Name: Un ensayo reportero para analizar la maduración intrónica de microARN en células de mamíferos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Aprende un ensayo reportero para analizar la maduración de microARN en células de mamíferos mediante luciferasa. Este método permite estudiar el efecto de proteínas reguladoras en la biogénesis del microARN.

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Los autores agradecen a E. Makeyev (Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur) por las células HeLa-Cre y los plásmidos pRD-RIPE y pCAGGS-Cre. Agradecemos a Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes y Anselmo Moriscot por su apoyo.

En la figura 1 se muestra una descripción general del protocolo descrito aquí.
1. Construcción de plásmidos
<ol><li>pCAGGS-Cre: Este plásmido fue proporcionado por el Dr. E. Makeyev21.</li>
	<li>pRD-miR-17-92:<ol><li>Amplíe el pre-miR-17-92 por PCR utilizando 0,5 μM de cada cebador específico (Tabla de materiales), 150 ng de ADNc, 1 mM dNTPs, 1x tampón Taq PCR y 5 U de ADN polimerasa Taq de alta fidelidad. Realice una reacción de PCR de control sin plantilla (use agua en lugar de ADNc) para verificar la contaminación del ADN.</li>
		<li>Ligue el producto de PCR en pRD-RIPE (amablemente proporcionado por el Dr. E. Makeyev, Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur)21 dentro del intrón entre los sitios de restricción EcoRI y EcoRV utilizando ADN ligasa, creando pRD-miR-17-92. Confirme la integridad de la secuencia mediante la secuenciación de Sanger.</li>
	</ol></li>
	<li>pmiRGLO-RAP-IB<ol><li>Diseñe cebadores delanteros e inversos flanqueados por sitios de restricción XhoI / XbaI y con un sitio de restricción NotI en el interior. Mezclar cantidades equimolares de cebadores directos e inversos e incubar la mezcla a 90 °C durante 5 min, luego transferir a 37 °C durante 15 min. Como controles, use cebadores con secuencias de objetivos codificadas (Tabla de materiales).</li>
		<li>Dividir los fragmentos recocidos usando enzimas de restricción XhoI/XbaI y ligarlos aguas abajo de la secuencia luc2 en pmiR-GLO, generando construcciones reporteras pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR (Luc-RAP-1B) y pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR (Luc-scrambled). Confirmar la ligadura con escote NoI. NOTA: Asegúrese de que los voladizos creados después del recocido de cebador sean complementarios al vector después de la reacción de escisión.</li>
	</ol></li>
	<li>pFLAG-HuR<ol><li>Para generar un plásmido de sobreexpresión de HuR, amplíe la secuencia de HuR con cebadores específicos. Mezcle 300 ng de ADNc, 0,5 μM de cada cebador específico, 1 mM de mezcla de dNTPs, 1x tampón de PCR y 5 U de ADN polimerasa Taq de alta fidelidad.</li>
		<li>Ligate el producto de PCR en pGEM-T y confirma la integridad de la secuencia de ADN mediante secuenciación de Sanger. Elimine el fragmento HuR de pGEM-T y subclónelo en el vector de expresión de mamíferos pFLAG-CMV-3 para generar el vector pFLAG-HuR.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cultivo celular
NOTA: La línea celular HeLa-Cre fue un regalo del Dr. E. Makeyev21, y la célula de cáncer papilar de tiroides (BCPAP) fue amablemente proporcionada por el Dr. Massimo Santoro (Universidad "Federico II", Nápoles, Italia). Las células HeLa, las células papilares de cáncer de tiroides (BCPAP) y HEK-293T se utilizaron para sobreexpresar HuR.
<ol><li>Mantener las células en DMEM/glucosa alta suplementada con suero bovino fetal al 10%, piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 200 mM y 1x penicilina-estreptomicina (100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina) en placas de Petri de 100 mm, a menos que se indique lo contrario. Incubar las células a 37 °C en una incubadora humidificada en atmósfera controlada (5%CO2).</li>
	<li>Incubar las células adherentes con tripsina/EDTA (mezcla de solución al 0,5%) a 37 °C durante 3-5 min. Déjelos separarse de la placa (el período de incubación puede variar según el tipo de célula).</li>
	<li>Realice las transfecciones con un reactivo de transfección a base de lípidos siguiendo las instrucciones del fabricante. Asegúrese de que los cultivos celulares sean aproximadamente 70% confluentes. Use cantidades similares de ADN para todas las combinaciones de transfección, como se describe a continuación, agregando los ADN apropiados. Realizar experimentos de transfección en réplicas.<ol><li>Mezclar 200 ng de ADN y 1,25 μL de reactivo de transfección en 100 μL del medio de cultivo. Agregue la mezcla de transfección a las células. Incubar las células con las mezclas de transfección durante 4 h a 37 °C. Luego, reemplace el medio con un medio que contenga 10% de FBS e incube durante otras 24 h antes de agregar los antibióticos para la selección.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Sobreexpresión de HuR
<ol><li>Transfecte pFLAG-HuR y vacíe pFLAG en HeLa. Seleccionar células aumentando la concentración de genética (G418) (1 μg/mL) de 100 μg/mL a 1000 μg/mL, generando líneas celulares estables.</li>
	<li>Confirme la sobreexpresión con PCR cuantitativa utilizando cebadores específicos para el ARNm de HuR, como se describe en el paso 7.</li>
</ol>4. Aislamiento total de ARN
<ol><li>Use celdas recién recolectadas. Tripsinizar al 70% de cultivos celulares confluentes (para este ensayo, se utilizaron células HeLa-Cre), como se describe en el paso 2.2.</li>
	<li>Recoger el pellet celular por centrifugación durante 5 min a 500 x g a 4 °C y lavarlo con 1x PBS (solución salina tamponada con fosfato); Repita la centrifugación.</li>
	<li>Resuspender el pellet celular en 1 ml de 1x PBS y transferirlo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.</li>
	<li>Centrifugar durante 5 min a 500 x g a 4 °C.</li>
	<li>Pese el pellet de celda seca y ajuste los volúmenes y el tamaño de los tubos en consecuencia. 1 mg de células produce aproximadamente 1 μg de ARN total.</li>
	<li>En una campana, agregue 500-1,000 μL de fenol / cloroformo al pellet celular (idealmente 750 μL por 0.25 g de células) y homogeneícelo pipeteando hacia arriba y hacia abajo y mezclándolo con el vórtice.</li>
	<li>Incubar la mezcla durante 5 min a temperatura ambiente (20 °C a 25 °C) para permitir la disociación completa de los complejos de nucleoproteínas.</li>
	<li>Centrifugar la muestra a 500 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añada 200 μL de cloroformo por 1 ml de fenol:cloroformo utilizado. Tapa los tubos de muestra de forma segura.</li>
	<li>Mezclar vigorosamente durante 15 s (a mano o brevemente vórtice a una velocidad más baja) e incubar a temperatura ambiente (20 °C a 25 °C) durante 2 min a 3 min.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.</li>
	<li>Compruebe la presencia de una fase inferior de fenol-cloroformo rojo, una fase intermedia y una fase acuosa superior incolora. El ARN permanece en la fase acuosa superior. En una campana, recoger la fase acuosa, evitando entrar en contacto con la fase intermedia, y transferir a un tubo nuevo.</li>
	<li>Precipitar ARN mezclando la fase acuosa con 400 μL de isopropanol de grado molecular (relación 1:1 a fenol/cloroformo utilizado) y 2 μL de glucógeno en cada tubo (ayudará a visualizar la presencia del pellet).</li>
	<li>Mezclar vigorosamente a mano u homogeneizar con la punta durante ~10 s. Incubar durante 15 min o durante la noche a -20 °C.</li>
	<li>Centrifugar la muestra a 12.000 g durante 20 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.</li>
	<li>Lave el pellet de ARN agregando 3 volúmenes de etanol al 100% (aproximadamente 1 ml, diluido con agua DEPC) y mezcle la muestra mediante vórtice hasta que el pellet se libere y flote desde el fondo.</li>
	<li>Centrifugar a 7.500 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Lave el pellet de ARN 1x agregando 1 ml de etanol al 75% y mezcle la muestra por vórtice hasta que el pellet se libere y flote desde el fondo. Repita la centrifugación como se describe en el paso 4.17.</li>
	<li>Realice un centrifugado adicional de 5 s para recoger el líquido residual del lado del tubo y eliminar cualquier líquido residual con una pipeta sin alterar el pellet.</li>
	<li>Seque brevemente al aire el pellet de ARN abriendo la tapa del tubo a temperatura ambiente durante 3-5 minutos y disuelva el pellet de ARN en 20-50 μL de agua tratada con DEPC libre de RNasa. Incubar el ARN durante 10 min a 55-60 °C para facilitar la resuspensión del pellet.</li>
</ol>5. Determinación de la concentración y calidad total de ARN
<ol><li>Determinar la concentración de ARN midiendo la absorbancia a 260 nm y 280 nm utilizando un espectrofotómetro. Obtenga datos espectrales completos antes de utilizar las muestras en aplicaciones posteriores.</li>
	<li>Controle la calidad del ARN resolviendo 800-1000 ng en un gel de agarosa al 1,5% utilizando tampón TBE 0,5X (45 mM de base Tris, 45 mM de ácido bórico, 1 mM de EDTA). El ARN total se separa en dos bandas que se refieren a los ARNr 28S y 18S.<ol><li>Haga todos los reactivos y lave todo el equipo utilizado para hacer funcionar el gel con agua tratada con DEPC. El agua tratada con DEPC se prepara en la campana agregando 1 ml de dietilpirocarbonato a 1000 ml de agua ultrapura. Incubar durante ~2 h a temperatura ambiente o a 37 °C y en autoclave. Guarde este producto a temperatura ambiente hasta por 10 meses. NOTA: La electroforesis de los ARN totales de mamíferos conduce a la separación de los ARNr 28S y 18S en una proporción de aproximadamente 2:1. Las bandas deben estar intactas y visibles como dos bandas afiladas. El ARN degradado dará lugar a bandas borrosas.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Transcripción inversa
<ol><li>Establezca la reacción de transcripción inversa utilizando 1 μg de ARN total.</li>
	<li>Realizar la transcripción inversa (RT) utilizando la enzima transcriptasa inversa (consulte la Tabla de materiales) y cebadores decámeros aleatorios de 50 ng/μL.<ol><li>Mezclar ARN, cebadores aleatorios y 1 mM de mezcla de dNTP (10 mM) en 10 μL. Incubar a 65 °C durante 5 min y en hielo durante 1 min. Agregue los siguientes reactivos: 1x tampón RT, 5 mM MgCl2, 10 mM DTT, 40 U de inhibidor de RNasa y 200 U de transcriptasa inversa.</li>
		<li>Incubar durante 10 min a 25 °C y durante 1 h a 50 °C (las temperaturas pueden cambiar si se utilizan diferentes enzimas). Terminar la reacción incubando a 85 °C durante 5 min. Los ADNc se pueden almacenar a -20 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>7. PCR cuantitativa
<ol><li>Para ensamblar la reacción en un volumen final de 15 μL, mezcle 3 μL de ADNc (100 ng / μL), 3.2 pmol de cada cebador, 6 μL de mezcla maestra que contenga los dNTP y la enzima, y 2.8 μL de agua ultrapura. NOTA: Utilice cebadores para genes constitutivos endógenos como controles (genes de limpieza) para normalizar los niveles de expresión de ARNm y miARN de HuR. β-Actina y snRNA U6 (RNU6B) son opciones disponibles para la normalización de ARNm y miRNAs, respectivamente, pero otros genes también pueden ser adecuados dependiendo del caso.</li>
	<li>Cuantificar los niveles de expresión utilizando el método delta-delta Ct (2-ΔΔCt)20.</li>
</ol>8. El ensayo del reportero
<ol><li>Células utilizadas para el ensayo<ol><li>Transfectar los plásmidos en células HeLa-Cre de la siguiente manera. Transfecto con pTK-Renilla (40 ng), luego pRD-miR-17-92, generando HeLa-Cre-miR-17-92, y seleccionando con 1 μg/mL de puromicina.</li>
		<li>Transfecto HeLa-Cre-miR-17-92-pTK-Renilla con pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR o pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR, por separado. Seleccione el uso de penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 μg/mL). Estas transfecciones generan Luc-RAP-1-B y Luc-scrambled.</li>
		<li>Transfecte las celdas con pFLAG-HuR o pFLAG vacío (paso 3).</li>
		<li>Proceder al cultivo celular, como se detalla en el paso 2.2., con HeLa-Cre miR-17-92-luc, HeLa-Cre miR-17-92-codificado, HeLa-Cre miR-17-92-HuR y HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc hasta aproximadamente el 80% de la confluencia. Inducir con 1 μL de doxiciclina (1 μg/ml) durante 30 min a 37 °C. Además, mantenga todas las células sin doxiciclina como controles, durante el mismo período. NOTA: La concentración final de doxiciclina depende de la línea celular de elección. Un exceso de doxiciclina puede ser tóxico para las células de mamíferos.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensayo luminiscente<ol><li>Para cuantificar y comparar diferentes intensidades de luminiscencia, utilice el kit de ensayo Dual-luciferase reporter. Descongele las soluciones de ensayo de luciferasa y déjelas a temperatura ambiente antes de comenzar el ensayo.</li>
		<li>Prepare la mezcla Stop y Glo (tubos de tapa azul) mezclando 200 μL del sustrato en 10 ml de tampón II del ensayo de luciferasa. Prepare la mezcla LAR II (tubos de tapa verde) mezclando 10 ml de Luciferase Assay Buffer II en el vial ámbar de Luciferase Assay Substrate II y agite bien.</li>
		<li>Transfiera las soluciones a tubos centrífugos de 15 ml previamente identificados y protegidos de la luz. NOTA: Como alternativa, las soluciones pueden prepararse previamente en alícuotas de 1-2 ml y congelarse a −80 °C protegidas de la luz en papel de aluminio.</li>
		<li>Realizar las lecturas de luminiscencia utilizando un equipo como Synergy; medida expresada luciferasa como unidades de luz relativa (RLU).</li>
		<li>Exporte los resultados a una hoja de cálculo para su posterior análisis estadístico.</li>
		<li>Realizar la normalización de la actividad luciérnaga-luciferasa mediante el control Renilla (luciferasa/Renilla) y trazarla como unidades de luz relativa (RLU) en un gráfico. Repita esto para grupos con y sin inducción de doxiciclina.</li>
		<li>Calcular la media y el error estándar de la media (SEM). Realice una prueba t de Student o un ANOVA bidireccional seguido de la prueba posterior de Tukey para permitir la comparación grupal. Estos análisis están disponibles en un paquete como GraphPad Prism. Las diferencias en los valores de p < 0,05 se consideran significativas.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosha+promotes+splicing+of+a+pre-microRNA-like+alternative+exon%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon.</a> PLoS Genetics. 10 (5), 1004312(2014).</li>
<li>Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+control+of+HuR+function%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+RNA%22%5BJournal%5D)">Posttranslational control of HuR function.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).</li>
<li>Chang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELAVL1+regulates+alternative+splicing+of+eIF4E+transporter+to+promote+postnatal+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).</li>
<li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+therapeutics+targeting+the+mRNA-binding+protein+HuR+using+3DNA+nanocarriers+suppresses+ovarian+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth.</a> Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).</li>
<li>Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HuR+regulates+cyclin+A+and+cyclin+B1+mRNA+stability+during+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation.</a> The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).</li>
<li>Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-16+modulates+HuR+regulation+of+cyclin+E1+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses.

El empalme de pre-ARNm es un proceso importante para la regulación de la expresión génica, y su control puede desencadenar fuertes efectos sobre las modificaciones fenotípicas celulares22,23. Más del 70% de los miRNAs se transcriben a partir de intrones en humanos, y planteamos la hipótesis de que su procesamiento y maduración podrían facilitarse mediante el empalme de proteínas reguladoras24,25. Desarrol...

El empalme de ARNm precursor es un proceso importante para la regulación de la expresión génica en eucariotas1. La eliminación de intrones y la unión de exones en ARN maduro es catalizada por el espliceosoma, un complejo ribonucleoproteico de 2 megadaltones compuesto por 5 snRNAs (U1, U2, U4, U5 y U6) junto con más de 100 proteínas 2,3. La reacción de empalme ocurre co-transcripcionalmente, y el espliceosoma se ensambla en cada nuevo intrón guiado por el reconocimiento de los sitios de empalme conservados en los límites exón-intrón y dentro del intrón4. Diferentes intrones pueden tener diferentes velocidades de empalme a pesar de la notable conservación del complejo de espliceosoma y sus componentes. Además de las diferencias en la conservación del sitio de empalme, las secuencias reguladoras distribuidas en intrones y exones pueden guiar las proteínas de unión al ARN (RBP) y estimular o reprimir el empalme 5,6. HuR es una RBP expresada ubicuamente y es un factor importante para controlar la estabilidad del ARNm7. Resultados previos de nuestro grupo mostraron que HuR puede unirse a intrones que contienen miRNAs, lo que indica que esta proteína podría ser un factor importante para facilitar el procesamiento y la maduración de miRNA, lo que también conduce a la generación de isoformas de empalme alternativas 6,8,9.
Muchos microARN (miARN) se codifican a partir de secuencias intrónicas. Mientras que algunos son parte del intrón, otros se conocen como "mirtrones" y están formados por todo el intrón10,11. Los miRNAs son ARN cortos no codificantes, que van de 18 a 24 nucleótidos de longitud12. Su secuencia madura muestra complementariedad parcial o total con las secuencias diana en los ARNm, lo que afecta a las tasas de traducción y/o decaimiento del ARNm. Las combinaciones de miARN y dianas conducen a la célula a diferentes resultados. Varios miRNAs pueden conducir células a fenotipos pro o antitumorales13. Los miARN oncogénicos generalmente se dirigen a ARNm que desencadenan una característica supresora que conduce a un aumento de la proliferación, migración e invasión celular14. Por otro lado, los miARN supresores de tumores podrían dirigirse a ARNm oncogénicos o ARNm relacionados con el aumento de la proliferación celular.
El procesamiento y la maduración de los miRNAs también dependen de su origen. La mayoría de los miRNAs intrónicos son procesados con la participación del microprocesador, formado por la ribonucleasa Drosha y los cofactores proteicos12. Los mirtrones se procesan con la actividad del espliceosoma independientemente de Drosha15. Teniendo en cuenta la alta frecuencia de miARN que se encuentran dentro de los intrones, planteamos la hipótesis de que las proteínas de unión al ARN involucradas con el empalme también podrían facilitar el procesamiento y la maduración de estos miARN. En particular, el RBP hnRNP A2/B1 ya se ha asociado con el microprocesador y la biogénesis del miARN16. 
Hemos informado previamente que varias proteínas de unión a ARN, como hnRNPs y HuR, están asociadas con miRNAs intrónicos por espectrometría de masas17. La asociación de HuR (ELAVL1) con miRNAs del cluster intrónico miR-17-92 fue confirmada mediante inmunoprecipitación y análisis in silico 9. miR-17-92 es un grupo de miARN intrónico compuesto por seis miARN con mayor expresión en diferentes cánceres18,19. Este grupo también se conoce como "oncomiR-1" y está compuesto por miR-17, miR-18 a, miR-19 a, miR-20, miR-19 b y miR-92 a. miR-19 a y miR-19b se encuentran entre los miRNAs más oncogénicos de este grupo 19. El aumento de la expresión de HuR estimula la síntesis de miR-19a y miR-19b 9. Dado que las regiones intrónicas que flanquean este grupo están asociadas con HuR, desarrollamos un método para investigar si esta proteína podría regular la expresión y maduración de miR-19a y miR-19b. Una predicción importante de nuestra hipótesis fue que, como proteína reguladora, HuR podría facilitar la biogénesis de miRNA, dando lugar a alteraciones fenotípicas. Una posibilidad era que los miRNAs fueran procesados por la estimulación de HuR pero no fueran maduros y funcionales y, por lo tanto, los efectos de la proteína no impactaran directamente en el fenotipo. Por lo tanto, desarrollamos un ensayo de splicing reporter para investigar si un RBP como HuR podría afectar la biogénesis y la maduración de un miRNA intrónico. Al confirmar el procesamiento y la maduración del miARN, nuestro ensayo muestra la interacción con la secuencia objetivo y la generación de un miARN maduro y funcional. En nuestro ensayo, acoplamos la expresión de un grupo de miARN intrónico con un plásmido luciferasa para verificar la unión al objetivo de miARN en células cultivadas.

<table><tbody><tr><td>Recombinant DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS-Cre (plásmido codificador de Cre)</td><td></td><td></td><td>Un amable regalo de E. Makeyev de Khandelia et al., 2011</td></tr><tr><td>pFLAG-HuR</td><td></td><td></td><td>Generado durante este trabajo</td></tr><tr><td>pmiRGLO-RAP-IB</td><td></td><td></td><td>Generado durante este trabajo</td></tr><tr><td>pmiRGLO-scrambled</td><td></td><td></td><td>Generado durante este trabajo</td></tr><tr><td>pRD-miR-17-92</td><td></td><td></td><td>Generado durante este trabajo</td></tr><tr><td>pRD-RIPE-donante</td><td></td><td></td><td>Un amable regalo de E. Makeyev de Khandelia et al., 2011</td></tr><tr><td>pTK-Renilla</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-B-actin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5316</td><td></td></tr><tr><td>anti-HuR</td><td>Señalización celular</td><td>mAb&nbsp; 12582</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680CW IgG anti-ratón para cabras</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW IgG anti-conejo para cabras</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>929-70020</td><td></td></tr><tr><td>Modelos experimentales: Líneas celulares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa-Cre</td><td></td><td></td><td>Un amable regalo de E. Makeyev de Khandelia et al., 2011</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92</td><td></td><td></td><td>Generados durante este trabajo</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-HuR</td><td></td><td></td><td>Generados durante este trabajo</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc</td><td></td><td></td><td>Generados durante este trabajo</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-luc</td><td></td><td></td><td>Generados durante este trabajo</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-scrambled Generados</td><td></td><td></td><td>durante este trabajo</td></tr><tr><td>Chemicals y Péptidos</></td><td></td><td></td><td></td>DMEM fuerte</tr><tr><td>/DMEM/alto contenido de glucosa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>BioBasic</td><td>MB719150</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de ensayo de luciferasa de doble glo</td><td>Promega</td><td>E2940</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0271</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0301</td><td></td></tr><tr><td>Geneticina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E859-EG</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pFLAG-CMV&trade;-3 Vector de expresión</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6783</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA polimerasa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10966-030</td><td></td></tr><tr><td>pmiR-GLO</td><td>Promega</td><td>E1330</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>RNAse OUT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>752899</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV</td><td>kit Thermo Fisher Scientific</td><td>18091050</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo Trizol-LS</td><td>Thermo Fisher</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>tripsina/EDTA 10X</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>Promega</td><td>R616A</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotides</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>forward RAP-1B pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG CTACTATATCAGTTTGCACAT</td><td></td></tr><tr><td>reverso RAP-1B pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>CTAGATGTGCAAACTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC</td><td></td></tr><tr><td>revuelto hacia adelante pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA GCTACTATATCAGGGGTAAAAT</td><td></td></tr><tr><td>revuelto inverso pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>CTAGATTTTACCCCTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC</td><td></td></tr><tr><td>adelante HuR pFLAG</td><td>Exxtend</td><td>GCCGCGAATTCAATGTCTAAT GGTTATGAAGAC</td><td></td></tr><tr><td>reverso HuR pFLAG</td><td>Exxtend</td><td>GCGCTGATATCGTTATTTGTG GGACTTGTTGG</td><td></td></tr><tr><td>avance pre-miR-1792 pRD-RIPE</td><td>Exxtend</td><td>ATCCTCGAGAATTCCCATTAG GGATTATGCTGAG</td><td></td></tr><tr><td>reverso pre-miR-1792 pRD-RIPE</td><td>Exxtend</td><td>ACTAAGCTTGATATCATCATCTTG TACATTTAACAGTG</td><td></td></tr><tr><td>avance snRNA U6 (RNU6B)</td><td>Exxtend</td><td>CTCGCTTCGGCAGCACATATAC</td><td></td></tr><tr><td>snRNA inverso U6 (RNU6B)</td><td>Exxtend</td><td>GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG</td><td></td></tr><tr><td>adelante B-Actina qPCR</td><td>Exxtend</td><td>ACCTTCTACAATGAGCTGCG</td><td></td></tr><tr><td>inversa B-Actina qPCR</td><td>Exxtend</td><td>CCTGGATAGCAACGTACATGG</td><td></td></tr><tr><td>adelante HuR qPCR</td><td>Exxtend</td><td>ATCCTCTGGCAGATGTTTGG</td><td></td></tr><tr><td>HuR inverso qPCR</td><td>Exxtend</td><td>CATCGCGGCTTCTTCATAGT</td><td></td></tr><tr><td>adelante pre-miR-1792 qPCR</td><td>Exxtend</td><td>GTGCTCGAGACGAATTCGTCA GAATAATGTCAAAGTG</td><td></td></tr><tr><td>reverso pre-miR-1792 qPCR</td><td>Exxtend</td><td>TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC TCAACAGGCCG</td><td></td></tr><tr><td>Software and Algorithms</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 8 para Mac OS</td><td>X Graphpad</td><td></td><td></td>https://www.graphpad.com</tr><tr><td>ImageJ</td><td>Institutos Nacionales de Salud</td><td>http://imagej.nih.gov/ij</td><td></td></tr></tbody></table>

un ensayo reportero para analizar la maduración intrónica de microarn en células de mamíferos

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

Los microARN (miARN) son moléculas cortas de ARN que están muy extendidas en eucariotas. La mayoría de los miARN se transcriben a partir de intrones, y su maduración involucra diferentes proteínas de unión al ARN en el núcleo. Los miARN maduros con frecuencia median el silenciamiento génico, y esto se ha convertido en una herramienta importante para comprender los eventos post-transcripcionales. Además de eso, se puede explorar como una metodología prometedora para las terapias génicas. Sin embargo, actualmente hay una falta de métodos directos para evaluar la expresión de miRNA en cultivos celulares de mamíferos. Aquí, describimos un método eficiente y simple que ayuda a determinar la biogénesis y maduración de miRNA a través de la confirmación de su interacción con secuencias objetivo. Además, este sistema permite separar la maduración exógena de miRNA de su actividad endógena utilizando un promotor inducible por doxiciclina capaz de controlar la transcripción de miRNA primario (pri-miRNA) con alta eficiencia y bajo costo. Esta herramienta también permite la modulación con proteínas de unión a ARN en un plásmido separado. Además de su uso con una variedad de miRNAs diferentes y sus respectivas dianas, se puede adaptar a diferentes líneas celulares, siempre que sean susceptibles de transfección.

Nuestra hipótesis inicial era que HuR podría facilitar la biogénesis intrónica de miARN al unirse a su secuencia de pre-miARN. Por lo tanto, la conexión de la expresión de HuR y la biogénesis del grupo miR-17-92 podría apuntar a un nuevo mecanismo que rige la maduración de estos miRNAs. La sobreexpresión de HuR tras la transfección de pFLAG-HuR se confirmó en tres líneas celulares diferentes: HeLa, BCPAP y HEK-293T (Figura 2). Como controles, se utilizaron células no transfectadas y...

Desarrollamos un ensayo informador de biogénesis de microARN intrónico para ser utilizado en células in vitro con cuatro plásmidos: uno con miARN intrónico, uno con el objetivo, uno para sobreexpresar una proteína reguladora y uno para Renilla luciferasa. El miARN se procesó y pudo controlar la expresión de luciferasa uniéndose a la secuencia objetivo.

Un ensayo reportero para analizar la maduración intrónica de microARN en células de mamíferos

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

Nuestro protocolo aborda los efectos de las proteínas reguladoras de unión al ARN en la biogénesis y maduración del microARN, directamente de los cultivos celulares. El método que describimos se puede realizar con reactivos de cultivo celular comunes y es relativamente rápido. Este método puede ser importante para estudiar los efectos fenotípicos de los microARN y sus dianas en diferentes tipos de células eucariotas.Se pueden usar células normales o similares a enfermedades. Es importante elegir líneas celulares susceptibles de transfección, realizar controles adecuados de transfección e inducción para observar los cambios en la afinidad objetivo a través de la actividad luciferasa. Para empezar, mantener las células en DMEM, suplemento de alta glucosa en placas de Petri de 100 milímetros e incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada y en atmósfera controlada con 5% de dióxido de carbono.Para separar las células adherentes, incubarlas con solución de tripsina-EDTA a 37 grados centígrados durante tres a cinco minutos. Para realizar transfecciones, mezcle 200 nanogramos de ADN y 1,25 microlitros de reactivo de transfección en 100 microlitros del medio d

a-reporter-assay-to-analyze-intronic-microrna-maturation-mammalian

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

A continuación se describe un ensayo que emplea el poder de la microinyección, junto con...

Análisis de la cinética de exportación nuclear de ARNm en células de mamífero por microinyección

Los microARN (miRNA) son importantes reguladores de la expresión génica y se ha demostrado que juegan un papel importante en numerosos procesos biológicos. Para comprender mejor las interacciones entre UTR miRNA, hemos creado una colección de todo el genoma de tres periodistas UTR luciferasa se combina con un nuevo gen de luciferasa y reactivo de ensayo, el sistema de interruptor.

Objetivos la identificación de los microARN humanos con el sistema de ensayo con luciferasa LightSwitch reportero 3&#39;UTR-Construye y microRNA un imitador de las células adherentes

En este video, demostramos que en presencia de un inhibidor del fosfodiéster, el ciclo celular del ovocito se detiene en la profase-I, durante la cual los ARNm transcritos se almacenan en ausencia de traducción. Después de la liberación del inhibidor, se reanuda la maduración de los ovocitos y las células entran en metafase. La señal del ARNm reportero fusionado con el gen diana en la metafase-I indica la activación de la maquinaria de traducción y la expresión de proteínas.

El ensayo reportero de ovocitos individuales in vitro: una técnica para estudiar la regulación de la traducción del ARNm diana durante la maduración de ovocitos in vitro

El ensayo del reportero genético es una herramienta bien establecida y poderosa para diseccionar la relación entre las secuencias de ADN y sus actividades reguladoras de genes. El acoplamiento de los elementos reguladores candidatos a genes reporteros que llevan etiquetas de secuencia identificativa permite la paralelización masiva de estos ensayos.

Ensayos Reporteros Massively Parallel en células de mamífero cultivadas

Con la intención de caracterizar los cambios en los miRNAs en células madre neurales humanas diferenciadas (hNSCs) describimos la diferenciación de hNSC en un sistema tridimensional, la evaluación de los cambios en la expresión de microRNA por la matriz de PCR de miRNA, y el análisis computacional para la predicción de objetivos de miRNA y su validación por ensayo de luciferasa dual.

La diferenciación de una línea de células madre neurales humanas en las Tres Culturas de dimensiones, Genes Análisis de microARN y putativo objetivo

En este trabajo proponemos una estrategia para estudiar el efecto de un factor de transcripción de interés en el transcriptoma de microARN utilizando datos disponibles públicamente, recursos computacionales y datos de alto rendimiento de matrices de microARN después de transfectar células con ARN de horquilla pequeña (sh)dirigido a un factor de transcripción de interés.

Descripción de una regulación dependiente de factor de transcripción del transcriptoma MicroARN

Este informe describe un método rápido y confiable para la validación de blancos del mRNA de miRNAs celular. Los usos del método biotinilado sintético basado en la LNA de ácido nucleico bloqueado miRNA imita para capturar objetivo mRNA. Posteriormente, se emplean bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina para telecine blanco mRNA para la cuantificación por reacción en cadena de polimerasa qPCR.

Desplegable base de biotina de ensayo a validar mRNA miRNAs objetivos de celular

micro-RNAs (miRNAs) son cortas y altamente homólogas secuencias de ARN, que sirven como reguladores post-transcripcionales de mensajero RNAs (mRNAs). Los métodos actuales de detección de miRNA varían en sensibilidad y especificidad. Se describe un protocolo que combina en situ el hibridación y el immunostaining para la detección simultánea de moléculas miRNA y la proteína en secciones de tejido de corazón de ratón.

MiRNA de tejidos específicos perfiles de expresión en ratón corazón secciones usando el hibridación In Situ

Este protocolo utiliza una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) basada en sondas en tiempo real, un ensayo de sulforhodamine B (SRB), 3' regiones no traducidas (3' UTR) clonación, y un ensayo de luciferasa para verificar los genes diana de un miRNA de interés y para entender las funciones de los miRNAs.

Un protocolo in vitro para evaluar los niveles, funciones y genes objetivo asociados de MicroRNA en células tumorales

Este protocolo describe un análisis del reportero para estudiar la regulación de la traducción del mRNA en solos ovocitos durante la maduración in vitro.

Definición del programa de traducción del ARNm materno durante la maduración in vitro utilizando un solo ensayo de reportero de ovocitos

Este protocolo describe un ensayo de reportero de minigenes para monitorear el impacto de las mutaciones del sitio de empalme 5'en el empalme y desarrolla snRNA supresor U1 para el rescate de la inhibición del empalme inducida por la mutación. Las construcciones de snRNA U1 reportero y supresor se expresan en células HeLa, y el empalme se analiza por extensión de cebador o RT-PCR.

Un ensayo celular basado en reporteros para monitorear la eficiencia del empalme

Aprende un ensayo reportero para analizar la maduración de microARN en células de mamíferos mediante luciferasa. Este método permite estudiar el efecto de proteínas reguladoras en la biogénesis del microARN.

Un ensayo reportero para analizar la maduración intrónica de microARN en células de mamíferos

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