Aislamiento de la microglía primaria del ratón mediante clasificación celular activada magnéticamente en modelos animales de desmielinización
5 de abril de 2022
Aquí, presentamos un protocolo para aislar y purificar la microglía primaria en modelos animales de enfermedades desmielinizantes, utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente columnares.
Este protocolo ayuda a aislar la microglía de las lesiones de desmielinización microdiseccionadas del cerebro del ratón adulto para estudiar las características microgliales in vivo. Esta técnica ahorra tiempo y tiene requisitos más bajos tanto para los experimentadores como para los equipos. Este método ayuda a aislar la microglía del cerebro del animal, especialmente aquellos tejidos microdiseccionados en varios estados de enfermedad.
Comience por microdisectar las lesiones marcadas por tinte neutro alrededor del cuerpo calloso bajo un estereomicroscopio. Centrifugar el tejido disecado a 300 veces g durante 30 segundos para recoger la muestra en la parte inferior del tubo. Precalentar la mezcla de enzimas uno y mezclar la enzima de dos a 37 grados Celsius en una incubadora.
Luego, agregue 1, 950 microlitros de mezcla de enzimas precalentadas una a una muestra y digiera en una incubadora a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Agregue 30 microlitros de mezcla de enzimas precalentadas dos y mezcle suavemente. Después de la digestión, agregue cuatro mililitros de PBS frío al tubo y agite suavemente.
Centrifugar las muestras de tejido a 300 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, y aspirar el sobrenadante lenta y completamente. Resuspend la célula gránulo suavemente con 1, 550 microlitros de PBS frío. Agregue 450 microlitros de la solución fría para la eliminación de escombros y mézclelos bien.
Use una pipeta de 1, 000 microlitros para superponer la mezcla muy lentamente y suavemente con dos mililitros de PBS frío. Centrifuga la mezcla y luego busca las tres capas. Use una pipeta de 1. 000 microlitros para aspirar completamente las dos capas superiores y llene el tubo hasta cinco mililitros con tampón de carga en frío.
Invierta suavemente el tubo tres veces. A continuación, después de la centrifugación y aspiración del sobrenadante, resuspenda el pellet celular con 90 microlitros de tampón de carga, y agregue 10 microlitros de perlas CD11b. Mezclar bien e incubar durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.
Después de la incubación, agregue un mililitro del tampón de carga y lave las células canalizando suavemente el líquido hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1, 000 microlitros. Centrifugar las células a 300 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, y aspirar el sobrenadante por completo para eliminar las perlas no unidas. Resuspender las celdas en 500 microlitros del búfer de carga, y colocar la columna MS con su separador para la selección positiva en el campo magnético.
Enjuague la columna con 500 microlitros del tampón de carga para proteger las células y garantizar la eficiencia de la clasificación magnética según el protocolo del fabricante. Aplique la suspensión celular sobre la columna MS y deseche el flujo que contiene las celdas no etiquetadas. Agregue 500 microlitros del búfer de carga para lavar la columna y retírela del separador.
Coloque la columna en un tubo centrífugo de 15 mililitros y agregue un mililitro del búfer de carga a la columna. Finalmente, empuje el émbolo hacia la parte inferior de la columna para eliminar las celdas marcadas magnéticamente. Aquí se muestra una representación esquemática de la estrategia de gating utilizada en el análisis de citometría de flujo de microglia aislada de lesiones de desmielinización de ratones adultos antes y después de la clasificación celular activada magnéticamente.
Las imágenes gráficas representan la altura de dispersión hacia adelante y la altura de dispersión lateral para seleccionar células, el área de dispersión hacia adelante y la altura de dispersión hacia adelante para seleccionar celdas individuales, y CD11b-FITC y CD45-APC para seleccionar las células mieloides y la microglía. La proporción de microglía ha aumentado significativamente después de la clasificación celular activada magnéticamente. La imagen gráfica representa la estrategia de cierre utilizada en el análisis de citometría de flujo para células individuales vivas y muertas después de la clasificación de células activadas magnéticamente.
Aquí, la 7-aminoactinomicina D y la altura de dispersión lateral se han utilizado para seleccionar las células vivas. Al intentar este procedimiento, recuerde microdiseccionar con precisión las lesiones desmielinizantes bajo un estereomicroscopio basado en las marcas rojas neutras.
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Visión general
Este estudio presenta un protocolo para aislar y purificar microglía primaria de lesiones de desmielinización en cerebros de ratones adultos. Utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente en columna, el método facilita el estudio de las características de la microglía in vivo mientras optimiza los requisitos de tiempo y recursos.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Neuropatología
Antecedentes
- La microglía juega roles críticos en la neuroinflamación y las enfermedades del sistema nervioso central.
- Entender su función en condiciones desmielinizantes es esencial para comprender los mecanismos de la enfermedad.
- Se necesitan técnicas de aislamiento efectivas para estudiar la microglía caracterizada por estados patológicos específicos.
- El método presentado se enfoca en mejorar la eficiencia en el aislamiento de estas células.
Propósito del estudio
- Desarrollar un protocolo confiable para el aislamiento de microglía de las áreas objetivo del cerebro.
- Facilitar el estudio del comportamiento de la microglía y sus roles en el contexto de las enfermedades desmielinizantes.
- Optimizar el uso de recursos durante el proceso de aislamiento.
Métodos utilizados
- Microdisección de tejido de lesiones de desmielinización bajo un estereomicroscopio.
- Uso de clasificación de células activadas magnéticamente en columna para el aislamiento de microglía.
- Los pasos incluyen digestión de tejido, centrifugación y resuspendido suave para un aislamiento eficiente de células.
- Los pasos clave involucran la preparación de enzimas, múltiples secuencias de centrifugación y el manejo cuidadoso de las muestras de microglía.
Resultados principales
- El protocolo mejora significativamente la proporción de microglía aislada.
- El análisis de citomeía de flujo demostró la clasificación exitosa de células mieloides y la identificación específica de microglía.
- Se realizó tinción de células vivas y muertas para evaluar la viabilidad celular y confirmar la clasificación exitosa.
- El método permite una comprensión más completa de las respuestas de la microglía en condiciones desmielinizantes.
Conclusiones
- Este estudio demuestra un método efectivo para aislar microglía, facilitando futuras investigaciones sobre su papel en enfermedades neurológicas.
- La técnica de aislamiento contribuye a avanzar en el conocimiento del comportamiento de la microglía in vivo, haciéndola aplicable para varios modelos de enfermedades.
- Este protocolo puede mejorar los estudios dirigidos a intervenciones terapéuticas que se enfocan en la función de la microglía en enfermedades neurodegenerativas.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of primary microglia from demyelinated mouse brain tissue enables precise investigation of innate immune responses in disease-relevant CNS models. This capability supports mechanistic de-risking and target validation for neuroinflammatory and demyelinating disease pipelines. High-purity microglial preparations facilitate translational continuity from discovery through preclinical research in neuroimmunology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microglial activation states and phenotypic heterogeneity in disease-relevant CNS tissue.
- Supports functional target validation by preserving molecular characteristics of microglia from pathological lesions.
- Facilitates mechanistic de-risking for neuroinflammatory targets by isolating primary cells from in vivo models.
Screening & Assay Development
- Provides validated primary microglia for downstream functional assays and compound screening.
- Improves assay reproducibility and standardization by delivering high-purity, viable cell populations.
- Enables quantitative flow cytometry readouts for cell identity and viability, supporting robust assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker discovery in demyelinating conditions.
- Maintains continuity from in vivo discovery to preclinical validation by preserving microglial molecular profiles.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling direct study of microglial responses in pathological CNS environments.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for neuroinflammatory and demyelinating disease research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microglial activation and heterogeneity in CNS lesions.
- Screening: Delivers reproducible, high-purity microglia for functional and phenotypic assays.
- Analytics: Enables quantitative flow cytometry analysis of cell identity, viability, and population shifts.
- Translational Research: Preserves disease-relevant molecular features for biomarker and mechanistic studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for isolating primary CNS immune cells across models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuroimmune target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Streamlines cell isolation with lower equipment and expertise requirements.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision quality by enabling direct study of primary microglia from disease models.
- Portfolio Impact: Reduces late-stage biological risk and supports risk-adjusted prioritization in neuroinflammation pipelines.
Implementation Considerations
- Requires proficiency in microdissection and handling of CNS tissue under a stereomicroscope.
- Needs access to magnetic-activated cell sorting instrumentation and flow cytometry for validation.
- Demands cross-team standardization of tissue processing and gating strategies for reproducibility.
- Adaptation may be needed for different CNS regions or disease models to maintain cell purity and viability.
- Careful lesion identification and sample handling are critical to preserve molecular characteristics.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
Mice Dissection and Tissue Dissociation
1:35
Debris Removal and Magnetic Separation of Microglial Cells
3:26
Results: Gating Strategy Used in Flow Cytometry Analysis Before and After MACS and Gating Strategy for Living/Dead Single Cells After MACS
4:27
Conclusion
