Pruebas genéticas preimplantacionales para aneuploidías en una plataforma de secuenciación de próxima generación basada en semiconductores

Este protocolo presenta el procedimiento desde la amplificación de una sola célula hasta los datos finales de informes en las pruebas genéticas preimplantacionales para la aneuploidía en una plataforma de secuenciación de próxima generación basada en semiconductores. Este procedimiento puede ayudar a los espectadores a tener una buena comprensión del flujo de trabajo experimental de la secuenciación PGT-A y replicar esta técnica en un laboratorio de diagnóstico con una plataforma NGS basada en semiconductores. Comience pipeteando 25 microlitros de productos de amplificación del genoma completo y transfiriéndolos a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros precargado con 25 microlitros de agua libre de nucleasa.

Vórtice y mezcla las perlas de purificación de ADN. Alícuota 50 microlitros de esta solución en cada tubo de muestra. Vórtice y centrífuga brevemente durante cinco segundos.

Coloque el tubo durante cinco minutos a temperatura ambiente para el proceso de unión al ADN. Inserte el tubo centrífugo de 1,5 mililitros en una rejilla magnética. Luego, espere hasta que todas las cuentas magnéticas sean atraídas a la pared lateral del tubo.

Transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 mililitros. Evite pipetear las cuentas. Según el volumen de muestra original.

Pipetear 30 microlitros de perlas magnéticas, vórtice y centrífuga brevemente durante cinco segundos. Coloque el tubo durante cinco minutos a temperatura ambiente para el proceso de unión al ADN. Inserte los tubos de centrífuga de 1,5 milímetros en el bastidor magnético.

Luego, espere hasta que todas las perlas magnéticas sean atraídas por la pared lateral del tubo. Retire y deseche con cuidado el sobrenadante. Evite pipetear las cuentas.

Pipetear 300 microlitros de etanol al 70% en el tubo de centrífuga de 1,5 mililitros. Luego gire suavemente el tubo dos veces en un ángulo de 180 grados y mueva las perlas a lo largo de la pared del tubo para un lavado completo. Pipetear y desechar el sobrenadante.

Evite pipetear las cuentas. Repita el procedimiento de lavado una vez. Coloque una nueva placa de amplificación en el sistema una vez que se complete el programa limpio.

Inserte los tubos de recolección, cada uno precargado con 150 microlitros rompiendo la solución dos en el rotor, luego coloque el puente en los tubos de recolección. Agregue el aceite de reacción a la mitad del tubo y la solución de rotura del emulsionante a un tercio del tubo. Coloque un nuevo filtro para la preparación de plantillas en un estante de tubos con el portal de muestras colocado hacia arriba.

Vortex la solución durante cinco segundos y centrifugar brevemente durante cinco segundos. Luego transfiera la solución al portal de muestras del filtro después de pipetear 800 microlitros tres veces. Centrifugar el tubo para disminuir las burbujas antes de la última inyección.

Evite inyectar aire en el filtro. Inyecte 200 microlitros de aceite de reacción dos, siguiendo la solución mezclada. Gire el portal de muestras del filtro hacia abajo y reemplace el lavado adaptado con el filtro.

Inserte la aguja de muestra en el orificio central de la tapa del rotor y luego presione la aguja hacia abajo. Haga clic en el botón Ejecutar en la pantalla y elija el programa de acuerdo con el kit correspondiente. A continuación, seleccione Asistido para comprobar todos los pasos.

Haga clic en Siguiente hasta que se inicie la ejecución. La carrera tardará aproximadamente 4,5 horas en terminar. Seleccione Siguiente cuando finalice el programa.

El sistema iniciará un proceso de centrifugación de 10 minutos. Después de la centrifugación, haga clic en el botón Abrir tapa y mueva los tubos de recolección a los bastidores. Si el procedimiento no pasa al siguiente paso en 15 minutos, presione el giro final para volver a centrifugar.

Retire el sobrenadante en el tubo de recolección, dejando 100 microlitros de solución en el tubo. Mezclar la muestra restante pipeteando y transferir la muestra al nuevo tubo centrífugo de 1,5 mililitros marcado OT. Al pipetear el sobrenadante, evite tocar el fondo del tubo a lo largo de los lados. Pipetear 100 microlitros de agua libre de nucleasa en cada tubo de recolección y transferir la solución al tubo OT lavado mediante pipeteo repetido.

Agregue 600 microlitros de agua libre de nucleasa al tubo OT para completar el volumen total de un mililitro. Vórtice durante 30 segundos en centrífuga a 15, 500 veces G durante ocho minutos. Retire suavemente el sobrenadante dejando 100 microlitros de solución en el tubo OT.

Use la punta para desechar la capa de aceite por completo. Agregue 900 microlitros de agua libre de nucleasa, vórtice durante 30 segundos y centrifugar a 15, 500 veces G durante ocho minutos. Retire el sobrenadante hasta que queden 20 microlitros de la solución y agregue la solución de resuspensión de la plantilla para completar el volumen de 100 microlitros.

Luego vortex durante 30 segundos y centrifugar brevemente durante dos segundos. Continúe con el siguiente paso dentro de las 12 horas posteriores al procesamiento de la muestra Cargue 100 microlitros de la biblioteca diluida, 130 microlitros de perlas C1, 300 microlitros de tres x solución de lavado de plantilla y 300 microlitros de la solución de fusión en las ocho tiras de pozo. Instale las ocho tiras de pozo en el módulo de enriquecimiento, cargue la punta de pipeteo y coloque el tubo de centrífuga de 200 microlitros en la posición de recolección.

Haga clic en Inicio para ejecutar el programa. Pipetear 55 microlitros de la solución de muestra e inyectarla en el orificio de muestra del chip. Coloque el chip en la centrífuga.

Mantenga la muesca hacia el exterior y el portal de muestras hacia el interior. Luego, equilibre con otro chip usado y centrifuga durante 10 minutos. Prepare la solución de carga como se describe en el texto manuscrito.

Sople 100 microlitros de aire en la solución espumante. Pipetear la solución repetidamente hasta que las burbujas estén en un estado denso y espumoso y mantenga el volumen de espuma a aproximadamente 250 microlitros. Coloque el chip en el banco después de la centrifugación.

Inyecte 100 microlitros de espuma en el orificio de muestra y retire la solución extruida en el portal de salida. Luego, centrifuga el chip brevemente durante 30 segundos. Repita este proceso una vez.

Inyecte 100 microlitros al 50% tampón de lavado dos veces y retire la solución extruida en el portal de salida después de cada inyección. Luego inyecte 100 microlitros al 50% de tampón de recocido tres veces y retire la solución extruida en el portal de salida después de cada inyección. Inyectar 65 microlitros al tampón de reacción enzimática al 50%, evitando burbujas y retirar la solución extruida en el portal de salida.

Estabilice el chip cargado a temperatura ambiente durante cinco minutos e instale el chip en el portal del chip secuenciador. Elija el programa planificado, verifique la información y comience la ejecución. La ejecución representativa obtuvo un total de 17,6 gigabytes de datos y la tasa de carga total de la partícula de la esfera de iones fue del 88% en los pozos totales del chip.

El mapa de calor confirmó incluso la carga de la muestra en el área total del chip. El 77% del total de lecturas fueron utilizables. Todos los pozos cargados con ISP mostraron un enriquecimiento de plantillas del 100% en el que el 78% fueron clonales.

De todas las plantillas clonales, el 97% fueron calificadas como la biblioteca final. La longitud promedio de la lectura fue de 177 pares de bases, mientras que la mediana y la moda fueron 176 y 174 pares de bases, respectivamente. Los recuentos máximos de timina, citosina y adenina en las plantillas fueron de aproximadamente 76 por encima de la línea de corte calificada de 50.

En todos los pozos direccionables con ISP activos, el 99,5% calificó como biblioteca construida y el 20% de las bibliotecas policlonales y de baja calidad se filtraron, mientras que el 76,6% de los ISP fueron calificados para un análisis adicional. El resultado de la varianza del número de copias de una sola muestra representó una trisomía mosaico de 182,16 pares de megabases de P 16,3 a Q 35,2 en el cromosoma cuatro y un segmento de monosomía de 33 puntos 13 pares de megabases de Q 11,1 a Q 13,33 en el cromosoma 22. Al realizar la selección de fragmentos, los intervalos de tiempo entre los pasos deben modificarse de acuerdo con el tamaño de las muestras en el mismo lote para evitar la exposición excesiva y la falta de exposición de las muestras frontales y traseras.