Amplificación de Escherichia coli en un chip microfluídico de PCR de flujo continuo y su detección con un sistema de electroforesis capilar

Este protocolo describe cómo construir un sistema de cadena de polimerasa de flujo continuo basado en el chip microfluídico y cómo construir un sistema de electroforesis capilar en el laboratorio. Presenta una forma sencilla para el análisis de ácidos nucleicos en el laboratorio. La reacción en cadena de la polimerasa es un método tradicional empleado para la amplificación del gen diana.

Sin embargo, la PCR tradicional requiere mucho tiempo debido a la eficiencia de la variación de baja temperatura. En este trabajo se propone un sistema de PCR de flujo continuo basado en el chip microfluídico. El tiempo de amplificación se puede reducir en gran medida ejecutando la solución de PCR en un microcanal colocado en calentadores configurados a diferentes temperaturas.

Como la CE tiene muchas ventajas, como alta resolución, alta velocidad y excelente reproducibilidad, se convirtió en una herramienta popular en el laboratorio para el análisis de ácidos nucleicos y proteínas. Sin embargo, la mayoría de los laboratorios, especialmente los laboratorios del mundo en desarrollo, no pueden permitirse esta tecnología debido al alto precio del instrumento CE. Aquí, hemos esbozado protocolos sobre cómo fabricar el chip microfluídico CF-PCR y cómo construir un sistema CE versátil en el laboratorio.

También demostramos el proceso de amplificación de Escherichia coli por el sistema CF-PCR, y la detección de los productos de PCR por el sistema CE. Siguiendo los procedimientos descritos en este protocolo, los usuarios deberían ser capaces de fabricar chips microfluídicos, preparar una solución de PCR, construir un sistema de CF-PCR para la amplificación de ácidos nucleicos y configurar un sistema CE simple, incluso con recursos limitados, para separar fragmentos de ADN. Calienta la oblea de silicona a 200 grados centígrados durante 25 minutos para eliminar la humedad.

Dispense un mililitro de fotorresistencia SU-8 2075 por pulgada de oblea. Gírelo en la oblea de silicio con un recubridor giratorio a 500 rpm durante 5 a 10 segundos con una aceleración de 100 rpm por segundo, y luego a 2, 000 rpm durante 30 segundos con una aceleración de 500 rpm por segundo. Hornee suavemente a 65 grados centígrados durante tres minutos y a 95 grados centígrados durante 15 minutos.

Establezca de 150 a 215 milijulios por centímetro cuadrado como energía de exposición para la máquina de fotolitografía y grabe el patrón diseñado en la fotorresistencia con una máscara de fotolitografía. Coloque la oblea de silicona y la máscara listas para la exposición. Después de la exposición, hornee la oblea a 65 grados centígrados durante dos minutos y a 95 grados centígrados durante siete minutos.

Sumerja la oblea de silicio en la solución reveladora para eliminar el exceso de fotorresistencia y sáquela cuando se puedan ver los microcanales. A continuación, utilice isopropanol para enjuagar la solución reveladora residual. Mezcle el prepolímero de polidimetilsiloxano y el agente de curado en una proporción de 10 a 1.

Vierta la solución mezclada de PDMS en el molde de réplica y solidifique a 80 grados centígrados durante 60 minutos. Adhiera el chip microfluídico PDMS en un portaobjetos después de la activación con un limpiador de plasma y solidícelos a 80 grados centígrados durante 30 minutos lo antes posible. Utilice un mezclador de vórtice y una centrífuga para asegurarse de que los reactivos estén bien mezclados.

Prepara un tubo de centrífuga. Primero agregue agua al tubo de la centrífuga. A continuación, agregue la plantilla de ADN, el cebador, el tampón, la mezcla de dNTP, Tween 20, PVP y, finalmente, agregue la ADN polimerasa.

Finalmente, mezcle la solución por vórtice. Prepare dos calentadores cerámicos PTC, dos relés de estado sólido, dos controladores de temperatura, dos sensores de temperatura y un cable de alimentación. Conecte el calentador al relé de estado sólido.

Conecte el relé de estado sólido al controlador de temperatura PID. Luego conecte la sonda del sensor de temperatura a la parte inferior de los dos calentadores y conecte el terminal al controlador de temperatura PID. Finalmente, conecte dos relés de estado sólido en serie y conecte el cable de alimentación.

Imprime en 3D una ranura para los dos calentadores y mantén los calentadores en el mismo plano. Coloque el chip microfluídico en los dos calentadores. Prepare una bomba de jeringa y una jeringa, luego fije la jeringa en la bomba de jeringa.

Conecte un tubo de silicona con una jeringa y conecte una aguja de acero a la parte superior del tubo de silicona. Inserte la aguja de acero en la entrada del chip microfluídico. Coloque una punta de pipeta en la salida del chip para recoger los productos de PCR.

Utilice una fuente de alimentación de alto voltaje para generar un campo eléctrico de campo pulsado. Mira, esta es una fuente de alimentación de alto voltaje. Estos son electrodos positivos y negativos.

Utilice una lámpara de mercurio como fuente de luz y filtre la longitud de onda de excitación de la lámpara de mercurio a través de un filtro. Coloque el capilar en la platina del microscopio. Recoja la emisión de fluorescencia con el objetivo y luego decúbrala mediante un tubo fotomultiplicador.

Este es nuestro microscopio y este es nuestro capilar. Ahora encendemos la luz en condiciones de habitación oscura. La luz de excitación es recogida por el objetivo.

Utilice el software LABVIEW de desarrollo propio para controlar la fuente de alimentación y completar la adquisición de datos. Preajuste la temperatura de los calentadores del sistema CF-PCR a 65 grados centígrados y 95 grados centígrados. Coloque el chip microfluídico en los dos bloques calefactores.

Inserte la punta del tubo de silicona en un tubo de centrífuga que contenga 50 microlitros de la solución de PCR. Tire del émbolo de la jeringa para extraer lentamente la solución. Fije la jeringa en una bomba de jeringa.

Inserte la aguja de acero en la entrada del chip microfluídico. Ajuste el caudal de la bomba a 10 microlitros por minuto y presione el botón de inicio para empujar la solución en el microcanal en la entrada del microchip. Recoja los productos de PCR en la salida del chip microfluídico.

Preparar un capilar con 8 centímetros de longitud total y 6 centímetros de longitud efectiva. Prepare el tampón de separación mezclando 100 microlitros de 1 % HEC, dos microlitros de 100 x SYBR Green y 98 microlitros de agua ultrapura para obtener un 0,5 % de HEC que contenga 1 x SYBR Green. Llene el capilar con el tampón de separación preparado con una bomba de vacío.

Ingrese el voltaje de inyección y el tiempo de inyección en la interfaz del software, haga clic en el botón de inicio y espere a que los productos de PCR se introduzcan electrodinámicamente en el capilar. Ingrese el voltaje de CC en la interfaz del software, haga clic en el botón de inicio y ejecute la electroforesis a 100 voltios por centímetro de intensidad de campo eléctrico. Haga clic en el botón de parada después de que todos los fragmentos de ADN se separen en el capilar.

Enjuague el capilar con agua esterilizada durante un minuto después de cada ejecución. Esta imagen representa el electroferograma de los productos de PCR y los marcadores de ADN. Primero amplificamos el gen diana de Escherichia coli en el sistema de CF-PCR, y la solución de PCR tardó unos 10 minutos y 30 segundos desde la entrada hasta la salida del chip.

El tamaño del amplicón diana de Escherichia coli fue de 544 pb. Posteriormente, se analizaron los productos de PCR amplificados en el sistema de electroforesis capilar. Además, también realizamos la electroforesis capilar de una escalera de ADN de 100 pb en las mismas condiciones experimentales.

El tamaño del producto de PCR se puede evaluar de acuerdo con el electroferograma de la escalera de ADN. Cada experimento se realizó tres veces para comprobar su reproducibilidad. Los datos de esta imagen muestran que el pico correspondiente a los productos de PCR de Escherichia coli se observó después de la separación, y el tiempo de migración de los productos de PCR en el chip microfluídico fue consistente con el de un termociclador.

Tanto la PCR como la CE son dos biotecnologías populares en el análisis de ácidos nucleicos. En este trabajo se describe la amplificación de Escherichia coli y la detección de los productos de PCR utilizando los sistemas CF-PCR y CE, ambos de fabricación propia. El gen diana de Escherichia coli se amplificó con éxito en 10 minutos, y los fragmentos de ADN menores de 1.500 pb se separaron en ocho minutos.

Además, el sistema CF-PCR basado en el chip microfluídico y el sistema CE introducidos en este trabajo son fáciles de fabricar y pueden ofrecer una forma sencilla para el análisis de ácidos nucleicos en el laboratorio. Puede amplificar y detectar solo una muestra a la vez, lo que limita su amplia aplicación. Por lo tanto, el desarrollo de una matriz integrada de chips microfluídicos CF-PCR y CE para la detección de patógenos de alto rendimiento aún está en camino.