Análisis de la señalización lipídica en fotorreceptores de Drosophila mediante espectrometría de masas

Resumen

El manuscrito presenta protocolos de espectrometría de masas versátiles, robustos y sensibles para identificar y cuantificar varias clases de lípidos de fotorreceptores de Drosophila .

Resumen

La activación de la fosfolipasa Cβ (PLCβ) es un paso esencial durante la transducción sensorial en los fotorreceptores de Drosophila . La actividad de PLCβ da lugar a la hidrólisis del lípido de membrana fosfatidilinositol 4,5 bisfosfato [PI(4,5)P₂], lo que conduce en última instancia a la activación de canales de potencial receptor transitorio (TRP) y TRP similares (TRPL). La actividad de PLCβ también conduce posteriormente a la generación de muchas especies de lípidos, varias de las cuales se ha propuesto que desempeñan un papel en la activación de TRP y TRPL. Además, se ha propuesto que varias clases de lípidos desempeñan un papel clave en la organización de la biología celular de los fotorreceptores para optimizar las reacciones de señalización para una transducción sensorial óptima. Históricamente, estos descubrimientos han sido impulsados por la capacidad de aislar mutantes de Drosophila para enzimas que controlan los niveles de lípidos específicos y realizar análisis de la fisiología de los fotorreceptores en estos mutantes. Más recientemente, se han desarrollado potentes métodos de espectrometría de masas para el aislamiento y el análisis cuantitativo de lípidos con alta sensibilidad y especificidad. Estos son particularmente adecuados para su uso en Drosophila , donde ahora es posible el análisis de lípidos a partir de fotorreceptores sin la necesidad de marcar con radionúclidos. En este artículo, se cubren las consideraciones conceptuales y prácticas en el uso de la espectrometría de masas lipídicas para la evaluación cuantitativa robusta, sensible y precisa de varios lípidos de señalización en fotorreceptores de Drosophila . Junto con los métodos existentes en genética molecular y análisis fisiológico, es probable que estos lípidos aumenten el poder de los fotorreceptores como sistema modelo para los descubrimientos en biología.

Introducción

La fototransducción en Drosophila está mediada por una cascada PLCβ acoplada a la proteína G que conduce a la activación de los canales activados por luz TRP y TRPL¹. PLCβ hidroliza el fosfolípido unido a la membrana, fosfatidilinositol 4,5 bisfosfato [PI(4,5)P₂] y genera diacilglicerol (DAG) e inositol 1,4,5 trifosfato (IP₃). A continuación, el DAG es fosforilado por la DAG-quinasa para generar ácido fosfatídico (PA). Posteriormente, a través de una serie de reacciones que implican la generación de intermedios lipídicos, se regenera PI(4,5)P₂ ².....

Protocolo

1. Cría de moscas y preparación de productos químicos

1. Moscas traseras (Drosophila melanogaster) en alimento estándar para moscas en una incubadora con 50% de humedad relativa a 25 °C sin iluminación interna. Prepare el alimento para moscas agregando 80 g/L de harina de maíz, 20 g/L de D-glucosa, 40 g/L de sacarosa, 8 g/L de agar, 15 g/L de extracto de levadura, 4 mL de ácido propiónico, 0,7 g/L de TEGO (hidroxibenzoato de metilo) y 0,6 mL de ácido ortofosfórico como se describe en³⁴ y también están disponibles en https:// bangalorefly.ncbs.res.in/drosophila-media-preparatio....

Resultados

Determinación de la linealidad de la medición en MS. La linealidad es la capacidad del método MS para proporcionar resultados que son directamente proporcionales a la concentración del analito lipídico. La linealidad depende de (a) la eficiencia de ionización del analito lipídico y (b) el comportamiento de ionización del analito lipídico a diferentes concentraciones depende de la fuente de iones utilizada. En la ionización por electrospray (ESI) que se utiliza en este estudio, la linealidad se mantiene a.......

Discusión

Una serie de líneas de evidencia convergen en múltiples roles de los lípidos de señalización en la regulación de la organización y función de los fotorreceptores de Drosophila. Además del papel bien estudiado de los lípidos en la regulación de la fototransducción³, los lípidos de señalización también se han implicado en el tráfico de proteínas y la organización subcelular 23,30,39,40,41.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
HCL metanólico 0,1 N Para el			aislamiento total de lípidos
0,88% KCl	Sigma Aldrich	P9541	Para el aislamiento total de lípidos
1,5 ml / 2ml LoBind Tubos Eppendorf	Eppendorf,022431081	/022431102	Para el aislamiento total de lípidos
2.3.18 16:0/18:1 Diether PE	Lípidos polares Avanti	999974	Estándar interno de lípidos
37% HCl puro	Sigma Aldrich	320331	Para el aislamiento total de lípidos Placa
		de 96 pocillos Ensayo de	fosfato orgánico total
Acetona	Fisher Scientific	32005	Para disecciones
molibdato			Fosfato orgánico total
		ascórbico	Fosfato orgánico total
Sonicador	de baño
Columna BEH300 C18 [1,0 mm x 100 mm x 1,7 mm]	Waters India Pvt. Ltd.	186002352
Portacuchillas	Fine Scientific Tools	10052-11	Para disecciones
Incubadora			DBO Ensayo de fosfato orgánico total
Cuchillas rompibles	Fine Scientific tools	10050-00	Para disecciones
Papel mantequilla	GE healthcare	10347671	Para disecciones
C4, 300 A0, [1.7 μ m x1 mm x 100 mm] columna	Waters India Pvt. Ltd.	186004623
LC Cromatografía Viales de vidrio de color ámbar con insertos	Merck	27083-U
d18:1/17:0)	Lípidos polares Avanti	860517	Patrón interno de lípidos
d5-Fosfatidilinositol 3,5-bisfosfato [PI(3,5)P2]-16:0/16:0	Lípidos polares Avanti	850172	Patrón interno de lípidos
Microscopios	de disecciónOlympus	SZ51	Para disecciones
Baño de calor seco.
Eluyente A			Hexano:Alcohol isopropílico:100 mM acetato de amonio acuoso (68:30:2) , para LC
Eluyente B			Hexano:Alcohol isopropílico:100 mM acetato acuoso de amonio (70:20:10), para LC
Papel de filtro	Indica-HM2	74039	Para
disecciones Matraces	Borosil		Para disecciones
Moscas	NA	NA	Raghu Padinjat lab
Alimento para moscas	NA	NA	NCBS lab kitchen, composición: harina de maíz 80 g/L, D-glucosa 20 g/L, sacarosa 40 g/L, agar 8 g/L, extracto de levadura 15 g/L, ácido propiónico 4 mL, TEGO (metil para hidroxibenzoato) 0,7 g/L, ácido ortofosfórico 0,6 mL)
Pinzas	Fine Scientific Tools	11254-20	Para disecciones
Embudo de campana
	Borosil		Para disecciones
Ácido acético glacial	Fisher Scientific	A35-500	Para derivatización
Frascos de vidrio: transparente y color			Para el aislamiento total
de lípidos Tubos de vidrio sin fosfatos resistentes a altas temperaturas.			Ensayo de fosfato orgánico total
Tubos de homogeneización con perlas			Para el aislamiento total de lípidos
Instrumento homogeneizador	Precellys
CO2 conectado a las almohadillas para moscas			Para empujar moscas
Incubadoras controladas por iluminación	Panasonic Sanyo	MIR-553	Para mosca cría
Mezcla			metanol:cloroformo (2:1), Para el aislamiento total de lípidos
Grado LC-MS Cloroformo	Sigma Aldrich	650498	Para el aislamiento total
de lípidos Grado LC-MS Metanol	Sigma Aldrich	34860	Para el aislamiento total de lípidos
Agua de grado LC-MS	Sigma Aldrich	34877	Para un aislamiento total de lípidos
Ligero medidor	HTC instruments	LX-103
Puntas de baja retención	Eppendorf	0030072006/72014/72022/72030	Para el aislamiento total de lípidos
Instrumento LTQ Orbitrap XL	Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania
Ácido lisofosfatídico (LPA)- 13:0	Lípidos polares Avanti	LM-1700	Lípidos Estándar interno
Ácido lisofosfatídico (LPA)- 17:1	Lípidos polares Avanti	LM 1701	Lípidos Estándar
Interno Lisofosfatidilcolina (LPC) -13:0	Lípidos polares	Avanti LM-1600	Lípidos Estándar Interno
Lisofosfatidilcolina (LPC) -17:1	Lípidos polares Avanti	855677	Lípidos Estándar Interno
Lisofosfatidilcolina (LPC)- 19:0	Lípidos polares Avanti	855776	Patrón
Ácido perclórico.			Ensayo de fosfato orgánico total
Fosfato estándar de fosfato dihidrógeno			Ensayo de fosfato orgánico total
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	NA	NA	Composición: 137 mMNaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO4 y 1,8 mM de KH2PO4, pH 7,4
Ácido fosfatídico (PA) - 12:0/13:0	Lípidos polares de Avanti	, LM-1400	Lípidos Estándar Interno
Ácido fosfatídico (PA)- 17:0/14:1	Lípidos polares	Avanti LM-1404	Lípidos Estándar Interno
Ácido fosfatídico (PA)-(17:0/17:0)	Lípidos polares Avanti	830856	Lípidos Estándar Interno
Ácido fosfatídico (PA)-16:0-D31/18:1	Lípidos polares	860453	Pídidos Estándar
Interno Fosfatidilcolina (PC) -12:0/13:0	Lípidos polares Avanti	LM-1000	Pípidos Estándar Interno
Fosfatidilcolina (PC) - 17:0/14:1	Lípidos polares	LM-1004	Lípidos Estándar Interno
Fosfatidiletanolamina (PE) - 17:0/14:1	Lípidos polares Avanti	LM-110	Pípidos Estándar Interno
Fosfatidilinositol (PI) - 17:0/14:1	Lípidos Avanti Estándar Interno Lípidos	LM-1504	Lípidos
Fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato [PI(4,5)P2)]-17:0/20:4	Lípidos polares Avanti	LM-1904	Lípidos Estándar Interno
Fosfatidilinositol 4-fosfato (PI4P) - 17:0/20:4	Lípidos polares Avanti	LM-1901	Estándar Interno de Lípidos
Fuente robótica de iones de nanoflujo	TriVersa NanoMate (Advion BioSciences, Ithaca, NY, EE. UU.)
Rotospin instrumento	Tarsons	3090X
Almohadillas de			silicona Para disecciones
disolvente A			0,1% ácido fórmico en agua, para
LC disolvente B			0,1% ácido fórmico en acetonitrilo, para LC
Centrífuga
Termomezclador
TMS-diazometano	Acros	AC385330050	Para derivatización
Espectrómetro de masas de triple cuadrupolo	AB Sciex	QTRAP 6500
Sistema UPLC	Waters Acquity
Concentrador centrífugo de vacío	Scanvac , Labogene
Máquina

Ensayo de de amonio Ensayo de ácido LC de extractora ámbar de óxido de circonio orgánica inicial Interno de Lípidos de potasio de sobremesa de vórtice