Microdisección en capas de valvas de válvula tricúspide para caracterización mecánica biaxial y cuantificación microestructural

Este método puede aislar las contribuciones de las capas de tejido al comportamiento general del tejido, proporcionando una nueva visión de la microestructura del tejido. Nuestro marco de microdisección y pruebas nos permite comparar directamente las propiedades mecánicas y microestructurales de las valvas de las válvulas cardíacas con sus propias capas compuestas. La microdisección puede ser difícil de dominar, por lo tanto, es muy recomendable practicar tanto como sea posible antes de iniciar su estudio.

Primero, reúna los materiales requeridos, tablero de cera, agua DI, pipeta, bisturí, micro tijeras, pinzas delgadas, pinzas curvas, pinzas gruesas y pasadores. Desmonte el tejido del probador biaxial y mida su grosor utilizando el sensor de desplazamiento láser. Coloque el pañuelo en la tabla de cera.

Examine el lado ventricularis del tejido para detectar inserciones de cordas grandes. Tome una fotografía como referencia. Extienda el tejido plano sobre la tabla de cera con el auricular hacia arriba.

Para fijar el tejido a la tabla, coloque un alfiler en ángulo lejos del tejido en cada esquina para que tire ligeramente del tejido tenso. Asegúrese de que los pasadores estén fuera de los orificios creados por las púas al montar el tejido y que el tejido sea cuadrado y no se desplace durante la microdisección de la capa. Si es necesario, coloque alfileres a lo largo del costado del tejido durante la disección para estirar más el tejido.

Retire los marcadores fiduciarios de cuentas de vidrio. Coloque agua DI en la superficie del tejido con una pipeta para que cubra completamente el tejido de una manera similar a una burbuja. Para hacer la esquina inicial, seleccione una esquina de la muestra fijada, evitando grandes inserciones de corda en áreas frágiles.

Luego, corte la capa A / S arrastrando ligeramente el bisturí sobre la superficie del tejido a lo largo de los orificios de montaje para pruebas mecánicas. Los bordes del corte comienzan a separarse, revelando la capa F / V debajo. Con pinzas romas y delgadas, frote firmemente a lo largo del corte para separar aún más sus bordes.

Si el corte en la capa A / S no comienza a separarse, vuelva a trazar ligeramente sobre el mismo corte con un bisturí. Hacer un segundo corte perpendicular al primer corte. Si los dos cortes no están conectados, pase las pinzas delgadas debajo de la pequeña área de tejido que separa los dos cortes.

Luego, use cuidadosamente las tijeras para cortar el tejido. Frote a lo largo de los cortes de la esquina con pinzas delgadas hasta que el tejido se separe de la capa F / V. Tan pronto como se separe un pequeño trozo de tejido, agárrelo con las pinzas grandes y tire suavemente de él para separar aún más las capas compuestas.

Continúe pelando el tejido mientras lo agarra con pinzas más grandes para evitar el rasgado y desgarro no deseado de la capa compuesta A / S, y frote la costura hasta que llegue al final de los dos cortes realizados para la esquina. Si la primera esquina tiene problemas importantes con la separación, pruebe una esquina diferente como punto de partida. Luego, para hacer una segunda esquina, extienda los dos cortes realizados para la primera esquina colocando la punta del bisturí en la parte inferior de cada corte y arrastrándola ligeramente a lo largo de la superficie del tejido para que las extensiones cortadas se conecten a los cortes originales y continúen siguiendo los orificios de la tina o sutura.

Continúe extendiendo los cortes y pelando la capa superior compuesta de A / S hacia atrás mientras frota la costura hasta que un lado esté terminado. Observe que el tejido estará completamente separado a lo largo de un corte. A continuación, cree una segunda esquina perpendicular al extremo del lado completamente pelado.

Extienda los cortes restantes mientras evita grandes inserciones de cuerdas. Excluya las inserciones de corda del área de separación A/S solo cuando esta exclusión permita un espécimen A/S lo suficientemente grande como para caracterizaciones experimentales. Continúe separando las capas A / S y F / V utilizando las técnicas de frotamiento y tracción empleadas para la primera esquina.

Deje de separar el tejido inmediatamente si se forma un desgarro o un agujero. Para evitar que las pinzas queden atrapadas, coloque las tijeras en cualquier orificio que se forme y corte el tejido lejos del centro. Si el defecto se forma a lo largo de la costura de separación, comience a separar el tejido a lo largo de otro borde.

Busque las conexiones entre capas que pueden aparecer al separar el tejido y evite una mayor separación del tejido. Observe que estas son hebras delgadas pero fuertes que deben cortarse cuidadosamente con tijeras. Evite crear un orificio en la capa A/S o cortar hacia abajo en la capa F/V.

Continúe este proceso hasta que se haya separado la mayor muestra posible de la capa A/S. Marque la orientación de la muestra utilizando la pluma quirúrgica. Finalmente, corte a lo largo de la costura de separación para el borde de tejido restante con las tijeras.

Coloque la capa compuesta A/S separada plana sobre la estera de corte. Si es necesario, use el bisturí para enderezar los bordes del tejido y crear una forma de tejido cuadrado adecuada para las pruebas mecánicas biaxiales. Coloque la capa A / S en agua DI hasta que esté lista para ser probada.

Marque la orientación de la capa F/V que permanece en la tabla de cera. Corte el cuadrado más grande posible del área donde se eliminó la capa A / S. Luego, colóquelo en agua DI.

El análisis histológico de la valva intacta y las dos capas diseccionadas verificó si el tejido estaba correctamente separado a lo largo del borde entre la espongiosa y la fibrosa. Las micrografías histológicas se utilizaron para determinar el grosor de la capa tisular y las fracciones de masa constituyente utilizando el software ImageJ. Las pruebas mecánicas controladas por desplazamiento y el post-procesamiento produjeron datos de tensión de membrana versus estiramiento de la valva anterior de la válvula tricúspide, la valva posterior de la válvula tricúspide y la valva septal de la válvula tricúspide, que describen el comportamiento mecánico no lineal del tejido.

Los datos de imágenes del dominio de frecuencia espacial polarizada produjeron mapas de color de la orientación de la fibra de colágeno y el grado de anisotropía óptica. Específicamente, estos mapas de color proporcionaron una comprensión integral de la arquitectura de la fibra de colágeno en toda la muestra de tejido. Es importante tener en cuenta que la capa compuesta se encoge una vez que se separan del tejido fijado.

Recolecte la muestra más grande posible para asegurarse de que haya suficiente tejido para las pruebas posteriores.