Name: Extirpación de ojos en larvas vivas de pez cebra para examinar el crecimiento dependiente de la inervación y el desarrollo del sistema visual (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprende la extirpación unilateral de ojos en larvas de Danio rerio para estudiar el desarrollo del tálamo óptico y la neurobiología del crecimiento nervioso. Este método permite comparar lóbulos inervados y desnervados.

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El financiamiento para este trabajo fue apoyado principalmente por fondos de inicio de Reed College a KLC, fondos de Helen Stafford Research Fellowship a OLH y una beca de investigación científica de Reed College a YK. Este proyecto comenzó en el laboratorio de Steve Wilson como una colaboración con Recursos Humanos, quien fue apoyado por un Wellcome Trust Studentship (2009-2014). Agradecemos a Máté Varga, Steve Wilson y otros miembros del laboratorio Wilson por las discusiones iniciales sobre este proyecto, y agradecemos especialmente a Florencia Cavodeassi y Kate Edwards, quienes fueron las primeras en enseñar a KLC cómo montar embriones en agarosa y realizar disecciones cerebrales de pez cebra. También agradecemos a Greta Glover y Jay Ewing por su ayuda con el montaje de nuestro dispositivo de afilado con aguja de tungsteno.

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Las técnicas descritas en este artículo ilustran uno de los muchos enfoques para estudiar el desarrollo del sistema visual de vertebrados en el pez cebra. Otros investigadores han publicado métodos para diseccionar la retina embrionaria y realizar análisis de expresión génica19 o visualizar la actividad neuronal en el tectum óptico30. Este artículo proporciona un enfoque para explorar cómo la entrada diferencial de la retina puede influir en los comportamientos celulares en...

El objetivo de este método es investigar cómo la entrada de retina influye en el crecimiento y desarrollo del tectum óptico, el centro de procesamiento visual en el cerebro del pez cebra. Al extraer un ojo y luego comparar los dos lados del tectum óptico, se pueden observar y normalizar los cambios técnicos dentro de la misma muestra, lo que permite la comparación entre múltiples muestras. Los enfoques moleculares modernos combinados con esta técnica proporcionarán información sobre los mecanismos subyacentes al crecimiento y desarrollo del sistema visual, así como a la degeneración y regeneración axonal.
Los sistemas sensoriales (visual, auditivo y somatosensorial) recopilan información de los órganos externos y transmiten esa información al sistema nervioso central, generando "mapas" del mundo externo a través delmesencéfalo 1,2. La visión es la modalidad sensorial dominante para casi todos los vertebrados, incluidos muchos peces. La retina, el tejido neural en el ojo, recopila información con un circuito neuronal que consiste principalmente en fotorreceptores, células bipolares y células ganglionares de la retina (RGC), las neuronas de proyección de la retina. Los RGC tienen axones largos que encuentran su camino a través de la superficie interna de la retina hasta la cabeza del nervio óptico, donde fasciculan y viajan juntos a través del cerebro, terminando finalmente en el centro de procesamiento visual en el mesencéfalo dorsal. Esta estructura se denomina tectum óptico en peces y otros vertebrados no mamíferos y es homóloga al colículo superior en mamíferos3.
El tectum óptico es una estructura multicapa bilateralmente simétrica en el mesencéfalo dorsal. En el pez cebra y la mayoría de los otros peces, cada lóbulo del tectum óptico recibe información visual únicamente del ojo contralateral, de modo que el nervio óptico izquierdo termina en el lóbulo tectal derecho y el nervio óptico derecho termina en el lóbulo tecttal izquierdo4 (Figura 1). Al igual que su contraparte en mamíferos, el colículo superior, el tectum óptico integra la información visual con otras entradas sensoriales, incluyendo la audición y la somatosensación, controlando los cambios en la atención visual y los movimientos oculares como las sacadas 1,5,6. Sin embargo, a diferencia del colículo superior de los mamíferos, el tectum óptico genera continuamente nuevas neuronas y glía a partir de un nicho especializado de células madre cerca de los bordes medial y caudal de los lóbulos tectales llamado zona de proliferacióntectal 7. El mantenimiento de progenitores proliferativos en el tectum óptico y otras regiones del sistema nervioso central contribuye, en parte, a la notable capacidad regenerativa documentada en el pez cebra8.
Trabajos previos que examinaron los cerebros de peces ciegos o tuertos revelaron que el tamaño del tectum óptico es directamente proporcional a la cantidad de inervación retiniana que recibe 9,10,11. En los peces de cueva adultos, cuyos ojos degeneran en la embriogénesis temprana, el tectum óptico es notablemente más pequeño que el de los peces de superficie avistados estrechamente relacionados9. La degeneración del ojo de pez de cueva se puede bloquear reemplazando la lente endógena con una lente de un pez de superficie durante la embriogénesis. Cuando estos peces de cueva tuertos se crían hasta la edad adulta, el lóbulo tectal inervado contiene aproximadamente un 10% más de células que el lóbulo tectal no inervado9. Del mismo modo, en los killifish larvales que fueron incubados con tratamientos químicos para generar ojos de diferentes tamaños dentro del mismo individuo, el lado del tectum con más inervación era más grande y contenía más neuronas10. La evidencia de los experimentos de aplastamiento del nervio óptico en peces de colores adultos indica que la inervación promueve la proliferación, con la proliferación de células tectales disminuyendo cuando se interrumpió la inervación11.
Confirmando y extendiendo estos estudios clásicos, varios informes recientes proporcionan datos que sugieren que la proliferación en respuesta a la inervación está modulada, al menos en parte, por la vía BDNF-TrkB12,13. Quedan muchas preguntas abiertas sobre el crecimiento y desarrollo del tectum óptico, incluida la forma en que un sistema sensorial en desarrollo hace frente a las lesiones y la degeneración del axón, qué señales celulares y moleculares permiten que la entrada de la retina regule el crecimiento del tectum óptico, cuándo estos mecanismos se activan y si la proliferación y la diferenciación vinculadas a la inervación permiten que la retina y su tejido objetivo coordinen las tasas de crecimiento y garanticen un mapeo retinotópico preciso. Además, hay preguntas mucho más grandes sobre el desarrollo dependiente de la actividad que se pueden abordar interrogando el sistema visual del pez cebra con enfoques quirúrgicos como el que se describe a continuación.
Para investigar los mecanismos celulares y moleculares por los cuales la actividad neuronal, específicamente a partir de la entrada visual, altera la supervivencia y proliferación celular, el enfoque descrito compara directamente los lóbulos tectales inervados y denervados (Figura 1) dentro de larvas individuales de pez cebra. Este método permite la documentación de la degeneración del axón RGC en el tectum óptico y la confirmación de que el número de células mitóticas se correlaciona con la inervación.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63509/63509fig01.jpg"> Figura 1: Bocetos de larvas de pez cebra antes y después de la extracción unilateral del ojo. (A) Dibujo de larvas de 5 dpf vistas bajo un microscopio de disección. Cada larva está incrustada en agarosa de bajo punto de fusión y orientada lateralmente antes de que se use una aguja de tungsteno con una punta afilada y enganchada para sacar el ojo hacia arriba (ojo izquierdo en este ejemplo). (B) Dibujo de la vista dorsal de una larva de 9 dpf resultante de la cirugía representada en A. Solo tres axones RGC altamente esquematizados del ojo derecho se muestran desfasciculando y conectando con neuronas en el lóbulo tectal izquierdo. Abreviaturas: dpf = días después de la fertilización; dps = días después de la cirugía; RGC = células ganglionares de la retina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63509/63509fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td><fuerte>Equipos y suministros:</fuerte>Cajas de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>cría</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning grasa de alto vacío</td><td>Sigma o proveedor equivalente</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>matraces Erlenmeyer (125 mL)</td><td></td><td></td><td>Para la fabricación de Marc's Modified Ringers (MMR) con antibióticos para la incubación postoperatoria.</td></tr><tr><td>Pinzas finas - Dumont #5</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur de vidrio</td><td>DWK Lifescience</td><td>63A53 & 63A53WT</td><td>Para pipetear embriones y larvas.</td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio para microscopía</td><td>VWR o proveedor equivalente</td><td>48311-703</td><td>Los portaobjetos de vidrio estándar para microscopio se pueden pedir a muchos proveedores de laboratorio diferentes.</td></tr><tr><td>Cristalería, incluidas botellas graduadas y cilindros</td><td></td><td></td> graduados <td>para fabricar y almacenar soluciones.</td></tr><tr><td>Resina epoxi de 2 partes</td><td>ACE Hardware u otro proveedor equivalente de Gorilla Glue o</td><td>jeringa equivalente de 0,85 oz</td><td>https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793</td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga (1,7 mL)</td><td>VWR o proveedor equivalente</td><td>22234-046</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de pasador niquelado (17 cm de longitud)</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>26018-17</td><td>Para sujetar alambre de tungsteno mientras se afila y se realizan cirugías/disecciones.</td></tr><tr><td>Colador de té de malla de nailon o equivalente</td><td>Ali Express o equivalente</td><td></td><td>Para la recolección de huevos de pez cebra después del desove; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html</td></tr><tr><td>Clip</td><td></td><td></td><td>para el dispositivo de afilado de agujas de tungsteno.</td></tr><tr><td>Placas de Petri 100 mm</td><td>Fischer Scientific o proveedor equivalente</td><td>50-190-0267</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri 35 mm</td><td>Fischer Scientific o proveedor equivalente</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de pipeta</td><td>SP Bel-Art o equivalente</td><td>F37898-0000</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio (KOH)</td><td>Sigma</td><td>909122</td><td>Para dispositivo de afilado de agujas de tungsteno. Haga una solución al 10% p/v de KOH en la campana agregando gránulos al agua desionizada.</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación (voltaje variable)</td><td></td><td></td> <td>para dispositivo de afilado de agujas de tungsteno. Cualquier fuente de alimentación con voltaje variable funcionará (incluso una utilizada para electroforesis en gel).</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit de elastómero</td><td>Dow Corning</td><td>3097358</td><td></td></tr><tr><td>Alambre de tungsteno (0,125 mm de diámetro)</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>TGW0515</td><td>Afilar para eliminar el ojo y diseccionar larvas.</td></tr><tr><td>Bloque de calor de temperatura variable</td><td>The Lab Depot o</td><td>proveedor equivalente BSH1001 o BSH1002</td><td>Ajuste a 40-42 &deg; C antes de los experimentos.</td></tr><tr><td>Frasco de vidrio de boca ancha con tapa (por ejemplo, tarro de mermelada o salsa limpio)</td><td></td><td></td><td>Para dispositivo de afilado de agujas de tungsteno.</td></tr><tr><td>Cables con cables</td><td></td><td></td> de pinza de cocodrilo <td>para el dispositivo de afilado de agujas de tungsteno.</td></tr><tr><td><Microscopios fuertes>:</td> Microscopio </fuerte> disección Cualquier tipo funcionará, pero es preferible tener luz transmitida ajustable en una base espejada<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Se recomienda un microscopio</td><td></td><td></td> confocal de barrido láser <td>de alta NA, se recomienda una lente de objetivo de inmersión en agua de 20-25x. Aquí se utiliza el software de control de microscopio y captura de imágenes (NIS-Elements de Nikon), pero cualquier microscopio confocal funcionará.</td></tr><tr><td><fuerte>Reactivos para cirugías y disecciones:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>para Marc's Ringers modificados (MMR) y medio embrionario (E3).</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td><td>para los timbres modificados de Marc (MMR).</td></tr><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td>Hacer 1% en medio embrionario (E3) o Marc's Modified Ringers (MMR).</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Sigma</td><td>1374248</td><td>Para medio embrionario (E3).</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td>para Marc's Modified Ringers (MMR).</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>19210</td><td>Diluido al 8% (p/v) de stock con 2x PBS concentrado (diluido a partir de 10x stock de PBS).</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333-20ML</td><td>diluido 1:100 en los timbres modificados de Marc.</td></tr><tr><td>Comprimidos de solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Diagnostic BioSystems</td><td>DMR E404-01</td><td>Realice 10 veces el stock en agua desionizada, autoclave y almacene a temperatura ambiente. Diluir hasta 1x concentración de trabajo.</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td>para Marc's Modified Ringers (MMR) y medio embrionario (E3).</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>para Marc's Modified Ringers (MMR) y medio embrionario (E3).</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td>Haga 10 M y utilícelo para ajustar el pH de MMR a 7.4.</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Pentair</td><td>100G #TRS1</td><td>Receta: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE</td></tr><tr><td><fuerte>Reactivos para inmunohistoquímica:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexafluor 568 etiquetado Anticuerpo secundario para detectar IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11011</td> de conejo <td>Uso en dilución 1:500 para montaje completo inmunohistoquímica.</td></tr><tr><td>DAPI o ToPro3</td><td>Invitrogen</td><td>1306 o T3605</td><td>Prepare soluciones de 1 mg/mL en DMSO; dilución 1:5.000 para contratinción.</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Un componente del tampón inmunobloque.</td></tr><tr><td>Metanol (MeOH)</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td>La mezcla de MeOH con soluciones acuosas como PBST es exotérmica. Prepare las soluciones de MeOH/PBST con al menos varias horas de anticipación o enfríelas en hielo antes de usarlas.</td></tr><tr><td>Suero normal de cabra</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-062Z</td><td>Un componente del tampón immunoblock. Se puede alícuota en volúmenes de 1-10 mL y almacenar a -20 °C.</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario para detectar fosfohistona H3</td><td>Millipore</td><td>06-570</td><td>Uso en dilución 1:300 para inmunohistoquímica de montaje completo.</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario para detectar proteína fluorescente roja (RFP; detecta derivados de dsRed)</td><td>MBL International</td><td>PM005</td><td>Uso en dilución 1:500 para inmunohistoquímica de montaje completo.</td></tr><tr><td>Proteinasa K (PK)</td><td>Sigma</td><td>P2308-10MG</td><td>Prepare soluciones madre de 10 mg/mL en PBS y úselas en 10 &micro; g/mL.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Útil para hacer una solución madre al 20% (v/v) en PBS.</td></tr><tr><td>Software para el análisis de datos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (Fiji)</td><td></td><td></td><td>Freeware para el análisis de imágenes; https://imagej.net/software/fiji/</td></tr> <tr><td>RStudio</td><td></td><td></td><td>Freeware para el análisis estadístico y la visualización de datos; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td></tr> <tr><td>Adobe Photoshop o GIMP</td><td></td><td></td><td>A menudo se utilizan software de procesamiento de imágenes propietario (Adobe Photoshop e Illustrator) para componer figuras). Una alternativa gratuita es Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)</td></tr><tr><td>Zebrafish strains. Este estudio utilizó las cepas AB, TU, Tg[atoh7:RFP].</td><td></td><td></td><td>Disponible en el&nbsp; Centros de Recursos Internacionales de Pez Cebra en los EE. UU. (https://zebrafish.org/home/guide.php) o en Europa (https://www.ezrc.kit.edu/). Las cepas transgénicas especializadas que aún no se han depositado en ninguno de los centros de recursos se pueden solicitar a los laboratorios individuales después de su publicación.</td></tr></tbody></table>

extirpación de ojos en larvas vivas de pez cebra para examinar el crecimiento dependiente de la inervación y el desarrollo del sistema visual

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

El pez cebra exhibe un notable crecimiento de por vida y habilidades regenerativas. Por ejemplo, los nichos especializados de células madre establecidos durante la embriogénesis apoyan el crecimiento continuo de todo el sistema visual, tanto en el ojo como en el cerebro. El crecimiento coordinado entre la retina y el tectum óptico garantiza un mapeo retinotópico preciso a medida que se agregan nuevas neuronas en los ojos y el cerebro. Para abordar si los axones de la retina proporcionan información crucial para regular los comportamientos de las células madre y progenitoras tectales, como la supervivencia, la proliferación y / o la diferenciación, es necesario poder comparar los lóbulos tectales inervados y denervados dentro del mismo animal y entre animales. 
La extirpación quirúrgica de un ojo del pez cebra larval vivo seguida de la observación del tectum óptico logra este objetivo. El video que lo acompaña muestra cómo anestesiar larvas, afilar electrolíticamente agujas de tungsteno y usarlas para extirpar un ojo. A continuación, muestra cómo diseccionar cerebros de larvas fijas de pez cebra. Finalmente, el video proporciona una visión general del protocolo para la inmunohistoquímica y una demostración de cómo montar embriones teñidos en agarosa de bajo punto de fusión para microscopía.

Para confirmar si la extirpación ocular fue completa y evaluar cómo cambia el tectum óptico, se realizaron cirugías en la cepa Tg[atoh7:RFP], que marca todas las RGC con una RFP dirigida a la membrana y, por lo tanto, todos los axones que se proyectan desde la retina y forman el nervio óptico24. Aunque el uso de esta cepa no es absolutamente necesario, permite la observación y visualización directa del nervio óptico termini en el tectum neuropil óptico. Otros enfoques para etiquetar el ne...

El artículo explica cómo extirpar quirúrgicamente los ojos de las larvas vivas de pez cebra como el primer paso hacia la investigación de cómo la entrada de retina influye en el crecimiento y desarrollo del tectum óptico. Además, el artículo proporciona información sobre la anestesia larvaria, la fijación y la disección cerebral, seguida de inmunohistoquímica e imágenes confocales.

Extirpación de ojos en larvas vivas de pez cebra para examinar el crecimiento dependiente de la inervación y el desarrollo del sistema visual

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

Así que mi laboratorio está interesado en entender cómo el ojo y el cerebro crecen juntos. Esta técnica nos permite estudiar cómo la entrada de retina influye en el crecimiento y desarrollo del cerebro. La extirpación quirúrgica de un ojo del pez cebra larval vivo, seguida de la observación del tectum óptico, nos permite comparar lóbulos tectales inervados y denervados dentro del mismo animal y entre animales.La combinación de esta técnica con enfoques moleculares modernos puede dar una nueva visión de los mecanismos subyacentes al desarrollo neuronal, la regeneración y la degeneración. Para comenzar, conecte los cables de cátodo y ánodo a la fuente de alimentación. Coloque el clip de cocodrilo en el extremo del alambre del cátodo a un clip parcialmente enderezado e inserte el clip en la solución de hidróxido de potasio, uniéndolo al costado del frasco.Conecte el clip de cocodrilo del alambre del ánodo al cuello del soporte de la aguja. Gire la potencia a aproximadamente 20 voltios y sumerja el cable de tungsteno en la solución de hidróxido de potasio, sacando el cable de la solución en ángulo para afilar electrolíticamente el cable en una punta fina. Revise la punta de la aguja debajo del microscopio de disección para asegurarse de que sea lo suficientemente afilada.La punta de la aguja curva se produce cuando la aguja afilada se dobla tocándola suavemente en la placa de Petri. El día de la cirugía, use una pipeta de pasto de vidrio de diámetro ancho para transferir de 10 a 15 larvas a una placa de Petri de 35 milímetros llena de E3 fresco. Agregue de tres a cinco gotas de anestésico a la larva. Para determinar si las larvas están adecuadamente anestesiadas, busque la falta de respuesta táctil.Agregue dos o tres gotas más del anestésico si las larvas aún responden al tacto después de tres minutos y vuelva a evaluar. Para inmovilizar la larva para la cirugía, lleve una larva a una pipeta de pasto de vidrio de diámetro estrecho con solo una pequeña cantidad de E3. A continuación, tome aproximadamente 200 microlitros de punto de fusión fundido al 1% bajo o agarosa LMP en la pipeta que contiene la larva y mezcle para asegurarse de que la larva esté suspendida en la agarosa LMP. Coloque la tapa de una placa de Petri de 35 milímetros boca arriba bajo el microscopio de disección, luego rocíe la larva y la agarosa sobre la tapa de la placa de Petri al revés.Extienda la agarosa para que la larva esté en el centro de la gota. Usando una aguja de tungsteno opaca, maniobre rápida pero suavemente la larva para que quede lateral con un ojo hacia arriba. Espere varios minutos para que la agarosa se establezca.Siguiendo el borde de la órbita del ojo, use la punta de una aguja de tungsteno fina y afilada electrolíticamente para perforar la piel alrededor del ojo. Luego deslice el borde de la aguja debajo del ojo desde el lado temporal-ventral del ojo. Use presión controlada para liberar el ojo de la cuenca.Siga presionando el ojo dorsal y anteriormente con el lado de la aguja, eventualmente cortando a través del nervio óptico y liberando el ojo. Alternativamente, puede usar fórceps quirúrgicos muy finos para extirpar el ojo pellizcando el nervio óptico y empujando el ojo de medial a lateral. Después de la extracción exitosa del ojo, cubra la agarosa con solución MMR, libere a cada larva de la agarosa cepillando suavemente una aguja de tungsteno alrededor de su cabeza y luego alrededor de su cuerpo, mientras estabiliza la tapa de la placa de Petri con fórceps.Después de las cirugías, coloque la larva en una solución MMR suplementada con antibióticos hasta el día siguiente, luego devuelva la larva al E3 y recuévala hasta el punto final del experimento. Después de que las larvas se anestesian terminalmente, fíjelas con paraformaldehído al 4%. Suspenda las larvas fijas en gotas de PBS en una placa de protección de sellos bajo un microscopio de disección.Asegúrelos lateralmente colocando dos pasadores de tungsteno a través de la notocorda con un pasador posterior al área pigmentada que cubre la región AGM y otro en línea con el extremo de la extensión de la yema. Retire el ojo con una aguja de tungsteno afilada y fórceps finos. A veces es posible pasar la aguja a través de la mandíbula hasta el lado opuesto y extraer el otro ojo.Use la aguja de tungsteno para rascarse desde el lado temporal hasta el ventral de la oreja. En la misma acción en movimiento, lleve la aguja hacia atrás de la mandíbula y tire suavemente hacia arriba hasta que se retiren la oreja y la mandíbula. Extraiga el otro ojo y la oreja metiendo la aguja a través de la mandíbula.Use fórceps para extraer los órganos ventrales y la yema restante. Finalmente, haga una incisión poco profunda en la piel craneal dorsal cerca de la unión entre el cerebro posterior y la médula espinal. Levante la piel con las pinzas y tire de ella hacia arriba y alrededor del telencéfalo.Retire cualquier tejido restante con fórceps. Desancle la larva y transfiérala a PBS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Asegure un portaobjetos con cámara en la tapa de una placa de Petri de 100 milímetros con grasa al vacío.Transfiera la larva inmunoteñida y procesada a una placa de pozo o portaobjetos de depresión para verlas con un microscopio de disección. Monte la larva en el portaobjetos con cámara en columnas de agarosa 1%LMP. Usando un vaso más allá de su pipeta, coloque una larva en el portaobjetos con cámara, depositando la menor cantidad de PBS posible.Cubra la larva con agarosa 1%LMP derretida y tibia con la misma pipeta. Pipetear la agarosa LMP en una columna y luego colocar la larva lo más simétricamente posible con la superficie dorsal visible. Después de la extirpación ocular, se observó degeneración progresiva de los axones de la retina en el tectum neuropil óptico.A los dos días después de la cirugía, los axones etiquetados con RFP exhibieron características distintivas de la rápida degeneración walleriana, como balbuceos y fragmentación. Se observaron puncta positivos de RFP tanto dentro como fuera del neuropil en el lado derecho del tectum como lo indican las flechas. A los cuatro días después de la cirugía, los axones fragmentados y los restos axonales marcados con RFP se redujeron considerablemente en el lóbulo tecttal derecho, lo que indica una eliminación relativamente rápida de los axones moribundos y degenerativos.El cerebro fue expuesto diseccionando los ojos, la mandíbula, las orejas y la escutelaria de la piel y los tejidos conectivos. Idealmente, el cerebro permanece intacto durante este procedimiento. Sin embargo, partes del cerebro anterior, particularmente el bulbo olfativo, probablemente se dañaron o se eliminaron por completo cuando se eliminó la tapa del cráneo de la piel o la mandíbula.Además, a veces la cornisa lateral del tectum se corta al perforar o pellizcar la piel para sacarla del cerebro. No hay dos muestras idénticas. Por lo tanto, debe poder hacer adaptaciones sutiles a través de la extirpación de los ojos y la disección cerebral según sea necesario.Los pacientes y las herramientas afiladas son esenciales para el éxito. Esta técnica puede ser seguida con enfoques celulares y moleculares, como imágenes de células vivas in vivo o secuenciación de ARN para obtener nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares y celulares del crecimiento y desarrollo del tectum óptico.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

En este vídeo, que muestran un método para analizar el cerebro de los vertebrados en desarrollo en embriones de pez cebra en vivo con una resolución única célula mediante microscopía confocal. Esto incluye el método por el cual se inyecta el embrión del pez cebra de una sola célula y, posteriormente, montar y obtener imágenes del cerebro en desarrollo.

Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

Lente del desarrollo implica interacciones con otros tejidos. Varios mutantes ojo de pez cebra se caracteriza por un tamaño anormalmente pequeño lente. Aquí se demuestra un experimento de trasplante de lentes para determinar si este fenotipo se debe a causas intrínsecas o interacciones defectuosas con los tejidos que rodean a la lente.

Trasplante de lentes en el pez cebra y su aplicación en el análisis de mutantes de ojos

El VisioTracker es un sistema automatizado para el análisis cuantitativo de los resultados visuales de peces adultos de larvas y pequeños basados ​​en el registro de los movimientos oculares. Cuenta con un control total sobre propiedades de los estímulos visuales y análisis en tiempo real, permitiendo la investigación de alto rendimiento en áreas como el desarrollo del sistema visual y la función, la farmacología, los estudios neuronales del circuito y la integración sensoriomotora.

VisioTracker, un enfoque innovador para el análisis automatizado oculomotor

Fuente: Schramm, P. et al. Obtención de imágenes in vivo de tejido cerebral completamente activo en larvas y juveniles de pez cebra despiertos mediante la extracción de cráneo y piel. J. Vis. Exp. (2021)Este video muestra la imagen in vivo de neuronas cerebelosas en larvas de pez cebra transgénicas, que expresan proteínas fluorescentes en neuronas de Purkinje. El proceso consiste en anestesiar las larvas, inmovilizarlas en agarosa y eliminar cuidadosamente la piel pigmentada para mejorar la...

Imágenes in vivo del cerebro de larvas de pez cebra para visualizar neuronas cerebelosas

Presentamos un método para el análisis electrorretinográfico (ERG) de larvas de pez cebra utilizando técnicas de micromanipulación y electrorretinografía. Este es un método simple y directo para analizar la función visual de las larvas de pez cebra in vivo.

Análisis Electrorretinograma de la respuesta visual en pez cebra larvas

La microscopía de fluorescencia de lámina de luz es una excelente herramienta para obtener imágenes del desarrollo embrionario. Permite la grabación de vídeos de largo lapso de tiempo de embriones vivos en condiciones casi fisiológicas. Demostramos su aplicación para obtener imágenes del desarrollo del ojo del pez cebra a través de amplias escalas espacio-temporales y presentamos una línea para la fusión y deconvolución de conjuntos de datos multivista.

Utilización de hojas de luz de microscopía de fluorescencia a la imagen de ojo de pez cebra Desarrollo

Se implementó una combinación de las técnicas de microscopía con largo excitación de fluorescencia de varios fotones de longitud de onda del láser ópticas avanzadas para capturar imágenes de alta resolución, tridimensionales en tiempo real de la migración de la cresta neural en Tg (sox10:EGFP) y los embriones de pez cebra de Tg (foxd3:GFP).

La proyección de imagen de lapso tiempo multi-Photon para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de la migración de las células de cresta Neural en embriones de pez cebra

Aquí, presentamos un protocolo que simplifica la medición de respuestas de luz electroretinograma evocados de pez cebra larval. Un electrodo de punta de esponja novela en forma de cono puede ayudar a hacer el estudio de desarrollo visual en el pez cebra larvas usando el electrorretinograma ERG más fácil de lograr con resultados confiables y de menor costo.

Grabación de electroretinograma en larvas de pez cebra con electrodo de punta de esponja en forma de un cono de novela

Este protocolo describe un enfoque para el etiquetado in toto y la imagen multidimensional del desarrollo temprano del ojo del pez cebra. Describimos el etiquetado, la incrustación y las imágenes de cuatro dimensiones (4D) utilizando microscopía confocal de barrido láser, y las consideraciones para optimizar la adquisición de conjuntos de datos para diseccionar los mecanismos de la morfogénesis de la copa óptica.

Imágenes en 4 dimensiones de la morfogénesis de la copa óptica del pez cebra

Aquí presentamos un método para obtener imágenes del cerebro embrionario del pez cebra in vivo hasta etapas larvales y juveniles. Este procedimiento microinvasivo, adaptado de enfoques electrofisiológicos, proporciona acceso a detalles celulares y subcelulares de neuronas maduras y se puede combinar con estudios optogenéticos y neurofarmacológicos para caracterizar la función cerebral y la intervención farmacológica.

Imágenes in vivo de tejido cerebral completamente activo en larvas y juveniles de pez cebra despiertos mediante la extirpación del cráneo y la piel

Aquí, se proporciona un protocolo para imágenes de lapso de tiempo de la morfogénesis ocular utilizando un microscopio de hoja de luz disponible comercialmente y una estación de trabajo de procesamiento de imágenes para analizar los datos resultantes. Este protocolo detalla los procedimientos para la anestesia embrionaria, la incrustación en agarosa a baja temperatura de fusión, la suspensión en la cámara de imágenes, la configuración de los parámetros de imagen y, finalmente, el análisis de...

Visualización de la morfogénesis ocular mediante microscopía de hoja de luz utilizando rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Aprende la extirpación unilateral de ojos en larvas de Danio rerio para estudiar el desarrollo del tálamo óptico y la neurobiología del crecimiento nervioso. Este método permite comparar lóbulos inervados y desnervados.

Extirpación de ojos en larvas vivas de pez cebra para examinar el crecimiento dependiente de la inervación y el desarrollo del sistema visual (Video) | JoVE Journal

Extirpación de ojos en larvas vivas de pez cebra para examinar el crecimiento dependiente de la inervación y el desarrollo del sistema visual

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