualizar astrocitos e Iba1 para visualizar microglia. Los astrocitos hSOD1G93A responden a la inmunoglobulina G de ELA con una mayor amplitud del transitorio de calcio, un cambio integrado general más considerable y un tiempo más corto hasta alcanzar el pico que los astrocitos no transgénicos. La respuesta a la inmunoglobulina G de ELA se distingue de la respuesta al ATP.Los astrocitos hSOD1G93A tenían un mayor nivel de iones de calcio en las reservas como lo revela el agotamiento de la tienda, lo que indica una sobrecarga de este ion. Se cultivaron microglías y se extrajo la intensidad media de fluorescencia a lo largo del tiempo. Las trazas de calcio de tres células representaron que solo una célula respondió a la inmunoglobulina G de ELA, mientras que todas las células respondieron al ATP.Las imágenes pseudo-color representaron la intensidad de fluorescencia y la línea de base en respuesta a ALS, IgG y ATP. Las células deben cargarse adecuadamente y los parámetros del sistema de imágenes deben ajustarse adecuadamente, de modo que la señal no se separe durante el experimento. Junto con la emisión de calcio, se puede realizar un pinzamiento del parche.Por lo tanto, se puede obtener una imagen más completa de la correlación entre las diferentes corrientes de iones de membrana y las emisoras de calcio. La comprensión de la homeostasis intracelular del calcio es de importancia esencial para la exploración de varias respuestas a estímulos naturales, estresantes y externos.

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Investigación

JoVE Journal

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Neurociencia

Aquí les ofrecemos un protocolo para el cultivo de neuronas de rata cortical en presencia de una capa alimentadora glial. Los cultivos de neuronas de establecer la polaridad y la creación de sinapsis, y se puede separar de la glía para su uso en diversas aplicaciones, tales como la electrofisiología, imágenes de calcio, los ensayos de supervivencia de las células, inmunocitoquímica, y ADN / ARN / aislamiento de las proteínas.

Bilaminar Co-cultivo de neuronas de rata primaria cortical y la glía

Aislamiento de la microglía primaria a partir de la heterogeneidad celular del cerebro es esencial para investigar su papel en las dos condiciones fisiológicas y patológicas. Este protocolo describe un aislamiento mecánico y técnica mixta de cultivo celular que proporciona un alto rendimiento y alta pureza, viables células primarias microgliales...

El aislamiento de la microglía Primaria cultivos mixtos de células gliales del tejido neonatal cerebro de rata

El video muestra una técnica para cultivar astrocitos primarios de la corteza de la rata. La corteza se disocia mecánicamente para obtener una suspensión celular glial homogénea, que luego se coloca en placas recubiertas de polipéptidos para promover la proliferación selectiva de astrocitos. Posteriormente, los astrocitos se disocian enzimáticamente de las placas y se transfieren a medios frescos, lo que permite el cultivo de astrocitos puros.

Generación de un cultivo primario de astrocitos a partir del cerebro de una cría de rata

Este video muestra un método para aislar y cultivar microglía de cerebros de ratas. Consiste en separar la microglía de otras células neuronales y no neuronales mediante placas recubiertas con un anticuerpo monoclonal específico para la microglía.

Aislamiento y cultivo de microglía a partir de cerebros de rata utilizando medios sin suero

Los astrocitos se han reconocido para ser versátiles células que participan en los procesos biológicos fundamentales que son esenciales para el desarrollo normal del cerebro y la función, y la reparación del sistema nervioso central. Aquí presentamos un procedimiento rápido para obtener cultivos puros de astrocitos de ratón para estudiar la biología de esta clase importante de centrales células del sistema nervioso.

Aislamiento y cultivo de astrocitos corticales de ratones

Los astrocitos fenotípicamente salvajes y las células madre neurales recolectadas de ratones modificados con alelos oncogénicos condicionales floxados y transformados a través de la recombinación mediada por Cre viral se pueden utilizar para modelar la patogénesis del astrocitoma in vitro e in vivo mediante la inyección ortotópica de células transformadas en cerebros de compañeros de camada singénicos e inmunocompetentes.

Modelado astrocitoma Patogénesis In Vitro Y En Vivo Uso cortical astrocitos o células troncales nerviosas de ratones condicionales, Genéticamente Manipulados

El desarrollo del dolor neuropático implica cambios patológicos de las células gliales de la médula espinal. Se carece de un sistema de cultivo glial fiable derivada de tejido de la médula espinal adulta y diseñado para el estudio de estas células in vitro. Por lo tanto, se muestra aquí cómo establecer cultivos mixtos gliales primarios a partir de tejido de médula espinal de ratón adulto.

Preparación de mezcla de culturas gliales primarios de ratón adulto espinal tejido del cordón

El protocolo AWESAM descrito aquí es óptimo para el cultivo de astrocitos murinos en aislamiento de otras células del cerebro de una manera rápida, sencilla y de bajo costo. Los astrocitos AWESAM exhibición espontáneo Ca2 + señalización, morfología y gene expresión perfiles similares a los astrocitos en vivo.

Cultivo In Vivo-como astrocitos murinos mediante el protocolo AWESAM rápido, sencillo y barato

Esfuerzos para comprender la función microglial en detalle han impedido por la falta de modelos de cultura microglial que recapitular las propiedades de microglia maduros en vivo . Este protocolo describe un acercamiento aislamiento y cultura diseñado para mantener la supervivencia robusta de microglia altamente ramificados de rata maduro medio definido en condiciones.

Aislamiento y cultivo de Microglia roedor para promover una dinámica ramifican morfología en medio libre de suero

Describimos un método para diferenciar astrocitos y neuronas derivados pluripotentes inducidos por humanos de la médula espinal y su cocultivo para el registro electrofisiológico.

Establecimiento de una plataforma electrofisiológica para modelar la ELA con astrocitos y neuronas derivados de células madre pluripotentes humanas específicas de la región

Este protocolo describe el aislamiento de astrocitos y microglía purificados de la médula espinal de ratones adultos, lo que facilita aplicaciones posteriores como el análisis de ARN y el cultivo celular. Incluye métodos detallados de disociación celular y procedimientos diseñados para mejorar tanto la calidad como el rendimiento de las células aisladas.

Aislamiento de astrocitos puros y microglía de la médula espinal de ratón adulto para ensayos in vitro y estudios transcriptómicos

Aprende a preparar cultivos primarios de astrocitos y microglia de rata para estudiar la señalización de calcio intracelular en el contexto de la esclerosis lateral amiotrófica utilizando el modelo hSOD1 G93A.

Cultivos primarios de astrocitos de rata y microglia y su uso en el estudio de la esclerosis lateral amiotrófica

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