Name: Aislamiento de la microglía primaria del ratón mediante clasificación celular activada magnéticamente en modelos animales de desmielinización (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: Aprende a aislar microglía primaria de lesiones de desmielinización en cerebro de ratón adulto mediante clasificación celular activada magnéticamente. Este protocolo optimiza el tiempo y los recursos para estudiar características microgliales in vivo.

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El estudio fue apoyado por la Fundación para Jóvenes Científicos Excelentes del Hospital Tongji (HUST) (Subvención No. 2020YQ06).

Todos los procedimientos animales han sido aprobados por el Comité del Instituto de Cuidado Animal del Colegio Médico Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong, China.
1. Materiales
<ol><li>Prepare las siguientes soluciones antes de comenzar el protocolo.<ol>
<li>Prepare el tampón de carga agregando suero fetal bovino (FBS, 2%) a solución salina tamponada con fosfato (PBS).</li>
		<li>Agregue el tinte rojo neutro (NR) (1% final) a PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare las siguientes soluciones utilizando el kit de disociación cerebral para adultos disponible en el mercado (consulte la Tabla de materiales).<ol>
<li>Para preparar la mezcla de enzimas 1, pipetee 1,9 ml de Buffer Z y 50 μL de enzima P en un tubo centrífugo de 15 ml.</li>
		<li>Para preparar la mezcla de enzimas 2, pipetee 20 μL de Buffer Y y 10 μL de Enzima A en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Prepare la solución de eliminación de escombros.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Perfusión y disección de ratones
<ol><li>Inyecte por vía intraperitoneal (i.p.) al ratón 500 μL de colorante NR al 1% en PBS 2-3 h antes de la anestesia. NOTA: La inyección intraperitoneal de NR en modelos de ratón desmielinizantes ayuda a discernir las lesiones (Figura 1).</li>
	<li>Anestesiar al ratón con pentobarbital (50 mg/kg, i.p.) y asegurarse de que el ratón se anestesia con éxito examinando las respuestas al dolor.</li>
	<li>Abra la cavidad torácica del ratón y exponga el corazón.</li>
	<li>Corte una pequeña esquina de la aurícula derecha con cuidado y perfunda intracárdicamente al ratón con 20-30 ml de PBS frío del ventrículo izquierdo.</li>
	<li>Decapitar al ratón bajo anestesia.</li>
	<li>Abra el cráneo del ratón y libere cuidadosamente el cerebro del cráneo.</li>
	<li>Transfiera el cerebro al molde de corte de cerebro de ratón y corte el cerebro en rodajas de 0,1 cm.</li>
	<li>Retire las rodajas cerebrales y colóquelas en PBS frío en una placa de Petri (60/15 mm). Microdisectar las lesiones marcadas por el tinte NR alrededor del cuerpo calloso bajo un estereomicroscopio utilizando pinzas microquirúrgicas. NOTA: Asegúrese de que el tejido disecado sea lo más completo posible para facilitar la transferencia posterior; el progreso total de la disección debe completarse en 2 h.</li>
	<li>Transfiera el tejido disecado a tubos centrífugos de 15 ml que contengan la cantidad adecuada de tampón de carga en frío. NOTA: Agrupe el tejido del cuerpo calloso de 2-3 ratones en un tubo como una muestra.</li>
</ol>3. Disociación tisular
<ol><li>Centrifugar el tejido diseccionado a 300 ×g durante 30 s (después de alcanzar esta velocidad) para recoger la muestra en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Precalentar la mezcla de enzimas 1 y mezclar las enzimas de 2 a 37 °C en una incubadora.</li>
	<li>Añadir 1.950 μL de mezcla de enzimas precalentadas 1 a una muestra y digerir en una incubadora a 37 °C durante 5 min.</li>
	<li>Añadir 30 μL de mezcla de enzimas precalentadas 2 y mezclar suavemente.</li>
	<li>Digerir en una incubadora a 37 °C durante 15 min y mezclar suavemente cada 5 min.</li>
	<li>Agregue 4 ml de PBS frío al tubo después de la digestión y agite suavemente.</li>
	<li>Coloque filtros de 70 μm en tubos centrífugos de 50 ml y pretuite los filtros con 500 μL de PBS frío. Filtre el tejido disociado pasando las muestras de tejido digerido a través de los filtros y transfiera la suspensión filtrada en el tubo centrífugo de 50 ml a un tubo de centrífuga de 15 ml. NOTA: Omita este paso si la cantidad de tejido es demasiado pequeña.</li>
	<li>Centrifugar las muestras de tejido filtrado a 300 ×g durante 10 min a 4 °C y aspirar el sobrenadante lenta y completamente. NOTA: Todos los pasos deben realizarse sobre hielo excepto la digestión enzimática.</li>
</ol>4. Eliminación de escombros
<ol><li>Resuspend el pellet celular suavemente con 1.550 μL de PBS frío.</li>
	<li>Agregue 450 μL de solución fría para eliminar los desechos y mezcle bien.</li>
	<li>Superponga la mezcla anterior muy lenta y suavemente con 2 x 1 ml de PBS frío utilizando una pipeta de 1.000 μL. NOTA: Incline el tubo de la centrífuga en 45 ° y agregue lentamente PBS a lo largo de la pared del tubo con la pipeta.</li>
	<li>Transfiera el tubo lenta y suavemente a una centrífuga y gire a 4 °C y 3.000 × g durante 10 min.</li>
	<li>Busque tres capas después de la centrifugación. Aspirar las dos capas superiores completamente utilizando una pipeta de 1.000 μL (Figura 2).</li>
	<li>Llene el tubo hasta 5 ml con tampón de carga en frío e invierta suavemente el tubo tres veces.</li>
	<li>Centrifugadora a 4 °C y 1.000 × g durante 10 min. Aspire el sobrenadante por completo y evite interrumpir el gránulo celular.</li>
</ol>5. Separación magnética de células microgliales
<ol><li>Resuspend el pellet celular con 90 μL de tampón de carga y agregue 10 μL de perlas CD11b (Microglia).</li>
	<li>Mezclar bien e incubar durante 15 min a 4 °C.</li>
	<li>Añadir 1 ml de tampón de carga y pipetear el líquido suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1.000 μL para lavar las células después de la incubación. Centrifugar las células a 4 °C y 300 × g durante 10 min y aspirar el sobrenadante por completo para eliminar las perlas no unidas.</li>
	<li>Resuspendir las celdas en 500 μL de tampón de carga.</li>
	<li>Coloque la columna MS con su separador para la selección positiva en el campo magnético.</li>
	<li>Enjuague la columna con 500 μL de tampón de carga para proteger las células y garantizar la eficiencia de la clasificación magnética basada en el protocolo del fabricante.</li>
	<li>Aplique la suspensión de celdas en la columna MS y deseche el flujo que contiene celdas sin etiquetar.</li>
	<li>Agregue 500 μL de búfer de carga a la columna tres veces para eliminar las celdas que se adhieren a la pared de la columna y descartar el flujo. NOTA: Solo agregue un nuevo búfer de carga para lavar cuando el depósito de columna esté completamente vacío.</li>
	<li>Retire la columna del separador después de lavar la columna y colóquela en un tubo centrífugo de 15 ml.</li>
	<li>Agregue 1 ml de búfer de carga en la columna y empuje el émbolo hacia la parte inferior de la columna para eliminar las celdas marcadas magnéticamente. Repita este paso tres veces para recolectar completamente las células marcadas magnéticamente.</li>
</ol>

<ol><li>Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGinhoux%2C+F+%22Science%22">Science</a>. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).</li>
<li>Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchulz%2C+C+%22Science%22">Science</a>. 336 (6077), New York, N.Y. 86-90 (2012).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaolicelli%2C+RC+%22Science%22">Science</a>. 333 (6048), New York, N.Y. 1456-1458 (2011).</li>
<li>Squarzoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+modulate+wiring+of+the+embryonic+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain.</a> Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).</li>
<li>Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer+V+cortical+neurons+require+microglial+support+for+survival+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).</li>
<li>Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+regulate+the+number+of+neural+precursor+cells+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).</li>
<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+function+in+the+central+nervous+system+during+health+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration.</a> Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+microglial+subset+in+development%2C+aging%2C+and+disease%3A+Lessons+from+transcriptomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 430(2020).</li>
<li>Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+its+role+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Neuroscience+and+Oxidative+Stress%22%5BJournal%5D)">Microglia and its role in neurodegenerative diseases.</a> Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).</li>
<li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2Fbrain+macrophages+as+central+drivers+of+brain+tumor+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li>
<li>Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+the+brain%3A+Complementary+partners+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).</li>
<li>Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+dynamics+during+human+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglial dynamics during human brain development.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1014(2018).</li>
<li>Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+heterogeneity+in+the+single-cell+era%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Microglia heterogeneity in the single-cell era.</a> Cell Reports. 30 (5), 1271-1281 (2020).</li>
<li>Ni, M., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+rat+primary+microglia%3A+isolation%2C+culturing%2C+and+selected+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications.</a> Current Protocols in Toxicology. , Chapter 12, Unit 12.17 (2010).</li>
<li>Yildizhan, K., Naziroglu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+depletion+and+parkinsonian+neurotoxin+MPP%28%2B%29-induced+TRPM2+channel+activation+play+central+roles+in+oxidative+cytotoxicity+and+inflammation+in+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia.</a> Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).</li>
<li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70(2019).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li>
<li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).</li>
<li>Pan, J., Wan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+comparison+of+FACS+and+MACS+isolation+of+enriched+microglia+and+astrocytes+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain.</a> Journal of Immunological Methods. 486, 112834(2020).</li>
<li>Baydyuk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+evolution+of+CNS+remyelinating+lesion+in+mice+with+neutral+red+dye%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).</li>
<li>Sahel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+synaptic+connectivity+of+oligodendrocyte+precursor+cells+following+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination.</a> Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77(2015).</li>
<li>Schroeter, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+brain-all+cells%3A+A+comprehensive+protocol+to+isolate+all+principal+CNS-resident+cell+types+from+brain+and+spinal+cord+of+adult+healthy+and+EAE+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice.</a> Cells. 10 (3), 651(2021).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+microdissected+mouse+brain+tissue+for+artifact+free+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100590(2021).</li>
<li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+sequencing+reveals+glial+specific+responses+to+tissue+processing+%26+enzymatic+dissociation+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Holt, L. M., Olsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+applications+of+magnetic+cell+sorting+to+analyze+cell-type+specific+gene+and+protein+expression+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system.</a> PLoS One. 11 (2), 0150290(2016).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+analysis+reveals+quiescent+microglia+isolation+methods+from+postnatal+mouse+brains+and+limitations+of+BV2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153(2018).</li>
</ol>

Los autores han declarado que no existen intereses contrapuestos.

El protocolo propone un método para aislar la microglía alrededor de las lesiones desmielinizantes, que puede ayudar a estudiar las características funcionales de la microglía en las enfermedades inflamatorias desmielinizantes. La microglía capturada con perlas CD11b exhibe una alta pureza y viabilidad. Los pasos críticos en el protocolo incluyen la localización precisa de los focos y la purificación microglial óptima. En el paso de protocolo 2.1, es necesario inyectar la solución NR 2 h antes de sacrificar el ratón para...

La microglía se origina a partir de progenitores de saco vitelino, que llegan al cerebro embrionario muy temprano y participan en el desarrollo del SNC 1,2. Por ejemplo, están involucrados en la poda sináptica3 y regulan el crecimiento axonal4. Secretan factores que promueven la supervivencia neuronal y ayudan a la localización neuronal5. Al mismo tiempo, están involucrados en la eliminación de células anormales y células apoptóticas para garantizar el desarrollo normal del cerebro6. Además, como las células inmunocompetentes del cerebro, la microglía vigila continuamente el parénquima cerebral para eliminar las células muertas, las sinapsis disfuncionales y los desechos celulares7. Se ha demostrado que la activación microglial juega un papel importante en una variedad de enfermedades, incluidas las enfermedades inflamatorias desmielinizantes, las enfermedades neurodegenerativas y los tumores cerebrales. La microglía activada en la esclerosis múltiple (EM) contribuye a la diferenciación de las células precursoras de oligodendrocitos (OPC) y a la regeneración de la mielina al envolver los restos de mielina8.
En la enfermedad de Alzheimer (EA), la acumulación de beta amiloide (Aβ) activa la microglía, que afecta las funciones fagocíticas e inflamatorias de la microglía9. La microglía activada en el tejido del glioma, llamada microglía asociada al glioma (GAM), puede regular la progresión del glioma y, en última instancia, afectar el pronóstico de los pacientes10. La activación altera profundamente el transcriptoma microglial, lo que resulta en cambios morfológicos, expresión de receptores inmunes, aumento de la actividad fagocítica y aumento de la secreción de citoquinas11. Existen diferentes subconjuntos de microglía activada en enfermedades neurodegenerativas como la microglía asociada a la enfermedad (DAM), la microglía de respuesta activada (ARM) y el fenotipo neurodegenerativo microglial (MGnD)8.
Del mismo modo, múltiples subconjuntos funcionales dinámicos de microglia también coexisten en el cerebro en enfermedades desmielinizantes inflamatorias12. Comprender la heterogeneidad entre los diferentes subconjuntos de microglía es esencial para investigar la patogénesis de las enfermedades inflamatorias desmielinizantes y encontrar sus posibles estrategias terapéuticas. La heterogeneidad de la microglía depende principalmente de la especificidad molecular8. Es esencial describir con precisión las alteraciones moleculares de la microglía para el estudio de la heterogeneidad. Los avances en la tecnología de secuenciación de ARN unicelular (RNA-seq) han permitido identificar las características moleculares de la microglía activada en condiciones patológicas13. Por lo tanto, la capacidad de aislar poblaciones celulares es fundamental para una mayor investigación de estas células diana en condiciones específicas.
Los estudios realizados para comprender las características y funciones de la microglía suelen ser estudios in vitro, ya que se ha encontrado que se puede preparar y cultivar un gran número de microglía primaria a partir de cerebros de cachorros de ratón (1-3 días de edad), que se adhieren a los matraces de cultivo y crecen en la superficie plástica con otras células gliales mixtas. Posteriormente, la microglía pura se puede aislar en función de la diferente adhesividad de las células gliales mixtas14,15. Sin embargo, este método solo puede aislar la microglía del cerebro perinatal y toma varias semanas. Las variables potenciales en el cultivo celular pueden influir en las características microgliales como la expresión molecular16. Además, la microglía aislada por estos métodos solo puede participar en experimentos in vitro simulando las condiciones de las enfermedades del SNC y no puede representar las características y funciones de la microglía en estados de enfermedad in vivo. Por lo tanto, es necesario desarrollar métodos para aislar la microglía del cerebro del ratón adulto.
La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y la separación magnética son dos métodos ampliamente utilizados, aunque tienen sus propias limitaciones diferentes 16,17,18,19. Sus respectivas ventajas y desventajas se contrastarán en la sección de discusión. La maduración de la tecnología MACS ofrece la posibilidad de purificar rápidamente las células. Huang et al. han desarrollado un método conveniente para etiquetar lesiones desmielinizantes en cerebros20. Combinando estos dos enfoques técnicos, proponemos un protocolo de separación magnética columnar CD11b rápido y eficiente, proporcionando una descripción paso a paso para aislar la microglía alrededor de lesiones desmielinizantes en cerebros de ratones adultos y preservar las características moleculares de la microglía. Las lesiones desmielinizantes focales fueron causadas por la inyección estereotáctica de 2 μL de solución de lisolecitina (1% LPC en NaCl al 0,9%) en el cuerpo calloso 3 días antes de iniciar el protocolo21. Este protocolo sienta las bases para realizar el siguiente paso en experimentos in vitro. Además, este protocolo ahorra tiempo y sigue siendo factible para su uso generalizado en varios experimentos.

<table><tbody><tr><td>Micro tubos de centrífuga de 1,5 mL</td><td>BIOFIL</td><td>CFT001015</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubos de centrífuga</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011150</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubos de centrífuga</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011500</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Filtro</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Kit de disociación cerebral para adultos, ratón y rata</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-107-677</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Ratones</td><td>SJA Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b (Microglía) Perlas, humano y ratón</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-634</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>BOSTER PYG0001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>BD Biosciences</td><td>V10</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separador</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>Columnas MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Rojo Neutro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1013690025</td><td></td></tr><tr><td>NovoCyte Citómetro de flujo</td><td>Agilent</td><td></td><td>Un sistema compuesto por de varias partes</td></tr><tr><td>NovoExpress</td><td>Agilent</td><td>1.4.1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>BOSTER</td><td>PYG0021</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-010</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>MshOt</td><td>MZ62</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de la microglía primaria del ratón mediante clasificación celular activada magnéticamente en modelos animales de desmielinización

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

La microglía, las células inmunes innatas residentes en el cerebro, son las principales respuestas a la inflamación o lesión en el sistema nervioso central (SNC). La microglía se puede dividir en estado de reposo y estado activado y puede cambiar rápidamente de estado en respuesta al microambiente del cerebro. La microglía se activará bajo diferentes condiciones patológicas y exhibirá diferentes fenotipos. Además, hay muchos subgrupos diferentes de microglía activada y una gran heterogeneidad entre los diferentes subgrupos. La heterogeneidad depende principalmente de la especificidad molecular de la microglía. Los estudios han revelado que la microglía se activará y jugará un papel importante en el proceso patológico de la desmielinización inflamatoria. Para comprender mejor las características de la microglía en enfermedades inflamatorias desmielinizantes como la esclerosis múltiple y el trastorno del espectro de la neuromielitis óptica, proponemos un protocolo de clasificación microglial primaria perilesional. Este protocolo utiliza la clasificación de células activadas magnéticamente columnares (MACS) para obtener microglía primaria altamente purificada y preservar las características moleculares de la microglía para investigar los efectos potenciales de la microglía en enfermedades inflamatorias desmielinizantes.

La microglía aislada con perlas CD11b tiene una alta pureza Las células microgliales alrededor de las lesiones en modelos de ratón de desmielinización se aislaron utilizando el protocolo mencionado anteriormente y se probaron mediante citometría de flujo. Las células se marcan fluorescentemente con ISOtiocianato de CD11b-fluoresceína (FITC) y CD45-aloficocianina (APC) para determinar la microglía en la citometría de flujo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Existen múltiples literaturas q...

Aquí, presentamos un protocolo para aislar y purificar la microglía primaria en modelos animales de enfermedades desmielinizantes, utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente columnares.

Aislamiento de la microglía primaria del ratón mediante clasificación celular activada magnéticamente en modelos animales de desmielinización

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

Este protocolo ayuda a aislar la microglía de las lesiones de desmielinización microdiseccionadas del cerebro del ratón adulto para estudiar las características microgliales in vivo. Esta técnica ahorra tiempo y tiene requisitos más bajos tanto para los experimentadores como para los equipos. Este método ayuda a aislar la microglía del cerebro del animal, especialmente aquellos tejidos microdiseccionados en varios estados de enfermedad.Comience por microdisectar las lesiones marcadas por tinte neutro alrededor del cuerpo calloso bajo un estereomicroscopio. Centrifugar el tejido disecado a 300 veces g durante 30 segundos para recoger la muestra en la parte inferior del tubo. Precalentar la mezcla de enzimas uno y mezclar la enzima de dos a 37 grados Celsius en una incubadora.Luego, agregue 1, 950 microlitros de mezcla de enzimas precalentadas una a una muestra y digiera en una incubadora a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Agregue 30 microlitros de mezcla de enzimas precalentadas dos y mezcle suavemente. Después de la digestión, agregue cuatro mililitros de PBS frío al tubo y agite suavemente.Centrifugar las muestras de tejido a 300 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, y aspirar el sobrenadante lenta y completamente. Resuspend la célula gránulo suavemente con 1, 550 microlitros de PBS frío. Agregue 450 microlitros de la solución fría para la eliminación de escombros y mézclelos bien.Use una pipeta de 1, 000 microlitros para superponer la mezcla muy lentamente y suavemente con dos mililitros de PBS frío. Centrifuga la mezcla y luego busca las tres capas. Use una pipeta de 1. 000 microlitros para aspirar completamente las dos capas superiores y llene el tubo hasta cinco mililitros con tampón de carga en frío.Invierta suavemente el tubo tres veces. A continuación, después de la centrifugación y aspiración del sobrenadante, resuspenda el pellet celular con 90 microlitros de tampón de carga, y agregue 10 microlitros de perlas CD11b. Mezclar bien e incubar durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.Después de la incubación, agregue un mililitro del tampón de carga y lave las células canalizando suavemente el líquido hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1, 000 microlitros. Centrifugar las células a 300 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, y aspirar el sobrenadante por completo para eliminar las perlas no unidas. Resuspender las celdas en 500 microlitros del búfer de carga, y colocar la columna MS con su separador para la selección positiva en el campo magnético.Enjuague la columna con 500 microlitros del tampón de carga para proteger las células y garantizar la eficiencia de la clasificación magnética según el protocolo del fabricante. Aplique la suspensión celular sobre la columna MS y deseche el flujo que contiene las celdas no etiquetadas. Agregue 500 microlitros del búfer de carga para lavar la columna y retírela del separador.Coloque la columna en un tubo centrífugo de 15 mililitros y agregue un mililitro del búfer de carga a la columna. Finalmente, empuje el émbolo hacia la parte inferior de la columna para eliminar las celdas marcadas magnéticamente. Aquí se muestra una representación esquemática de la estrategia de gating utilizada en el análisis de citometría de flujo de microglia aislada de lesiones de desmielinización de ratones adultos antes y después de la clasificación celular activada magnéticamente.Las imágenes gráficas representan la altura de dispersión hacia adelante y la altura de dispersión lateral para seleccionar células, el área de dispersión hacia adelante y la altura de dispersión hacia adelante para seleccionar celdas individuales, y CD11b-FITC y CD45-APC para seleccionar las células mieloides y la microglía. La proporción de microglía ha aumentado significativamente después de la clasificación celular activada magnéticamente. La imagen gráfica representa la estrategia de cierre utilizada en el análisis de citometría de flujo para células individuales vivas y muertas después de la clasificación de células activadas magnéticamente.Aquí, la 7-aminoactinomicina D y la altura de dispersión lateral se han utilizado para seleccionar las células vivas. Al intentar este procedimiento, recuerde microdiseccionar con precisión las lesiones desmielinizantes bajo un estereomicroscopio basado en las marcas rojas neutras.

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

En este video, describimos un protocolo para aislar células CD11b, incluida la microglía, de cerebros de cachorros de ratón utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente. Los tejidos cerebrales se homogeneizan para obtener suspensiones unicelulares, que se incuban con microesferas recubiertas de anticuerpos anti-CD11b, seguidas de una separación basada en columna magnética para purificar la población de células CD11b+.

Aislamiento magnético de microglía a partir de cerebros de cachorros de ratón

Este video muestra un método para aislar células primarias de oligodendrocitos de una suspensión de células neuronales obtenida de una cría de ratón utilizando separación magnética. La técnica emplea perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos específicos contra los antígenos de los oligodendrocitos, lo que permite el aislamiento selectivo de estas células.

Aislamiento de oligodendrocitos primarios murinos mediante perlas inmunomagnéticas

Este video muestra un protocolo para extraer células microgliales de lesiones desmielinizantes en cerebros de ratones utilizando la clasificación magnética de células. El protocolo consiste en diseccionar el tejido cerebral lesionado que contiene células microgliales, tratar el tejido con enzimas específicas para obtener una suspensión unicelular y utilizar perlas magnéticas específicas del receptor microglial para aislar las células microgliales.

Aislamiento de microglía de lesiones desmielinizantes del cerebro de ratón mediante clasificación de células activadas magnéticamente

Aquí, se presenta un protocolo para aislar microglia de crías de ratón postnatal (día 1) para la experimentación in vitro. Este método improvisada de aislamiento genera tanto alto rendimiento y pureza, una ventaja significativa sobre métodos alternativos que permite amplia experimentación gama para los fines de elucidar la biología microglial.

El aislamiento magnético rápida y refinado CD11b de la microglia primaria con mayor pureza y versatilidad

Se presenta un protocolo para el aislamiento de primaria microglia del cerebro murino. Esta técnica ayuda a promover la comprensión actual de condiciones neurológicas. Centrifugación de gradiente de densidad y separación magnética se combinan para producir suficiente rendimiento de una muestra muy pura. Además, describiremos los pasos para la caracterización de la microglia.

Caracterización y aislamiento de Microglia primarios de ratón por centrifugación de gradiente de densidad

Describimos el aislamiento Inmunomagnética de los oligodendrocitos primario de ratón, que permite el aislamiento rápido y específico de las células para el cultivo en vitro .

Aislamiento Inmunomagnética rápida y específica de los oligodendrocitos primarios de ratón

Proporcionamos un protocolo para el aislamiento de la microglia de diferentes regiones diseccionadas de un hemisferio cerebral de ratón adulto, seguido de la preparación de la biblioteca semiautomática para la secuenciación profunda de ARN de una sola célula de transcriptomes de longitud completa. Este método ayudará a dilucidar la heterogeneidad funcional de la microglia en salud y enfermedad.

Aislamiento de microglia específica de la región del hemisferio cerebral de un ratón adulto para la secuenciación profunda del ARN de una sola célula

Los cultivos primarios de microglía se utilizan comúnmente para evaluar nuevas moléculas antiinflamatorias. El presente protocolo describe un método reproducible y relevante para aislar magnéticamente la microglía de cachorros neonatos.

Aislamiento magnético de células microgliales de ratones neonatos para cultivos celulares primarios

Describimos un protocolo para aislar células microgliales del hipotálamo del ratón (o pequeñas estructuras cerebrales equivalentes) utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS), en un tiempo relativamente corto. La microglía hipotalámica clasificada por MACS se puede utilizar para análisis ex vivo y se puede sembrar para realizar ensayos in vitro .

Aislamiento de microglía hipotalámica a partir de cerebro de ratón adulto recién perfundido mediante clasificación de células activadas magnéticamente  

Se establecieron modelos de ratón de leucomalacia periventricular (LPV), la lesión cerebral predominante en los bebés prematuros se caracteriza por lesiones de sustancia blanca periventricular. Hipoxia / isquemia con / sin infección sistémica son las causas principales de la FPV. La ligadura de carótida unilateral y la exposición hipoxia con / sin inyección de lipopolisacárido crea PVL-como lesiones en los ratones P6.

Los modelos de ratón de la Retinopatía

Aprende a aislar microglía primaria de lesiones de desmielinización en cerebro de ratón adulto mediante clasificación celular activada magnéticamente. Este protocolo optimiza el tiempo y los recursos para estudiar características microgliales in vivo.

Aislamiento de la microglía primaria del ratón mediante clasificación celular activada magnéticamente en modelos animales de desmielinización (Video) | JoVE Journal

Aislamiento de la microglía primaria del ratón mediante clasificación celular activada magnéticamente en modelos animales de desmielinización

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