Detección y captura en tiempo real de subpoblaciones celulares invasivas a partir de cocultivos

Esta técnica permite la identificación de las células con diferentes capacidades invasivas bajo la influencia de factores secretados de células estromales cocultivadas. La técnica evalúa el impacto de los factores secretados de las células estromales o inmunes cocultivadas en la invasión celular. También permite la recuperación y análisis de subpoblaciones celulares invasivas presentes en mezclas celulares heterogéneas.

La técnica puede determinar qué tumores albergan subpoblaciones celulares invasivas que conducen a la metástasis. La captura y el análisis de células cancerosas invasivas pueden informar las decisiones terapéuticas. Para comenzar el cultivo celular, lave los cultivos celulares de adherencia que tengan aproximadamente un 70% de confluencia con solución salina tamponada con fosfato 1X.

Luego agregue 0.05% de tripsina y solución de EDTA para levantar las células. Neutralizar la solución de tripsina con medios de cultivo celular que contengan suero y contar las células utilizando una alícuota de la suspensión celular. Coloque las tres cámaras estériles en la campana de cultivo de tejidos.

Ubique la perilla en el lado corto de la cámara inferior y oriente la cámara inferior de modo que la perilla esté orientada hacia el experimentador. Agregue de 30, 000 a 50, 000 células en 90 microlitros de medios a cada pozo desde la cámara inferior sin formar burbujas. Utilice el 5% de los medios suplementados con suero fetal bovino en dos cámaras inferiores como control positivo de la motilidad celular, y use el medio suplementado con suero al 0% como control negativo.

Gire la cámara inferior a 90 grados después de dejarla reposar durante 10 a 15 minutos en la capucha. Luego coloque la cámara central en la parte superior para que la perilla de la cámara inferior se deslice hacia la muesca en la cámara central. Empuje la cámara verticalmente hacia abajo hasta que se escuche un clic desde cada uno de los lados largos del conjunto.

Agregue 160 microlitros de medios sin suero a todos los pozos de la cámara central. Asegúrese de que un menisco en forma de cúpula sea visible después de llenar los pozos y coloque la cámara superior con electrodos mirando hacia abajo en la cámara central para alinear los puntos azules en las cámaras media y superior. Empuje la cámara verticalmente hacia abajo hasta que se escuche un sonido de clic desde cada uno de los lados largos del conjunto.

Agregue de 20 a 50 microlitros de medios sin suero a la cámara superior. Monte el conjunto en el analizador celular de doble propósito en la incubadora de cultivo de tejidos y espere 30 minutos antes de medir el fondo. Abra el software del analizador de celdas, luego seleccione la base que se utilizará, seguida de un clic en la pestaña de mensajes, y asegúrese de que diga Conexiones bien"para asegurarse de que la matriz esté bien colocada en la base y que los electrodos estén bien alineados con los sensores.

Haga clic en la pestaña de notas del experimento y complete toda la información posible sobre el experimento. Luego haga clic en la pestaña de diseño y complete la descripción del diseño de la matriz. Luego haga clic en la pestaña de programación y agregue dos pasos del menú de pasos, un paso de fondo con un barrido y un paso de prueba con 100 barridos.

Una vez que la matriz haya estado en la incubadora del analizador de células de doble propósito durante 30 minutos, haga clic en el botón de reproducción para iniciar la medición de fondo. Una vez realizada la medición de fondo, retire la matriz de la base y colóquela de nuevo en la campana de cultivo celular. Luego agregue de 30, 000 a 50, 000 células en 100 microlitros de medios sin suero a cada pozo de la cámara superior.

Estas son las células que el electrodo detectará una vez que migren con éxito a través de la membrana. Deje reposar el conjunto en la campana durante 30 minutos antes de montarlo en el analizador de celdas de doble propósito para la medición de impedancia. Vuelva a colocar la matriz en el analizador de celdas de doble propósito y compruebe la pestaña de mensajes para el mensaje Conexiones correctas.

Haga clic en el botón de reproducción para iniciar la medición de impedancia y luego haga clic en la pestaña de gráfico para monitorear el progreso de la señal. Si se alcanza el punto final antes de 25 horas, haga clic en el paso de anulación del menú desplegable Ejecutar. Para exportar datos, haga clic con el botón secundario en el gráfico, elija copiar en el formato de lista y, a continuación, pegue los datos en una hoja de cálculo.

Monitoree la tasa de migración en tiempo real en el analizador de celdas de doble propósito para determinar el punto de parada de interés. Una vez logrado, desmonte el conjunto del analizador celular de doble propósito y colóquelo en la campana de cultivo de tejidos. Prepare un número apropiado de 1,5 mililitros de tubos de microcentrífuga para recoger las células de los pocillos de interés.

Coloque el conjunto en un plato de 10 centímetros para contener líquidos cuando las cámaras se desprendan. Empuje los extremos flexibles de ajuste en el lado largo de la cámara central hacia adentro hasta que se escuche un sonido de clic, seguido de desmontar la cámara superior e invertirla en un nuevo plato de 10 centímetros. Use un elevador de células con una cuchilla de 13 milímetros para recolectar las células de todos los pozos que albergan la misma condición experimental.

Enjuague o sumerja la cuchilla en solución salina tamponada con fosfato 1X para recoger las células en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Luego, gire las células a 500 veces G durante cinco minutos y propague estas células recolectadas o realice análisis de punto final, como la secuenciación de ARN de una sola célula. La evaluación de la invasión de las células en presencia o ausencia de células estromales mostró que la invasión celular MDA-MB-231 mejoró cuando la cepa J2 de fibroblastos Swiss-3T3 irradiada se asentó en la cámara inferior para el intercambio de factores entre las dos líneas celulares.

Curiosamente, la invasión de MDA-MB-231 aumentó cuando las células 3T3 J2 se duplicaron en número. Por otro lado, la tasa de invasión de un clon invasivo de células MCFDCIS, DCIS-Delta Four, parece estar inhibida por la diafonía con células 3T3 J2, lo que sugiere la valiosa aplicación de la matriz de tres cámaras para medir los efectos variables del estroma. En este caso, fibroblastos en invasión celular.

Las células endoteliales de la vena umbilical humana fueron más invasivas en respuesta a los factores secretados por las células MDA-MB-231, a diferencia de las secretadas por las células DCIS, lo que es consistente con la capacidad de los tumores invasivos para reclutar células endoteliales para la formación de vasos sanguíneos y su posterior diseminación a la circulación. La invasión de células de xenoinjerto derivadas del paciente desde la cámara superior aumentó en respuesta a las células inmunes de la médula ósea humana cocultivadas. Curiosamente, la presencia de suero del 2% en la cámara inferior con las células inmunes de la médula ósea humana fue esencial para la invasión de xenoinjertos derivados del paciente.

Los pozos se pueden recubrir con una matriz extracelular para imitar la barrera de la membrana basal. Los agentes terapéuticos se pueden agregar a los medios en los pozos para controlar su efecto sobre la invasión.