Name: Análisis de proteinuria, infiltración renal de leucocitos y depósito renal de proteínas en ratones LMR/LPR propensos al lupus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprende a analizar proteinuria, infiltración leucocitaria y depósito de proteínas en riñones de ratones MRL/Lpr propensos al lupus. Este método permite monitorear la progresión de la nefritis lúpica de forma confiable y económica.

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Agradecemos a la Flow Cytometry Core Facility, al Laboratorio de Histopatología, al Centro de Imágenes Fralin del Instituto Politécnico de Virginia y a la Universidad Estatal por su apoyo técnico. Este trabajo es apoyado por varios NIH y subvenciones internas.

El presente protocolo está aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en Virginia Tech. Dado que la enfermedad lúpica tiene una mayor incidencia en las hembras, solo se utilizaron ratones MRL / lpr hembra. La recolección de muestras se inició a las 4 semanas de edad y terminó a las 15 semanas. Los ratones se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de materiales) y fueron criados y mantenidos en un ambiente específico libre de patógenos siguiendo las pautas institucionales.
1. Prueba de proteinuria
<ol><li>Recoja la orina siguiendo los pasos a continuación.<ol><li>Esterilice la campana rociando etanol al 70%. Coloque una lámina de plástico estéril sobre la superficie. Prepare puntas, tubos de 1,5 ml y una pipeta para recoger unos 20 μL del líquido. NOTA: Las puntas y los tubos deben ser estériles y sin ningún tratamiento previo.</li>
		<li>Tome la jaula y rocíe etanol al 70% antes de ponerla dentro de la capucha.</li>
		<li>Sostenga el mouse con una mano y use la otra mano para masajear suavemente el área ventral de arriba a abajo.</li>
		<li>Use un tubo o pipeta de 1.5 ml para recolectar la orina directamente, o si la muestra cae, recójala de la lámina de plástico. Use guantes, sábanas y puntas nuevas para cada muestra. NOTA: Si esto no funciona, use un vaso de precipitados estéril para aislar al ratón, luego recoja la orina del vaso de precipitados después de que el ratón orine.</li>
		<li>Vuelva a colocar el ratón en la jaula. Saque otro ratón y repita los pasos 1.1.3-1.1.4. NOTA: Siempre limpie la lámina de plástico y el vaso de precipitados con etanol al 70% después de recolectar la muestra para cada ratón. Se necesitan al menos cinco ratones por grupo para la significación estadística. Las muestras de orina pueden almacenarse a -80 °C hasta su uso durante un máximo de 12 meses.</li>
	</ol></li>
	<li>Cuantificar las proteínas por el método de Bradford24.<ol><li>Permita que las muestras de orina, la albúmina estándar y el reactivo Bradford alcancen la temperatura ambiente (RT) manteniéndolas fuera del congelador durante 10-20 minutos. NOTA: El reactivo Bradford y el estándar de albúmina se incluyen en un kit disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales). La concentración inicial del estándar de albúmina es de 2 mg/ml. Las diluciones seriadas (1:2 seis veces) deben hacerse con agua.</li>
		<li>Agregue el reactivo Bradford a una placa de 96 pocillos (200 μL/pocillo), sin diluir.</li>
		<li>Pipetear 5 μL de muestra de orina sin diluir por pocillo y usar la punta para pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar correctamente.</li>
		<li>Agregue estándares (400, 200, 100, 50, 25, 12.5 mg / dL) por duplicado. Deje un par de pozos como espacios en blanco. NOTA: La adición de muestras y estándares debe hacerse rápidamente.</li>
		<li>Déjelo reposar durante 5-10 minutos en RT.</li>
		<li>Lea la placa a 595 nm en un lector de placas según el protocolo del fabricante (consulte la Tabla de materiales).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Aislamiento de las células renales
<ol><li>Eutanasia al ratón conCO2 (caudal: 30%-70% volumen/min, para lograr la inconsciencia o la muerte) en una cámara seguida de luxación cervical. Proceda con la disección para recolectar ambos riñones. Coloque un riñón y medio en un medio C10 helado. Poner la otra mitad del riñón en OCT (paso 3.1.1). NOTA: C10 está hecho con RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal, 1 mM de piruvato de sodio, 1% de 100x aminoácidos no esenciales MEM, 10 mM de HEPES, 55 μM de 2-mercaptoetanol y 100 U/mL de penicilina-estreptomicina (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Cortar los riñones en tamaño de grano (1-2 mm3 piezas) y digerir en 5 mL de tampón de digestión que contenga 1 mg/mL de colagenasa y 0,2 mg/ml de DNasa I (ver Tabla de materiales) en medio RPMI 1640 que contiene 10 mmol/L de HEPES durante 1 h con agitación suave continua a 37 °C. NOTA: Agregue 1 ml de tampón de digestión en un tubo estéril de 2 ml y use tijeras estériles para cortar el riñón.</li>
	<li>Añadir 10 ml de 1x PBS helado que contenga 10 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) e incubar durante 10 min en hielo. Luego vortex la suspensión dos veces.</li>
	<li>Filtrar la suspensión celular a través de un colador de 100 μM y lavar con 10 ml de HBSS-full. NOTA: HBSS-full contiene 5 mM de EDTA, 0.1% BSA y 10 mM de HEPES.</li>
	<li>Centrífuga a 350 x g durante 10 min a RT.</li>
	<li>Prepare una solución de percoll isotónico (SIP) al 30%, 37% y 70%. NOTA: Mezcle 1 parte de volumen de 10x PBS y 9 partes de volumen de Percoll para preparar SIP (ver Tabla de materiales); use HBSS-full para diluir SIP al 30%, 37% y 70% SIP.</li>
	<li>Resuspender las células en 5 mL de 30% SIP y cargar 37% de 5 mL (arriba) y 70% de 5 mL (abajo), haciendo gradiente SIP, lentamente con una pipeta paster.</li>
	<li>Centrífuga con Up9 down0 (o freno 0) a 1000 x g durante 30 min a RT.</li>
	<li>Recoger leucocitos de la interfaz 37%-70% y resuspenderlos en 5 mL de C10.</li>
	<li>Centrifugar a 350 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Resuspender el pellet celular en 3 ml de tampón FACS. Las células están listas para la tinción del FACS. NOTA: El tampón FACS contiene 1x PBS y 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA).</li>
	<li>Centrifugar a 350 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante (SN), dejando unos 50 μL. NOTA: Para eliminar el sobrenadante, vierta o pipete cuidadosamente la solución lejos del sólido o use un vacío semiautomático para aspirar el sobrenadante.</li>
	<li>Agregue 50 μL de bloque FcR (consulte la Tabla de materiales) por tubo (prediluido 1/50 en 1x PBS); Mezclar e incubar en hielo en la oscuridad durante 10 minutos.</li>
	<li>Añadir 2 ml de tampón FACS para lavar.</li>
	<li>Centrifugar a 350 x g durante 5 min a 4 °C y desechar SN, dejando unos 50 μL.</li>
	<li>Agregue 20 μL del colorante fluorescente apropiado (diluya 1/100 con 1x PBS, consulte la Tabla de materiales) y déjelo reposar durante 15-30 minutos en hielo.</li>
	<li>Agregue 50 μL de mezcla de anticuerpos 15 por tubo: CD138-BV711 (1/200 en 1x PBS) y CD45-AF700 (1/200 en1x PBS) (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Incubar en hielo en la oscuridad durante 15-30 minutos y añadir 3 ml de tampón FACS.</li>
	<li>Centrifugar a 350 x g durante 5 min a 4 °C y aspirar SN, dejando unos 50 μL. Resuspender en 200 μL de 1x PBS. Esto ahora está listo para ser analizado por citometría de flujo.</li>
</ol>3. Tinción inmunofluorescente
<ol><li>Realice la recolección de muestras.<ol><li>Incruste el medio riñón en el criomold plástico pequeño con el compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Agregue hielo seco en una caja de espuma de poliestireno (consulte la Tabla de materiales) y coloque cuidadosamente el criomold sobre el hielo seco. Asegúrese de que los criomoldes estén colocados planos. NOTA: El compuesto OCT tarda 3-4 minutos en solidificarse y volverse blanco.</li>
		<li>Saque el criomold y envuélvalo en papel de aluminio. Almacénelo a -80 °C hasta su uso posterior. NOTA: Esto se puede almacenar a -80 ° C durante al menos 1 año.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar seccionamiento y fijación de la muestra.<ol><li>Cortar las muestras en secciones de 4 μm, esperar al menos 2-3 h para que se sequen y luego fijar con acetona fría (a 4 °C) durante 10 min. NOTA: Tenga cuidado al usar acetona, que requiere una campana química especializada.</li>
		<li>Después de fijar los portaobjetos, secar al aire durante 0,5-1 h y almacenarlos durante un corto período de tiempo a -20 °C, o durante mucho tiempo a -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Manchar las muestras.<ol><li>Vuelva a fijar los portaobjetos en acetona fría durante 5-10 min.</li>
		<li>Deje que las secciones se calienten a RT. Use un bolígrafo PAP (consulte Tabla de materiales) alrededor de la sección y deje que se seque. NOTA: El esmalte de uñas también se puede usar. Este paso evita que la dilución de anticuerpos flote por todo el portaobjetos.</li>
		<li>Coloque los portaobjetos en 1x solución salina tamponada con Tris (TBS) en el frasco de Coplin (consulte la Tabla de materiales) durante 20 minutos, coloque el frasco en la coctelera y agite suavemente.</li>
		<li>Vierta 1x TBS y llene el frasco con 1x TBS, 5% BSA y 0.1% Tween 20. Incubar durante 20 minutos en la coctelera, agitar suavemente.</li>
		<li>Saque los portaobjetos y seque la parte inferior de los portaobjetos. Si es necesario, seleve los portaobjetos en seco. Agregue 100 μL de anticuerpos conjugados25 C3-FITC (1/100) e IgG2a-PE (1/100) a la sección (ver Tabla de materiales). Incubar a RT en una cámara humidificada durante 1 h.</li>
		<li>Lave la sección 3 veces en 1x TBS, 5% BSA y 0.1% Tween 20 durante 10 min en la coctelera.</li>
		<li>Seque las guías y monte la sección con un reactivo antidecolorante (consulte la Tabla de materiales) y luego un cubreobjetos.</li>
		<li>Guarde los portaobjetos a 4 °C hasta que los vea bajo el microscopio (por ejemplo, microscopio confocal o microscopio de sistema de imágenes). Cuantifique imágenes usando software y reste señales de fondo al comparar la intensidad de fluorescencia entre regiones.</li>
		<li>Para el análisis de imágenes utilizando el software ImageJ (consulte Tabla de materiales), describa la región deseada.</li>
		<li>Establezca parámetros estándar haciendo clic en Analizar, luego Establecer medidas y Área de medida para obtener los resultados.</li>
		<li>Transfiera los datos obtenidos de las ventanas de medida a una hoja de cálculo. NOTA: Se puede seleccionar un área pequeña de la imagen como fondo; No debería tener fluorescencia.</li>
		<li>Una vez hecho esto, haga clic en Analizar para medir la región y transferir los datos nuevamente a la hoja de cálculo anterior.</li>
		<li>Repita los pasos 3.3.11-3.3.12 para varias regiones.</li>
		<li>Calcule la fluorescencia media como fluorescencia celular corregida (CCF) = densidad integrada - (región celular seleccionada x fluorescencia media de fondo).</li>
		<li>Calcule para cada región y analice los datos utilizando el software de gráficos y estadísticas (consulte la Tabla de materiales).</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no existe conflicto de intereses.

La LN es una de las principales causas de mortalidad en pacientes con LES, y los factores que agravan la enfermedad siguen sin estar claros. La aplicación de este protocolo consiste en caracterizar la función renal utilizando múltiples métodos, incluida la medición de proteinuria, el análisis FACS de leucocitos renales aislados y la tinción por inmunofluorescencia de secciones renales congeladas.
Un punto importante a considerar al recolectar orina es que uno tiene que ser consistente con la h...

La función principal del riñón es la eliminación de sustancias tóxicas a través de la orina, manteniendo la homeostasis del agua y las sales1. Esta función está amenazada en pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES), lo que lleva a la llamada nefritis lúpica (LN). LN es una consecuencia de que el sistema inmune ataca el riñón, lo que lleva a una inflamación renal persistente, por lo tanto, pierde su capacidad para limpiar los desechos de la sangre y regular las concentraciones de sal y líquidos. Esto eventualmente conducirá a insuficiencia renal, que puede ser fatal. Durante el proceso nefrítico, las células B circulantes, las células T y los monocitos se reclutan en el riñón, secretando quimiocinas, citoquinas y autoanticuerpos formadores de complejos inmunes. En última instancia, esto resulta en daño de las células endoteliales, lesiones membranosas, atrofia tubular renal y fibrosis2.
Los ratones propensos al lupus MRL / Mp-Faslpr (MRL / lpr) son un modelo clásico de ratón que exhibe signos clínicos similares al lupus que se asemejan al LES humano3. Este modelo ha sido fundamental para comprender una de las principales causas de mortalidad en pacientes con LES, la nefritis lúpica (LN)4. Tanto en el LES humano como en el ratón, la LN se caracteriza por una inflamación gradual desencadenada por la deposición renal de complejos inmunes, seguida de la activación del complemento, el reclutamiento de células inflamatorias y la pérdida de la función renal5. El depósito del complejo inmune es el primer paso para inducir la producción de quimiocinas y citoquinas por las células renales intrínsecas, lo que expande la respuesta inflamatoria al reclutar células inmunes6. El protocolo actual presenta varias técnicas para seguir la progresión de la enfermedad renal que analizan la infiltración celular y la deposición de complejos inmunes.
La orina recolectada cada semana permite la detección y visualización del curso temporal de la proteinuria antes, durante y después del inicio del lupus. La proteinuria como biomarcador puede determinar la progresión biológica de la LN. Otras ventajas de esta técnica son que no es invasiva, rentable y fácil de implementar7. Cuando el riñón está funcionando perfectamente, el nivel de proteinuria es consistentemente bajo; sin embargo, en ratones LMR/LPR, después de las 8-9 semanas de edad, se observa un aumento gradual del nivel de proteinuria, que finalmente es lo suficientemente alto como para causar insuficiencia renal8. Múltiples tiras de reactivos y reactivos colorimétricos están disponibles comercialmente para monitorear el problema. Sin embargo, el ensayo de Bradford es barato y muy preciso para determinar la aparición de proteinuria y el curso de la nefritis lúpica. Este ensayo es rápido y el reactivo no se ve afectado por la presencia de disolventes, tampones, agentes reductores y agentes quelantes de metales que pueden estar en su muestra 9,10,11.
Un aspecto importante a considerar es la infiltración celular en el riñón. Estos infiltrados promueven la patogénesis al desencadenar la secreción de factores solubles como las citoquinas para empeorar la inflamación12. Para comprender mejor qué poblaciones celulares están presentes en los infiltrados, un método útil es aislar leucocitos13. Aquí, la detección de la infiltración renal de las células B se utiliza como ejemplo. El procedimiento comienza con un proceso de digestión con desoxirribonucleasa (DNasa) y colagenasa, seguido de una separación de gradiente de densidad que elimina desechos, glóbulos rojos y granulocitos densos. La razón para aislar las células B (CD19+) y las células plasmáticas (CD138+) es que los riñones lúpicos pueden concentrar estas células14. Se sugiere que la presencia de células B en pequeños agregados en el riñón puede indicar expansión clonal y, en consecuencia, producción de inmunoglobulina (Ig). Se sabe que las células plasmáticas también están presentes en estos agregados15. Una vez que se han aislado los leucocitos, se puede utilizar la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para analizar las células de interés al teñir con diferentes anticuerpos conjugados con fluorescencia.
La inmunofluorescencia es uno de los métodos de detección de inmunohistoquímica (IHC) que permite la visualización fluorescente de proteínas en muestras de tejido renal de 4 μm de espesor. Otros métodos de detección de IHQ dependen de la naturaleza de los analitos, la química de unión y otros factores16. La inmunofluorescencia es un método de identificación rápida que expone el antígeno a su anticuerpo homólogo marcado con un fluorocromo específico (o un colorante fluorescente). Cuando se excita, produce luz que un microscopio de fluorescencia puede detectar. Esta técnica puede ser utilizada para observar la deposición del complemento C3 e IgG2a17. La activación excesiva de la cascada del complemento podría estar asociada con una respuesta inmune incontrolada y pérdida de función18. La deposición inmune de autoanticuerpos anti-ADN bicatenario (anti-dsDNA) en el riñón es una preocupación importante19, donde aquellos con isotipo IgG2a se han asociado con LN20. Específicamente, los anticuerpos anti-dsDNA exhiben más patogenicidad y afinidad con los materiales nucleares, formando complejos inmunes21. Cuando la IgG2a está presente, la cascada del complemento, incluyendo C3, se activa para eliminar los complejos inmunes22. Los marcadores C3 e IgG2a se pueden cuantificar individualmente o superpuestos para establecer su correlación.
En particular, la medición de la creatinina sérica es otra técnica confiable que se puede usar junto con hematuria microscópica y biopsias renales para diagnosticar LN23. Sin embargo, la presencia de proteinuria es un fuerte indicador de daño glomerular. En ese sentido, el monitoreo del nivel de proteinuria durante el lupus puede detectar la aparición de la enfermedad y complementar otros métodos para diagnosticar el lupus. Además, los complejos inmunes depositados en los glomérulos pueden inducir una respuesta inflamatoria, activar el sistema del complemento y reclutar más células inflamatorias. Otro punto destacable de este protocolo es la infiltración de células B en el riñón. Esto, junto con las células T infiltradas, amplifica las respuestas inmunes locales que desencadenan el daño orgánico. Es importante destacar que la clasificación de LN no solo se basa en los cambios morfológicos glomerulares observados en microscopía, sino también en los depósitos inmunes observados con inmunofluorescencia. Por lo tanto, en este protocolo, se ofrecen métodos precisos y rentables para el análisis de la función renal en entornos de laboratorio.

<table><tbody><tr><td>10x solución salina tamponada Tris (TBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J60764. K2</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Humano/Ratón C3</td><td>Cedarlán</td><td>CL7632F</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratón CD138 BV711</td><td>Biolegend</td><td>142519</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratón CD45 AF700</td><td>Biolegend</td><td>103127</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Confocal LSM 880</td><td>Zeiss</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>Tarro Coplin</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-212-281</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9511236</td><td></td></tr><tr><td>Medio de gradiente de densidad</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Percoll</td></tr><tr><td>Agua tratada con DEPC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>dsDNA-EC</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-ecdna</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>EVOS M5000 Sistema de imagen para microscopio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMF5000</td><td></td></tr><tr><td>FACS Fusion Clasificador</td> BD <td>Biosciences</td><td>FACS Fusion</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino - Premium, Inactivado por Calor</td><td>R& Sistemas D</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Placas de poliestireno de 96 pocillos Fisherbrand</td><td>Prisma Graphpad Scientific</td><td>12-565-501</td><td></td></tr><tr><td></td><td>GraphPad N</td><td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Solución salina equilibrada</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>Institutos Nacionales de Salud</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lactobacillus reuteri Kandler et al.</td><td>ATCC</td><td>23272</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoácidos no esenciales</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>MRL/MpJ-Fas lpr /J Ratones (MRL/lpr)</td><td>Jackson Lab</td><td>485</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte de uñas</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Cualquier tienda convencional</td></tr><tr><td>Compuesto O.C.T</td><td>Tisse-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Bolígrafo PAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>Moldes de inclusión desechables Peel-A-Way</td><td>Polysciences</td><td>R-30</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011069</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 20x TBS Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28358</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Kit</td> <td>de ensayoThermo Fisher Scientific</td><td>23236</td><td>Estándar de albúmina incluido</td></tr><tr><td>ProLon Gold Mountant Anti-Fading</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td>FcR</td></tr><tr><td>block RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>SoftMax Pro 6.1</td></tr><tr><td>software Filtros de células estériles 100 y micro; M</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de vancomicina</td><td>Goldbio</td><td>V-200-1</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Aqua</td><td>Biolegend</td><td>423102</td><td>colorante fluorescente para el análisis de citometría de flujo</td></tr></tbody></table>

análisis de proteinuria, infiltración renal de leucocitos y depósito renal de proteínas en ratones lmr/lpr propensos al lupus

Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice

El lupus eritematoso sistémico (LES) es un trastorno autoinmune sin cura conocida y se caracteriza por una inflamación persistente en muchos órganos, incluidos los riñones. En tales circunstancias, el riñón pierde su capacidad de limpiar los desechos de la sangre y regular las concentraciones de sal y líquidos, lo que eventualmente conduce a insuficiencia renal. Las mujeres, particularmente las en edad fértil, son diagnosticadas nueve veces más a menudo que los hombres. La enfermedad renal es la principal causa de mortalidad en pacientes con LES. El presente protocolo describe un método rápido y simple para medir los niveles de proteína excretada en la orina recolectada, rastreando la progresión del lupus a lo largo del tiempo. Además, se proporciona un enfoque para aislar células mononucleares renales basado en la selección de tamaño y densidad para investigar la infiltración renal de leucocitos. Además, se ha desarrollado un método inmunohistoquímico para caracterizar la deposición de proteínas en los glomérulos y la infiltración leucocitaria en el espacio tubulointersticial. Juntos, estos métodos pueden ayudar a investigar la progresión de la inflamación crónica asociada con los riñones de ratones MRL / lpr propensos al lupus.

El protocolo utiliza múltiples métodos para evaluar los ratones MRL/lpr para la nefritis lúpica. En primer lugar, se describe un procedimiento para estudiar el aumento de los niveles de proteinuria debido a la disfunción renal a lo largo del tiempo. Como se muestra en la Figura 1, los ratones hembra fueron tratados con sonda oral de 200 μL de solución salina tamponada con fosfato (1x PBS) como grupo control y probiótico Lactobacillus reuteri como grupo de tratamiento, a una concentr...

El presente protocolo describe un método para rastrear la progresión del lupus en ratones. Se presentan dos procedimientos adicionales para caracterizar la nefritis lúpica basada en la infiltración celular y la deposición de proteínas en los riñones.

Análisis de proteinuria, infiltración renal de leucocitos y depósito renal de proteínas en ratones LMR/LPR propensos al lupus

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disorder with no known cure and is characterized by persistent inflammation in many organs, including ...

Estos métodos pueden ayudar a investigar la progresión de la inflamación crónica asociada con los riñones en pacientes con lupus. Estamos ofreciendo una alternativa confiable y rentable que se puede utilizar para controlar el curso de la enfermedad en el lupus. Comience a esterilizar la campana rociando etanol al 70% y coloque una lámina de plástico estéril en la superficie.Luego prepare puntas, tubos de 1,5 mililitros y una pipeta para recoger unos 20 microlitros de la orina. Tome la jaula y rocíe etanol al 70% antes de colocarla dentro de la campana. Después, sostenga el mouse con una mano y use la otra mano para masajear suavemente el área ventral de arriba a abajo.Con un tubo o pipeta de 1,5 mililitros, recoja la orina directamente. O si la muestra gotas recógela de la lámina de plástico. Luego vuelva a colocar el mouse en la jaula.Corte los riñones disecados en tamaño de grano y digiera en cinco mililitros de tampón de digestión que contenga colagenasa y DNasa 1 en medio RPMI 1640 que contiene HEPES durante una hora con agitación suave continua a 37 grados centígrados. Añadir 10 mililitros de PBS helado que contenga 10 milimolares de EDTA e incubar durante 10 minutos sobre hielo. Luego vortex la suspensión dos veces.Posteriormente, filtre la suspensión celular a través de un colador de 100 micrómetros y lave con 10 mililitros de HBSS lleno. Después, centrifugar a 350 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Prepare una solución isotónica de Percoll al 30, 37 y 70% y agregue una capa de solución de Percoll al 37% sobre la solución al 70%.Re suspender las células en cinco mililitros de 30% de stock isotónico Percoll. Usando una pipeta Pasteur cargue lentamente el 37% de cinco mililitros en la parte superior y el 70% de cinco mililitros en la parte inferior, lo que hace que el gradiente isotónico estándar de Percoll. Luego, centrifugar con el número nueve arriba y el número cero hacia abajo a 1000 veces G durante 30 minutos a temperatura ambiente.Después, recoger leucocitos de la interfaz 37 a 70% y volver a suspenderlos en cinco mililitros de C 10. Nuevamente, centrifugar a 350 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Posteriormente, vuelva a suspender el pellet celular en tres mililitros de tampón de fax y centrifugar a 350 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Luego deseche el sobrenadante dejando unos 50 microlitros del volumen total. Agregue 50 microlitros de bloqueo del receptor FC por tubo. Después de esta mezcla e incubar en hielo en la oscuridad durante 10 minutos.Más tarde, agregue dos mililitros de búfer de fax para lavar. Luego, centrifugar a 350 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante dejando unos 50 microlitros del volumen total. A continuación, agregue 20 microlitros del tinte fluorescente apropiado y déjelo reposar durante 15 a 30 minutos en hielo.Añadir 50 microlitros de mezcla de anticuerpos por tubo que contenga CD 138 violeta brillante siete 11 y CD 45 Alexa Fluor 700 e incubar en hielo en la oscuridad durante 15 a 30 minutos. Después, agregue tres mililitros de búfer de fax. Centrifugar a 350 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Retirar el sobrenadante al vacío dejando unos 50 microlitros del volumen total. Posteriormente, se vuelve a suspender el pellet celular en 200 microlitros de PBS. Para recoger la muestra, incruste la mitad del riñón en el pequeño criomold de plástico con el compuesto de temperatura de corte óptimo.Luego agregue hielo seco en una caja de espuma de poliestireno y coloque cuidadosamente el criomold sobre el hielo seco. A continuación, retire el molde criogénico, envuélvalo en papel de aluminio y guárdelo a menos 80 grados centígrados hasta que se vuelva a usar. Luego fije las secciones secas a cuatro micrómetros con acetona fría durante 10 minutos.Después de fijar los portaobjetos, seque al aire durante 0,5 a una hora y guárdelos a menos 20 grados centígrados durante un corto período de tiempo o menos 80 grados centígrados durante mucho tiempo. Para teñir las muestras, vuelva a fijar los portaobjetos en acetona fría durante cinco a 10 minutos y deje que las secciones se calienten a temperatura ambiente. Después, usando un bolígrafo, dibuje un círculo hidrófobo alrededor de la sección y deje que se seque.Luego coloque las diapositivas en TBS en el frasco de Copeland durante 20 minutos y agite suavemente colocando el frasco en la coctelera. Posteriormente, vierta TBS y llene el frasco con TBS 5% BSA y 0.1% TW 20. Más tarde, incubar el frasco durante 20 minutos agitando suavemente sobre la coctelera.Luego, saque las diapositivas y limpie la parte inferior de las diapositivas. Agregue 100 microlitros de anticuerpos conjugados C3 fit C e IgG2 APE a la sección e incube la temperatura ambiente en una cámara humidificada durante una hora. Lave la sección tres veces en PBS 5% BSA y 0.1% TW 20 durante 10 minutos en la coctelera y luego seque las diapositivas.Monte la sección con un reactivo antidecoloración y luego con un cubreobjetos. Luego guarde los portaobjetos a cuatro grados centígrados hasta que los vea bajo el microscopio. Para el análisis de imágenes utilizando el software de imagen J, describa la región deseada.Luego, establezca parámetros estándar haciendo clic en analizar y luego establecer mediciones y área de medición para obtener los resultados. A continuación, transfiera los datos obtenidos de las ventanas de medida a una hoja de cálculo. Una vez hecho esto, haga clic en analizar para medir la región y transferir los datos nuevamente a la hoja de cálculo anterior.Los niveles de proteína en la orina de ratones LMR LMR se detectaron a lo largo del tiempo, donde fueron tratados con solución salina tamponada con fosfato como grupo control y lactobacillus reuteri como grupo de tratamiento. El grupo de ratones tratados con L.reuteri en una progresión de proteinuria más agresiva que el grupo control. El análisis por fax se realizó para los leucocitos renales aislados para analizar las células plasmáticas.Además, los ratones fueron tratados con vancomicina o vancomicina junto con ADN bicatenario de Escherichia coli. Aunque se esperaba que el ADN bicatenario de Escherichia coli desencadenara la infiltración renal, no se encontraron diferencias significativas en el porcentaje de células plasmáticas. El complemento C3 e IgG2a se detectaron mediante tinción de inmunofluorescencia en secciones renales de LMR IPR femenino.Los factores ambientales efectivos en la deposición renal de C3 e IgG2a se compararon para el pan de ratones interno en la instalación para animales y los comprados a un proveedor. El análisis inmunohistoquímico no mostró ninguna diferencia entre los dos grupos. Agregar cada capa de la solución ISO 20 Percoll de stock porcentual puede ser un desafío, y si se mezclan, debe comenzar de nuevo.Este procedimiento ayuda con el citómetro de flujo y los experimentos in vitter, por lo que no se pueden estudiar los diferentes tipos de poblaciones de células renales. Este procedimiento nos permite estudiar los infiltrados de células B en los riñones y no hay mucha información en la literatura.

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Investigación

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Immunology and Infection

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