Name: Descifrando el mecanismo molecular del ensamblaje de histonas mediante la técnica de cortina de ADN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Descubre la técnica de cortina de ADN para estudiar interacciones proteína-ADN en tiempo real usando Schizosaccharomyces pombe. Este método de imagen de molécula única permite caracterizar la dinámica de la cromatina y el papel de Abo1 en el ensamblaje de histonas.

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Los autores agradecen el amable apoyo a Abo1 y Cy5-H3-H4 por parte del profesor Ji-Joon Song, Carol Cho, Ph.D., y Juwon Jang, Ph.D., en KAIST, Corea del Sur. Este trabajo cuenta con el apoyo de la Beca de la Fundación Nacional de Investigación (NRF-2020R1A2B5B01001792), el fondo de investigación intramuros (1.210115.01) del Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología de Ulsan y el Instituto de Ciencias Básicas (IBS-R022-D1).

1. Preparación de la celda de flujo
<ol><li>Prepare un portaobjetos de sílice fundida limpio que contenga patrones de nanozanjas siguiendo el informe publicado anteriormente25.<ol><li>Taladre dos orificios de 1 mm de diámetro en un portaobjetos de sílice fundida limpio (Figura 1A) con una broca recubierta de diamante (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Deposite 250 nm de aluminio grueso (Al) en el portaobjetos utilizando pulverización catódicade CC 32 (ver Tabla de Materiales) con 10 mTorr de gas argón.</li>
		<li>Aplicar una capa de 310 nm de espesor de poli(metacrilato de metilo) (PMMA) al 4% de 950K (ver Tabla de Materiales) a 4.000 rpm durante 1 min y hornear en una placa caliente a 180 °C durante 3 min.</li>
		<li>Dibuje los patrones de nanozanja en la capa de PMMA entre los dos orificios utilizando litografía de haz de electrones (ebeam)33 con una corriente de 0,724 nA a 80 kV. NOTA: La arquitectura y las dimensiones de los patrones de nanozanjas se muestran en la Figura 1A.</li>
		<li>Retire el PMMA expuesto al haz de agua sumergiendo los portaobjetos en la solución de revelado (proporción 1:3 de metil isobutil cetona e isopropanol, consulte la Tabla de materiales) durante 2 min.</li>
		<li>Grabe capas de Al con grabado iónico reactivo por plasma acoplado inductivamente (ICP-RIE) utilizando gases cloro (Cl2) y tricloruro de boro (BCl3). NOTA: Estos dos gases pueden eliminar el Al de las áreas expuestas al haz de e.</li>
		<li>Talle nanozanjas en los portaobjetos utilizando gases tetrafluoruro de azufre (SF4), tetrafluorometano (CF4) y oxígeno (O2) (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Retire la capa de Al restante sumergiendo los portaobjetos en un grabador de Al (revelador AZ 300 MIF, consulte la Tabla de materiales) durante 10 min.</li>
		<li>Después de la fabricación, enjuague los portaobjetos con agua desionizada y sonique en acetona durante 30 minutos con un sonicador tipo baño.</li>
		<li>Limpie los portaobjetos en una solución Hellmanex III al 2% (consulte la tabla de materiales) durante al menos 1 día con agitación magnética.</li>
		<li>Sonicar los portaobjetos en acetona durante 30 min y 1 M de NaOH durante 30 min sucesivamente.</li>
		<li>Enjuague los portaobjetos con agua desionizada y séquelos con un gas nitrógeno (N2).</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque un papel limpio (5 mm x 35 mm) en el centro de la cinta adhesiva de doble cara. Pega la cinta adhesiva sobre el portaobjetos para cubrir los dos agujeros y los nanopatrones con el papel.</li>
	<li>Elimine el papel con una cuchilla limpia (Figura 1A).</li>
	<li>Coloque un cubreobjetos de vidrio encima de la cinta adhesiva de doble cara y frote el cubreobjetos con la punta de una pipeta para formar una cámara microfluídica (Figura 1A).</li>
	<li>Coloque la celda de flujo ensamblada entre dos portaobjetos de microscopio y sujételos.</li>
	<li>Hornee la celda de flujo en un horno al vacío a 120 °C durante 45 min.</li>
	<li>Conecte el conector de fluido (Nanoport) para los análisis basados en chips (consulte la Tabla de materiales) a cada orificio abierto con una pistola de pegamento caliente y conecte las dos líneas de tubería de bloqueo Luer.</li>
	<li>Conecte una jeringa Luer lock que contenga 3 ml de agua desionizada y lave la cámara.</li>
	<li>Lave la cámara con 3 ml de tampón lipídico (20 mM de Tris-HCl, pH 8,0 y 100 mM de NaCl) a través de la conexión gota a gota . NOTA: La conexión gota a gota conecta todas las jeringas a la celda de flujo para evitar inyectar burbujas de aire en la cámara.</li>
	<li>Inyecte 1 ml de lípido biotinilado 0,04x en tampón lipídico en la cámara en dos tomas con 5 minutos de incubación por toma. NOTA: La preparación de 1x caldo lipídico biotinilado se describe en un informe publicado anteriormente34.</li>
	<li>Lavar la cámara con 3 ml de tampón lipídico e incubar durante 20 min para que la bicapa lipídica madure en la superficie del portaobjetos.</li>
	<li>Agregue 1 mL de tampón BSA (40 mM de Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM de NaCl, 2 mM de MgCl2 y 0.2 mg/mL de BSA) e incube durante 5 min para pasivar la superficie del portaobjetos. NOTA: Este paso puede reducir la unión inespecífica de proteínas a la superficie del portaobjetos.</li>
	<li>Inyecte 0,025 mg/ml de estreptavidina en 1 ml de tampón BSA con dos inyecciones y 10 minutos de incubación por inyección.</li>
	<li>Lave la estreptavidina residual con 3 ml de tampón BSA.</li>
	<li>Inyecte ~300 pM (30 μL) de ADN de fagos lambda biotinilados en 1 mL de tampón BSA en la cámara con dos disparos y 10 minutos de incubación por disparo. NOTA: La preparación de ADN lambda biotinilado se describe en un informe publicado anteriormente34.</li>
</ol>2. Conectar la celda de flujo al sistema microfluídico y cargarla en el microscopio
<ol><li>Prepare el tampón de imagen Abo1 (50 mM de Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM de NaCl, 1 mM de DTT, 1 mM de ATP, 2 mM de MgCl2, 1.6% de glucosa y 0.1x de gloxy, ver Tabla de Materiales). NOTA: Gloxy es un sistema de eliminación de oxígeno que reduce el fotoblanqueo de los tintes fluorescentes. La preparación de 100x gloxi stock con glucosa oxidasa y catalasa se describe en la Referencia35.</li>
	<li>Conecte una jeringa que contenga 10 ml de tampón de diagnóstico por imágenes a una bomba de jeringa y elimine las burbujas en todas las líneas de tubería del sistema microfluídico.</li>
	<li>Acople la celda de flujo preparada con el sistema microfluídico a través de una conexión gota a gota para evitar la inyección de burbujas en la celda de flujo (Figura 1B).</li>
	<li>Ensamble la celda de flujo y los soportes de la celda de flujo y monte el ensamblaje en un microscopio TIRF hecho a medida (Figura 1C). PRECAUCIÓN: Cuando la celda de flujo se coloca bajo el microscopio, ajuste cuidadosamente la altura de la lente del objetivo. La celda de flujo no debe tocar la lente del objetivo. Esto puede dañar la lente.</li>
	<li>Deje caer el aceite correspondiente al índice en el centro de la celda de flujo y coloque un prisma de paloma hecho a medida (consulte la Tabla de materiales) en la gota de aceite.</li>
</ol>3. Ensamblaje de histonas por Abo1 usando cortina de ADN
<ol><li>Mezclar 5 nM de Abo1 y 12,5 nM de dímero de histonas H3-H4 marcado con Cy5 (Cy5-H3-H4) (ver Tabla de Materiales) en 150 μL de tampón de imagen. Todas las proteínas se prepararon siguiendo el informe previamente publicado17.</li>
	<li>Incuba la mezcla en hielo durante 15 min. NOTA: Para evitar el fotoblanqueo de Cy5, la incubación debe realizarse en la oscuridad.</li>
	<li>Inyecte ~20 pM (2 μL) de colorante YOYO-1 en tampón de imagen a través de un bucle de muestra de 100 μL para teñir las moléculas de ADN lambda.</li>
	<li>Ejecute un software de imágenes (consulte la Tabla de materiales) y encienda el láser de 488 nm para verificar si las cortinas de ADN están bien formadas. NOTA: Si las cortinas de ADN están bien formadas, las moléculas de ADN, que se tiñen con YOYO-1, se muestran como líneas alineadas en una barrera en presencia de flujo. Las líneas estiradas retroceden y se difunden lejos de la barrera cuando se cierra el flujo.</li>
	<li>Inyecte 2 mL de tampón con alto contenido de sal (200 mM de NaCl y 40 mM de MgCl2) para eliminar el colorante YOYO-1 del ADN.</li>
	<li>Después de eliminar el colorante YOYO-1, inyecte la muestra de proteína preincubada.</li>
	<li>Cuando las proteínas lleguen a la cortina de ADN, apague la bomba de jeringa, cierre la válvula de cierre e incube 15 minutos para la carga de histonas por Abo1.</li>
	<li>Lave las proteínas Abo1 e histonas no unidas durante 5 min.</li>
	<li>Abra la válvula de cierre y reanude la inyección de flujo.</li>
	<li>Encienda el láser de 637 nm y obtenga imágenes de las proteínas fluorescentes mientras el flujo del tampón está activado.</li>
	<li>Apague transitoriamente el flujo tampón para verificar si las proteínas histonas están cargadas en el ADN (Figura 2C).</li>
	<li>Recolectar imágenes de cortinas de ADN con un programa de adquisición de imágenes (ver Tabla de Materiales). NOTA: Cuando el flujo de tampón se detiene transitoriamente, el ADN retrocede fuera del campo evanescente de reflexión interna total, y las proteínas marcadas con fluorescencia unidas al ADN desaparecen.</li>
</ol>4. Análisis de datos
<ol><li>Transforme las imágenes tomadas por el programa de adquisición de imágenes en formato TIFF como secuencias de imágenes. NOTA: Todos los datos se analizaron utilizando la Imagen J (NIH) como se describe en la Referencia20.</li>
	<li>Elige una sola molécula de ADN de las secuencias de imágenes y dibuja un quimógrafo. NOTA: El quimógrafo puede mostrar el cambio en la intensidad de fluorescencia de cada proteína histona unida a una sola molécula de ADN en función del tiempo.</li>
	<li>Cree el perfil de intensidad de fluorescencia a partir del cimógrafo y ajústelo con múltiples funciones gaussianas.</li>
	<li>Recopile las coordenadas centrales de los picos del perfil de intensidad de fluorescencia. En este paso, se puede obtener la intensidad mínima de fluorescencia de histonas.</li>
	<li>Divida todas las intensidades máximas recogidas de los perfiles por la intensidad mínima. En este paso se estima el número de dímeros H3-H4 unidos al ADN.</li>
	<li>Realice los pasos 4.2-4.5 para otras moléculas de ADN.</li>
	<li>Cree un histograma para la distribución de enlace de dímeros H3-H4 con un tamaño de intervalo de 1 kbp. El número de moléculas analizadas es de al menos 300.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Como técnica de imagen de una sola molécula, la cortina de ADN se ha utilizado ampliamente para sondear las reacciones metabólicas del ADN43. La cortina de ADN es un sistema híbrido que concatena la fluidez lipídica, la microfluídica y el TIRFM. A diferencia de otras técnicas de una sola molécula, la cortina de ADN permite la visualización en tiempo real de alto rendimiento de las interacciones proteína-ADN. Por lo tanto, la técnica de cortina de ADN es adecuada para sondear el mecanismo detrás de...

El ADN eucariota está empaquetado en una estructura de orden superior conocida como cromatina 1,2. El nucleosoma es la unidad fundamental de la cromatina, que consiste en aproximadamente 147 pb de ADN envuelto alrededor de las histonas del núcleo octamérico 3,4. La cromatina desempeña un papel fundamental en las células eucariotas; por ejemplo, la estructura compacta protege el ADN de factores endógenos y amenazas exógenas5. La estructura de la cromatina cambia dinámicamente de acuerdo con la fase del ciclo celular y los estímulos ambientales, y estos cambios controlan el acceso a las proteínas durante las transacciones del ADN, como la replicación, la transcripción y la reparación6. La dinámica de la cromatina también es importante para la estabilidad genómica y la información epigenética.
La cromatina está regulada dinámicamente por varios factores, incluidas las modificaciones de la cola de las histonas y los organizadores de la cromatina, como los remodeladores de la cromatina, las proteínas del grupo polycomb y las chaperonas de histonas7. Las chaperonas de histonas coordinan el ensamblaje y desensamblaje de nucleosomas a través de la deposición o desprendimiento de histonas centrales 8,9. Los defectos en las chaperonas de histonas inducen inestabilidad genómica y causan trastornos del desarrollo y cáncer 9,10. Varias chaperonas de histonas no necesitan consumo de energía química como la hidrólisis de ATP para ensamblar o desensamblar nucleosomas 9,11,12,13. Recientemente, los investigadores informaron que las ATPasas AAA+ (ATPasa asociadas con diversas actividades celulares) que contienen bromodominios desempeñan un papel en la dinámica de la cromatina como chaperonas de histonas 14,15,16,17. La ATAD2 humana (proteína 2 que contiene el dominio AAA de la familia ATPasa) promueve la accesibilidad de la cromatina para mejorar la expresión génica18. Como co-regulador transcripcional, ATAD2 regula la cromatina de los factores transcripcionales oncogénicos14, y la sobreexpresión de ATAD2 se relaciona con un mal pronóstico en muchos tipos de cáncer19. Yta7, el homólogo de ATAD2 por Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), disminuye la densidad de nucleosomas en la cromatina15. Por el contrario, Abo1, el homólogo de ATAD2 de Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), aumenta la densidad de nucleosomas16. Utilizando una técnica única de imagen de una sola molécula, la cortina de ADN, se aborda si Abo1 contribuye al ensamblaje o desensamblaje de nucleosomas17,20.
Tradicionalmente, las propiedades bioquímicas de las biomoléculas han sido examinadas mediante experimentos masivos como el ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA) o la coinmunoprecipitación (co-IP), en los que se sondean un gran número de moléculas y se caracterizan sus propiedades medias21,22. En los experimentos a granel, los subestados moleculares están velados por el efecto conjunto-promedio, y el sondeo de las interacciones biomoleculares está restringido. Por el contrario, las técnicas de una sola molécula eluden las limitaciones de los experimentos masivos y permiten la caracterización detallada de las interacciones biomoleculares. En particular, las técnicas de imagen de molécula única se han utilizado ampliamente para estudiar las interacciones ADN-proteína y proteína-proteína23. Una de estas técnicas es la cortina de ADN, una técnica única de imagen de molécula única basada en la microfluídica y la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM)24,25. En una cortina de ADN, cientos de moléculas individuales de ADN están ancladas a la bicapa lipídica, lo que permite el movimiento bidimensional de las moléculas de ADN debido a la fluidez lipídica. Cuando se aplica el flujo hidrodinámico, las moléculas de ADN se mueven a lo largo del flujo en la bicapa y se atascan en una barrera de difusión, donde se alinean y se estiran. Mientras el ADN se tiñe con agentes intercalantes, se inyectan proteínas marcadas con fluorescencia y se utiliza TIRFM para visualizar las interacciones proteína-ADN en tiempo real a nivel de una sola molécula23. La plataforma de cortina de ADN facilita la observación de los movimientos de las proteínas, como la difusión, la translocación y la colisión 26,27,28. Además, la cortina de ADN se puede utilizar para el mapeo de proteínas en el ADN con posiciones, orientaciones y topologías definidas o se puede aplicar al estudio de la separación de fases de proteínas y ácidos nucleicos 29,30,31.
En este trabajo, se utiliza la técnica de cortina de ADN para proporcionar evidencia de la función de las chaperonas a través de la visualización directa de proteínas específicas. Además, debido a que DNA Curtain es una plataforma de alto rendimiento, facilita un grado de recopilación de datos suficiente para la confiabilidad estadística. Aquí, se describe cómo realizar el ensayo de cortina de ADN en detalle para investigar el papel molecular de la ATPasa AAA+ que contiene bromodominios de S. pombe Abo1.

<table><tbody><tr><td>1 mL jeringa Luer-lock</td><td>BecktonDickinson</td><td>301321</td><td></td></tr><tr><td>1' x 3' vidrio deslizante de silca fundida</td><td>G. Finkenbeiner</td><td></td> 1 <td>pulgada x 3 pulgadas rectangular y 10 mL de espesor</td></tr><tr><td>jeringa Luer-lock</td><td>BecktonDickinson</td><td></td> 302149 <td></td></tr><tr><td>18:1 (&Delta; 9-Cis) PC (DOPC)</td><td>Avanti</td><td>850375</td><td>Este es un componente del material lipídico biotinilado</td></tr><tr><td>18:1 Tapón de biotinilo PE</td><td>Avanti 870273</td><td></td><td>Este es un componente del material lipídico biotinilado</td></tr><tr><td>18:1 PEG2000 PE</td><td>Avanti</td><td>880130</td><td>Este es un componente del material lipídico biotinilado</td></tr><tr><td>Jeringa Luer-Lock de 3 mL</td><td>BecktonDickinson</td><td>302832</td><td></td></tr><tr><td>Válvula de inyección de muestras de 6 vías</td><td>IDEX</td><td>MX serie II</td><td></td></tr><tr><td>950K PMMA</td><td>All-resist</td><td>671.04</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>SAMCHUN</td><td>A1759</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5'-trifosfato sódico sódico hidrato (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Aluminio (Al)</td><td>TASCO, Corea del Sur</td><td>LT50AI414</td><td>Diámetro 4 pulgadas, espesor 1/4 de pulgada</td></tr><tr><td>Filtro centrífugo Amicon Ultra, MWCO 10 kDa</td><td>Millipore</td><td>Z648027</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Mbcell</td><td>MB-A4128</td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>AZ 300 MIF revelador</td><td>Merck</td><td>10454110521</td><td>Se utiliza para eliminar el aluminio</td></tr><tr><td>Cuchilla</td><td>DORCO</td><td>DN52</td><td>12 mm x 6 m</td></tr><tr><td>Tricloruro de boro (BCl3)</td><td>UNIONGAS</td><td></td><td>Pureza: >99.99%</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Catalasa</td><td>Sigma</td><td>C40-1g</td><td>Este es un componente de 100x gloxiy stock</td></tr><tr><td>Cloro (Cl2)</td><td>UNIONGAS</td><td></td><td>Pureza: >99.99%</td></tr><tr><td>Cinta transparente de doble cara</td><td>3M</td><td>313770</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucosa</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DC sputter</td><td>Sorona</td><td>SRM-120</td><td>Se utiliza para la deposición de aluminio en una corredera</td></tr><tr><td>Broca recubierta de diamante</td><td>Eurotool</td><td>DIB-211.00</td><td>Se utiliza para hacer agujeros en una corredera de sílice</td></tr><tr><td>fusida DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Prisma de paloma</td><td>Corea Electro-Optics Co. Ltd.</td><td>1906-106</td><td>Prisma de paloma de sílice fundida hecho a medida con recubrimiento antirreflectante</td></tr><tr><td>Taladro</td><td>Dremel</td><td>Dremel 3000</td><td>Se utiliza para hacer agujeros en un portaobjetos de sílice fusada</td></tr><tr><td>Litografía de frijol electrónico</td><td>Nanobeam Ltd.</td><td>NB3</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etileno-diamina-tetraacético (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Accesorios de apriete con los dedos</td><td>IDEX</td><td>F-300</td><td>Se conecta con "PFA Tubing Natural" para formar un tubo luer-lock</td></tr><tr><td>Tuerca macho sin brida</td><td>IDEX</td><td>P-235</td><td>Se conecta con "PFA Tubing Natural" para formar tubos luer-lock</td></tr><tr><td>Liofilizador, HyperCOOL</td><td>Labogene</td><td>HC3110</td><td>Se utiliza para liofilizar proteínas líquidas</td></tr><tr><td>Glucosa oxidasa</td><td>Sigma</td><td>G2133-50KU</td><td>Este es un componente de 100x gloxinio</td></tr><tr><td>clorhidrato de guanidinio</td><td>Acros Organics</td><td>364790025</td><td></td></tr><tr><td>jeringa Hamilton</td><td>Hamilton Company</td><td>80065</td><td>Esta jeringa se utiliza para la inyección de muestras</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma</td><td>Z805939</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg</td><td>Cytiva</td><td>28-9893-36</td><td>Utilizado para FPLC (exclusión de tamaño)</td></tr><tr><td>Agitador de placa caliente</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Sigma</td><td>H1759</td> Utilizado para el aceite de coincidencia de índice <td>Tris-HCl</td></tr><tr><td></td><td>ZEISS</td><td>444970-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Grabado iónico reactivo por plasma acoplado inductivamente</td><td>Top Technology Ltd.</td><td>FabStar</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)</td><td>Glentham Life Sciences</td><td>GC6586-100g</td><td>Se utiliza para la inducción de la actividad de la &beta;-galactosidasa</td></tr><tr><td>Fago lambda ADN</td><td>NEB</td><td>N0311</td><td></td></tr><tr><td>LB caldo</td><td>BD difco</td><td>244610</td><td>Medios para el crecimiento de células E. coli</td></tr><tr><td>Adaptador Luer 10-32</td><td>IDEX</td><td>P-659</td><td>Esto conecta luer-lock jeringa y tubo</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td> fisher <td>biorreactivos</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>Metil isobutil cetona (MIBK)</td><td>KAYAKU ADVANCED MATERIALS</td><td></td><td>Se utiliza para el desarrollo de soluciones</td></tr><tr><td>Microscopio (Eclipse Ti2)</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti2</td><td>Microscopio de fluorescencia invertida</td></tr><tr><td>Microscopio cubreobjetos de vidrio</td><td>MARIENFELD</td><td>101142</td><td>22 x 50 mm (n.º 1)</td></tr><tr><td>Portaobjetos para microscopio</td><td>DURAN GROUP</td><td>DU.2355013</td><td>Portaobjetos borde rectificado de vidrio 45 grados, liso 26 x 76 mm</td></tr><tr><td>Nanoport</td><td>IDEX</td><td>N-333-01</td><td></td></tr><tr><td>Lente objetivo</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apochromat VC 60XC WI</td><td>Tipo de inmersión: agua, aumento: 60x, corrección: 18, distancia de trabajo: 0,29 (0,31-0,28)</td></tr><tr><td>One Shot BL21 (DE3)pLysS E. coli químicamente competente</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C6060-03</td><td>Célula competente para la sobreexpresión de proteínas</td></tr><tr><td>Oxígeno (O2)</td><td>NOBLEGAS, Corea</td><td></td> del Sur <td>Pureza: >99.99%</td></tr><tr><td>Tubo de PFA natural</td><td>IDEX</td><td>1512L</td><td>Está conectado con "accesorios apretados con los dedos" para formar un tubo Luer-lock</td></tr><tr><td>Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)</td><td>Roche</td><td>11359061001</td><td>Inhibidor</td></tr> <tr><td>de la proteasaSephacryl S-200 Alta resolución</td><td>Cytiva</td><td>17-0584-01</td><td>Utilizado para FPLC (exclusión de tamaño)</td></tr><tr><td>Válvula de cierre</td><td>IDEX</td><td>P-732</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Sigma</td><td>791741</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>s5881</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por tubo de membrana porosa molecular, MWCO 6-8 kDa</td><td>Spectrum laboratories</td><td>132660</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S888</td><td></td></tr><tr><td>Tetralfluoruro de azufre (SF4)</td><td>NOBLEGAS, Corea</td><td></td> del Sur <td>Pureza: >99.99%</td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>KD Scientific</td><td>78-8210</td><td></td></tr><tr><td>Tetrafluorometano (CF4)</td><td>NOBLEGAS, Corea</td><td></td> del Sur<td>Pureza: >99.99%</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td></td><td>Sigma T1503</td><td>Utilizado para Tris-HCl</td></tr><tr><td>TSKgel SP-5PW</td><td>TOSOH</td><td>14715</td><td>Utilizado para FPLC (intercambio iónico)</td></tr><tr><td>Montaje de la unión</td><td>IDEX</td><td>P-760</td><td>Esto conecta tubos</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Horno de vacío</td><td>Jeio Tech</td><td>OV-11</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Y3601</td><td>Este colorante de intercalación se diluye en DMSO</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol (BME)</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr></tbody></table>

descifrando el mecanismo molecular del ensamblaje de histonas mediante la técnica de cortina de adn

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

La cromatina es una estructura de orden superior que empaqueta el ADN eucariota. La cromatina sufre alteraciones dinámicas según la fase del ciclo celular y en respuesta a estímulos ambientales. Estos cambios son esenciales para la integridad genómica, la regulación epigenética y las reacciones metabólicas del ADN, como la replicación, la transcripción y la reparación. El ensamblaje de la cromatina es crucial para la dinámica de la cromatina y es catalizado por las chaperonas de histonas. A pesar de los extensos estudios, los mecanismos por los cuales las chaperonas de histonas permiten el ensamblaje de la cromatina siguen siendo esquivos. Además, las características globales de los nucleosomas organizados por las chaperonas de histonas son poco conocidas. Para abordar estos problemas, este trabajo describe una técnica única de imagen de una sola molécula llamada cortina de ADN, que facilita la investigación de los detalles moleculares del ensamblaje de nucleosomas por parte de las chaperonas de histonas. La cortina de ADN es una técnica híbrida que combina la fluidez lipídica, la microfluídica y la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) para proporcionar una plataforma universal para la obtención de imágenes en tiempo real de diversas interacciones proteína-ADN. Utilizando la cortina de ADN, se investiga la función de la chaperona de histonas de Abo1, la ATPasa AAA+ que contiene bromodominios de Schizosaccharomyces pombe , y se revela el mecanismo molecular subyacente al ensamblaje de histonas de Abo1. La cortina de ADN proporciona un enfoque único para estudiar la dinámica de la cromatina.

Este trabajo describe el procedimiento para la preparación de la celda de flujo para el ensayo de cortina de ADN (Figura 1A). El ensayo de cortina de ADN facilitó el estudio del ensamblaje del dímero de la histona H3-H4 en el ADN por Abo1. En primer lugar, se comprobó la formación de la cortina de ADN tiñendo las moléculas de ADN con YOYO-1, un colorante intercalante. Se mostraron líneas verdes en matrices paralelas, lo que indica que YOYO-1 se intercaló en moléculas de ADN, que estaban bien...

La cortina de ADN, una técnica de adquisición de imágenes de molécula única de alto rendimiento, proporciona una plataforma para la visualización en tiempo real de diversas interacciones proteína-ADN. El presente protocolo utiliza la técnica de cortina de ADN para investigar el papel biológico y el mecanismo molecular de Abo1, una ATPasa AAA+ que contiene bromodominio de Schizosaccharomyces pombe .

Descifrando el mecanismo molecular del ensamblaje de histonas mediante la técnica de cortina de ADN

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

Este protocolo muestra cómo se utiliza la técnica de cortina de ADN para estudiar la dinámica de la cromatina, en particular para investigar la función molecular de las chaperonas de histonas. La cortina de ADN de la técnica de adquisición de imágenes de molécula única de alto rendimiento supera las limitaciones de los experimentos masivos y facilita la obtención de imágenes en tiempo real, lo que permite la caracterización detallada de las interacciones de las biomoléculas. Coloque un papel limpio de dimensión 5 por 35 milímetros en el centro de la cinta adhesiva de doble cara.Pega la cinta adhesiva sobre el portaobjetos para cubrir los dos agujeros y los nanopatrones con el papel. A continuación, extirpe el papel con una cuchilla limpia. Coloque un cubreobjetos de vidrio encima de la cinta adhesiva de doble cara y frote el cubreobjetos con la punta de una pipeta para formar una cámara microfluídica.Coloque la celda de flujo ensamblada entre dos portaobjetos de microscopio y sujételos. Hornee la celda de flujo en un horno al vacío a 120 grados centígrados durante 45 minutos. Fije el conector de fluido para el análisis basado en virutas a cada orificio abierto con una pistola de pegamento caliente.Y conecte las dos líneas de tubos de bloqueo de señuelo. Conecte una jeringa de bloqueo de señuelo que contenga tres mililitros de agua desionizada y lave la cámara. Lavar de nuevo la cámara con tres mililitros de tampón lipídico a través de la conexión gota a gota.Inyectar un mililitro de lípido biotinilado 0,04x en tampón lipídico, en la cámara, en dos tomas, con una incubación de cinco minutos por toma. Inyecte 0,025 miligramos por mililitro de estreptavidina en un mililitro de BSA, con dos inyecciones y una incubación de 10 minutos por inyección. Inyecte aproximadamente 30 picomolares de ADN de fagos lambda biotinilados en un mililitro de tampón BSA, en la cámara con dos disparos e incubaciones de 10 minutos por disparo.Conecte una jeringa que contenga 10 mililitros de tampón de imágenes a una bomba de jeringa y elimine las burbujas en todas las líneas de tubería del sistema microfluídico. Acople la celda de flujo preparada con el sistema microfluídico a través de una conexión gota a gota para evitar la inyección de burbujas en la celda de flujo. Ensamble la celda de flujo y los soportes de la celda de flujo, y monte el ensamblaje en un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total hecho a medida.Inyecte 200 microlitros de colorante YOYO-1 en tampón de imagen a través de 100 microlitros de bucle de muestra para teñir las moléculas de ADN Lambda. Ejecute un software de imágenes y encienda el láser de 488 nanómetros para verificar si las cortinas de ADN están bien formadas. Después de eliminar el colorante YOYO-1, inyecte la muestra de proteína preincubada.Cuando las proteínas lleguen a la cortina de ADN, apague la bomba de jeringa, cierre la válvula de cierre e incube durante 15 minutos para la carga de histonas por Abo1. Lave las proteínas Abo1 e histonas no unidas durante cinco minutos. Apague transitoriamente el flujo de tampón para verificar si las proteínas histonas están cargadas en el ADN.La formación de la cortina de ADN se comprobó tiñendo las moléculas de ADN con un colorante interpolador. Las líneas verdes mostradas en matrices paralelas indicaban que YOYO1 intercalado en moléculas de ADN estaban bien alineadas y estiradas en una barrera de difusión bajo flujo hidrodinámico. Cuando se inyectaron dímeros Cy5-H3-H4 en la cortina de ADN en ausencia de Abo1, Cy5-H3-H4 no se unió al ADN, lo que indica una falta de unión espontánea de los dímeros H3-H4 al ADN.Cuando Cy5-H3-H4 se inyectó con Abo1, se observaron puntos fluorescentes rojos en las moléculas de ADN, lo que sugiere que Abo1 carga dímeros H3-H4 en el ADN. Las señales fluorescentes desaparecieron en ausencia de flujo tampón y reaparecieron cuando se reanudó el flujo, lo que sugiere que los dímeros H3-H4 se unen al ADN. La unión de los dímeros H3-H4 al ADN también fue confirmada por el quimógrafo, en el que las señales de fluorescencia desaparecían cada vez que se cortaba el flujo.Aparecieron pocos puntos fluorescentes en la cortina de ADN, ya sea en ausencia de nucleótido o en presencia de ADP, lo que indica que los dímeros H3-H4 rara vez se unen al ADN, ya sea en el estado Apo o en presencia de ADP. El análisis cuantitativo muestra que el número de dímeros H3-H4 unidos al ADN aumenta en presencia de ATP. Los resultados sugieren que la hidrólisis de ATP es esencial para la carga de H3-H4 en el ADN por Abo1.Evitar la inyección de burbujas en la celda de flujo es lo más crítico para todos los pasos. Por lo tanto, en este protocolo, hacemos hincapié en las conexiones gota a gota. El ensayo de cortina de ADN se puede extender a cortinas de ADN de doble amarre con nanopatrones duales.Además, podemos hacer otro tipo de cortina de ADN con filamentos monocatenarios de ADN, ARN o actina. La cortina de ADN permite la visualización del movimiento de las proteínas en el ADN y facilita el estudio del mecanismo de búsqueda de objetivos. La cortina de ADN se puede extender para estudiar el metabolismo del ADN, incluida la replicación y la transcripción.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

El método de Hi-C permite la identificación imparcial de todo el genoma de las interacciones entre la cromatina (1). Hi-C parejas ligadura de proximidad y de secuenciación masiva en paralelo. Los datos resultantes se pueden utilizar para estudiar arquitectura genómica a diferentes escalas, los resultados iniciales identificaron características tales como los territorios de cromosomas, la segregación de la cromatina abierta y cerrada, y la estructura de la cromatina en la escala de megabase.

Hi-C: Un método para estudiar la arquitectura tridimensional de los genomas.

El paquete de software 3DNA es un popular y versátil herramienta bioinformática con capacidades para analizar, construir y visualizar estructuras de ácidos nucleicos tridimensionales. En este artículo se presenta protocolos detallados para un subconjunto de nuevas y populares características disponibles en 3DNA, aplicables tanto a las estructuras individuales y conjuntos de estructuras relacionadas.

Análisis y construcción de estructuras de ácidos nucleicos con 3DNA

Este video describe un método para visualizar el ensamblaje de condensados de proteínas de fusión en moléculas de ADN en loci específicos utilizando imágenes de una sola molécula. Estos condensados se forman debido a las interacciones LCD-LCD y LCD-DBD, que permiten el reclutamiento de ARN polimerasa II y una mejor transcripción de genes.

Imágenes de una sola molécula para visualizar el ensamblaje de condensados de proteínas de fusión en cortinas de ADN

Se presenta un método para la reconstitución del modelo nucleosomal arrays de histonas y el ADN recombinante posicionamiento de nucleosomas en tándem repetido. También describe cómo se utilizan los experimentos de velocidad de sedimentación en la ultracentrífuga analítica y microscopía de fuerza atómica (AFM) para supervisar el grado de saturación de gama nucleosomal después de la reconstitución.

Asamblea de Nucleosomal Arrays de recombinantes Core histonas y el ADN posicionamiento de nucleosomas

El daño dirigido al ADN se puede lograr atando un agente dañino para el ADN a un oligonucleótido formador de triplex (TFO). Mediante el uso de TFO modificados, la asociación de proteínas específicas del daño del ADN y la modificación de la topología del ADN se pueden estudiar en células humanas mediante la utilización de ensayos de inmunoprecipitación de cromatina modificada y ensayos de superenrollamiento del ADN descritos en este documento.

Herramientas para estudiar el papel de la proteína HMGB1 arquitectónico en el procesamiento de la hélice causante de distorsión, de ADN específica de sitio enlaces cruzados

Aquí, presentamos un protocolo para caracterizar partículas nucleosoma en el nivel de una sola molécula mediante microscopía de fuerza atómica estática y Time-lapse (AFM) técnicas de imagen. El método de funcionalización de superficies descrito permite la captura de la estructura y la dinámica de los nucleosomas en alta resolución a escala nanométrica.

Sondear la estructura y dinámica de nucleosomas utilizando imágenes de microscopía de fuerza atómica

Aquí, describimos el uso del método de imagen de molécula única, cortinas de ADN, para estudiar el mecanismo biofísico de los condensados EWS-FLI1 que se ensamblan en el ADN.

Imágenes de una sola molécula de condensados EWS-FLI1 ensamblados en ADN

La interacción de un remodelador de cromatina dependiente de ATP con un ligando de ADN se describe mediante espectroscopia de CD. Los cambios conformacionales inducidos en un promotor génico analizado por los picos generados pueden ser utilizados para comprender el mecanismo de regulación transcripcional.

Espectroscopia de CD para estudiar las interacciones ADN-proteína

Este protocolo describe el método Capture Hi-C utilizado para caracterizar la organización 3D de regiones genómicas específicas de tamaño megabasado en alta resolución, incluidos los límites de los dominios de asociación topológica (TAD) y las interacciones de cromatina de largo alcance entre los elementos reguladores y otros elementos de secuencia de ADN.

Descifrando la organización de la cromatina 3D de alta resolución a través de Capture Hi-C

Este artículo presenta un procedimiento experimental detallado para la reconstitución de ataduras de ADN que contienen nucleosomas para microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula. Además, describe varios experimentos posteriores que se pueden llevar a cabo para visualizar el comportamiento de unión de las proteínas que interactúan con la cromatina y analizar los cambios en las propiedades físicas de los nucleosomas.

Ensamblaje de nucleosomas in situ para microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula

Descubre la técnica de cortina de ADN para estudiar interacciones proteína-ADN en tiempo real usando Schizosaccharomyces pombe. Este método de imagen de molécula única permite caracterizar la dinámica de la cromatina y el papel de Abo1 en el ensamblaje de histonas.

Descifrando el mecanismo molecular del ensamblaje de histonas mediante la técnica de cortina de ADN

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