Name: Aislamiento de células linfoides innatas del grupo 2 de la mucosa nasal del ratón para detectar la expresión de CD226 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprende a aislar células linfoides innatas del grupo 2 de la mucosa nasal de ratón para detectar la expresión de CD226 mediante citometría de flujo. Este protocolo permite estudiar su papel en enfermedades nasales.

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R.Z. fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 81871258) y fondos proporcionados por la Cuarta Universidad Médica Militar (No.2020rcfczr). Y.Z. fue apoyado por el Programa de Investigación Básica de Ciencias Naturales de Shaanxi (No. 2021JM-081).

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las Pautas de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Todos los procedimientos y protocolos fueron aprobados por el Comité de Ética en Investigación Científica de la Cuarta Universidad Médica Militar (Nº 20211008).
1. Establecimiento del modelo Murine AR
<ol><li>Alojar ratones machos y hembras C57BL / 6 de tipo salvaje (WT) de 8 a 12 semanas en condiciones específicas libres de patógenos y proporcionar comida y agua estándar de laboratorio.</li>
	<li>Emulsionar 50 μg de ovoalbúmina (OVA) en 0,2 ml de PBS estéril que contiene 2 mg de hidróxido de aluminio en un banco limpio para mantener la esterilidad. En los días 0, 7 y 14, inyecte intraperitonealmente ratones hembra o macho con 50 μg cada uno de OVA emulsionada.</li>
	<li>En los días 21, 22, 23, 24 y 25, instilar intranasalmente ratones con 50 μg de OVA disuelto en 30 μL de PBS estéril (15 μL por fosa nasal) bajo anestesia por inhalación (2-3% de isoflurano con una tasa de flujo de oxígeno o 0,5 L / min).</li>
	<li>Eutanasia a los ratones 24 h después del último desafío (día 26).</li>
</ol>2. Aislamiento de células mononucleares (EMN) de la mucosa nasal
<ol><li>Eutanasia a los ratones por luxación cervical bajo anestesia profunda. Remoje la cabeza de los ratones en etanol al 75% durante 5 minutos y evite que el etanol entre en la fosa nasal externa. Coloque el abdomen hacia abajo en la mesa de operaciones.</li>
	<li>Cortar los dientes anteriores. En la línea media de la cabeza, haga una incisión y abra la piel con tijeras.</li>
	<li>Retire la mandíbula inferior, corte toda la nariz a lo largo del extremo del paladar y coloque el tejido en una placa de Petri de 60 mm que contenga 5 ml de PBS helado. Usando tijeras y fórceps, retire la carne y los músculos adheridos a los huesos.</li>
	<li>Transfiera la nariz del ratón a una nueva placa de Petri de 60 mm que contenga 5 ml de PBS helado. Lave los huesos dos veces con 5 ml de PBS helado.</li>
	<li>Transfiera la nariz a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.</li>
	<li>Aplastar y transferir suficientemente la nariz a un tubo de 15 ml que contenga 2 ml de tampón digestivo precalentado (RPMI 1640 medio suplementado con 1 mg/ml de colagenasa IV y 10 U/ml DNasa I).</li>
	<li>Sujetar la tapa y colocar el tubo verticalmente en un agitador orbital a 37 °C, con agitación continua a 120-150 rpm durante 40 min. NOTA: Precaliente el tampón de digestión a 37 °C para lograr la mayor actividad enzimática.</li>
	<li>Agregue 5 ml de medio RPMI 1640 helado que contenga 10% de suero bovino fetal (FBS) para detener el proceso de digestión.</li>
	<li>Filtrar a través de un filtro celular de 70 μm para eliminar fragmentos sólidos.</li>
	<li>Centrifugar a 500 x g durante 5 min, y luego desechar suavemente el sobrenadante.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet en medio RPMI 1640 helado y centrifugar a 500 x g durante 5 min. Deseche suavemente el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender el pellet celular en 4 ml de medio de gradiente de densidad al 40% (160 μL de 10x PBS + 1,44 ml de solución madre de medios de gradiente de densidad + 2,4 ml de medio RPMI 1640).</li>
	<li>Inserte suavemente una pipeta Pasteur en el fondo del tubo y añada lentamente 2,5 ml de medio de gradiente de densidad al 80% (200 μL de 10x PBS + 1,8 ml de solución madre de medios de gradiente de densidad + 0,5 ml de medio RPMI 1640).</li>
	<li>Ajuste la velocidad de aceleración y desaceleración de la centrífuga por debajo de la tercera marcha y la centrífuga a 400 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Retire la capa superior de impurezas antes de drenar las células en la interfaz para evitar una posible contaminación. Drene cuidadosamente la capa de células mononucleares (MNC) en la interfaz de medios de gradiente de densidad 40%/80% en un tubo de 15 ml que contenga 2 ml de PBS helado usando una pipeta. Lave las celdas con PBS helado dos veces.</li>
</ol>3. Tinción superficial para análisis FCM
<ol><li>Cosechar las células y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Resuspender el pellet celular en tampón de tinción (PBS suplementado con 2% FBS y 0,1% NaN3) y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante. PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al preparar el tampón de tinción. NaN3 es muy tóxico y puede causar daño a los órganos si se ingiere, inhala o entra en contacto con la piel. Además, evite la liberación al medio ambiente.</li>
	<li>Resuspender las células en solución bloqueante de 80 μL (anticuerpo anti-CD16/32 [1:100] diluido en tampón de tinción) por tubo. Incubar durante 30 min en la oscuridad a 4 °C.</li>
	<li>Sin lavar, añadir 20 μL de la dilución adecuada del cóctel de anticuerpos para la tinción superficial (Tabla 1).</li>
	<li>Agregue 1 μL (por prueba) de colorante de viabilidad reparable 520 (FVD) justo antes de agregar el cóctel de anticuerpos a las muestras. Incubar en la oscuridad a 4 °C durante 30 min. Establecer anticuerpos de isotipo coincidentes y fluorescencia menos uno (FMO) como controles negativos.</li>
	<li>Lavar las células en 500 μL de tampón de tinción centrifugando a 500 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Resuspender el pellet celular en 200 μL de tampón de tinción. Agregue 50 μL de cuentas de conteo absoluto de vórtice a las celdas teñidas y agite. Somételos a un análisis de citometría de flujo (FCM). NOTA: Los datos de FCM se obtuvieron utilizando un analizador de células espectrales y se analizaron con software de análisis de citometría de flujo (FCM).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las ILC2 están estrechamente asociadas con la inflamación tipo 2 y los trastornos inflamatorios, como lo demuestra un número creciente de estudios. Tanto los modelos de ratón como la observación humana contribuyen a una mejor comprensión de su función en las vías respiratorias superiores. En la fisiopatología del asma, las ILC2 se activan a través de la linfopoyetina del estroma tímico, IL-25 e IL-33, que son producidas principalmente por células epiteliales. Luego, reflejando las células Th2, las ILC2 producen IL-4, IL-...

Las células linfoides innatas del grupo 2 (ILC2) se descubrieron por primera vez en los tejidos de la cavidad peritoneal de ratones y posteriormente se demostró que estaban presentes en la sangre y otros tejidos periféricos como los pulmones, la piel y la cavidad nasal 1,2,3. Como células residentes en tejidos, las ILC2 se mantienen y proliferan principalmente localmente y funcionan como los primeros protectores que responden a estímulos dañinos exógenos mediante la producción de numerosas citoquinas tipo 2 e induciendo inmunidad tipo 2 4,5,6. Las ILC2 también pueden ejercer sus efectos traficando hacia los tejidos infectados 7,8.
Al igual que las células T-helper 2 (Th2), las complicadas redes reguladoras de ILC2 aseguran su participación significativa en la progresión de diversas enfermedades inflamatorias tipo 2, incluidas las enfermedades alérgicas de las vías respiratorias 8,9. En el asma, las alarminas derivadas de células epiteliales pueden activar ILC2, que promueven aún más la inflamación pulmonar a través de la secreción de interleucina (IL)-4, IL-5 e IL-1310. Los estudios clínicos también han indicado que los niveles de ILC2 fueron significativamente elevados en el esputo y la sangre de pacientes con asma grave, lo que sugiere una asociación de ILC2 con la gravedad del asma y su función como predictor de la progresión del asma11.
La rinitis alérgica (RA) es una enfermedad inflamatoria crónica común que afecta a millones de personas anualmente, y los tratamientos efectivos para esta enfermedad son limitados12,13. Las ILC2 juegan un papel crucial en la fisiopatología de la RA, ya sea en la fase de sensibilización o en la fase de generación de síntomas e inflamación14. En pacientes con AR, los niveles de ILC2 en la sangre periférica han sido reportados elevados tanto local como sistémicamente15. Sin embargo, ciertos efectos y los mecanismos subyacentes de ILC2 sobre la fisiopatología y la progresión de AR aún requieren una exploración adicional.
CD226 - una glicoproteína transmembrana que sirve como molécula coestimuladora - se expresa principalmente en células asesinas naturales (NK), células T y otros monocitos inflamatorios16,17. La interacción de CD226 y sus ligandos (CD155 y/o CD112) o competidor (TIGIT) le permite participar en las funciones biológicas de varias células inmunes18. La unión de los ligandos en las células presentadoras de antígeno a CD226 en el linfocito citotóxico (CTL) promueve la activación de ambas células simultáneamente, mientras que la activación de CTL puede ser suprimida aún más por TIGIT (inmunorreceptor de células T con dominios Ig e ITIM), el competidor de CD226 19,20. Un estudio ex vivo en humanos reveló que CD226 y CD155 en células T regulan el equilibrio entre Th1 / Th17 y Th2 a través de la modulación diferencial de los subconjuntosTh 21. El CD226 también puede mediar la adhesión plaquetaria y la actividad de destrucción tumoral NK22,23. Mientras tanto, CD226 está bien estudiado en la patogénesis de diversas enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunes y tumores 18,24,25. En la actualidad, CD226 se ha convertido en un nuevo punto brillante para la inmunoterapia. Los estudios han encontrado que las vesículas extracelulares pueden revertir la expresión de CD226 en las células NK para restablecer su actividad citotóxica e intervenir en la progresión del cáncer de pulmón26. Un estudio reciente ha revelado un subgrupo de ILC del grupo intestinal fetal 3 caracterizado con una alta expresión de CD226 por secuenciación de ARN unicelular27, lo que indica que CD226 podría ejercer funciones en la inmunidad mediada por células linfoides innatas.
Nuestro conocimiento sobre las ILC2 en la inflamación de las vías respiratorias se basa principalmente en estudios sobre el asma; Sin embargo, se sabe poco sobre sus funciones en la inmunidad de la mucosa nasal. Por lo tanto, se estableció un protocolo para aislar e identificar ILC2s de la mucosa nasal. El estudio se centra en la expresión de CD226 en ILC2s en tejidos nasales y su variación entre ratones sanos y AR. Esto puede proporcionar nuevos conocimientos sobre los mecanismos subyacentes de la regulación mediada por ILC2 en la inmunidad local y servir como base para desarrollar nuevos enfoques para el tratamiento de AR.

<table><tbody><tr><td>Hidróxido de aluminio</td><td>Meilun tecnología biológica</td><td>21645-51-2</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>eBioscience</td><td>11-0112-82</td><td>Utilizado en el cóctel de anticuerpos</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>BioLegend</td><td>117306</td><td>Utilizado en el cóctel de anticuerpos</td></tr><tr><td>CD16/32</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>Clon: 93; Dilución 1:100</td></tr><tr><td>CD226</td><td>BioLegend</td><td>128812</td><td>Utilizado en el cóctel de anticuerpos</td></tr><tr><td>CD3e</td><td>BioLegend</td><td>100306</td><td>Utilizado en el cóctel de anticuerpos</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BioLegend</td><td>103128</td><td>Utilizado en el cóctel de anticuerpos</td></tr><tr><td>CD45R</td><td>eBioscience</td><td>11-0452-82</td><td>Utilizado en el cóctel de anticuerpos</td></tr><tr><td>CD90.2</td><td>BD Pharmingen</td><td>553014</td><td>Utilizado en anticuerpo coctail</td></tr><tr><td>Colagenasa IV</td><td>DIYIBio</td><td>DY40128</td><td></td></tr><tr><td>CountBright cuentas de conteo absolutas</td><td>Invitrogen</td><td>C36950</td><td>cuentas de conteo absolutas</td></tr><tr><td>Dnase <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/63525/63525eq01v2.jpg" style="margin: auto; "></td><td>Beyotime</td><td>D7076</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Tinte de viabilidad fijable eFluor 520 (FITC)</td><td>eBioscience</td><td>65-0867-14</td><td>FVD</td></tr><tr><td>HBSS, calcio, magnesio</td><td>Servicebio</td><td>G4204-500</td><td></td></tr><tr><td>KLRG1</td><td>eBioscience</td><td>17-5893-81</td><td>Utilizado en el cóctel de anticuerpos</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>SIGMA</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Software NovoExpress</td><td>AgilentTechnologies</td><td>versión 1.5.0</td><td>software de análisis de citometría de flujo (FCM)</td></tr><tr><td>OVA</td><td>SIGMA</td><td>9006-59-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Servicebio</td><td>G4202-500</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 10x</td><td>Servicebio</td><td>G4207-500</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Yeasen</td><td>40501ES60</td><td>densidad medios de gradiente</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medios de cultivo</td><td>Corning</td><td>10-040-CVRV</td><td></td></tr><tr><td>Analizador de células espectrales</td><td>SONY</td><td>SA3800</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de células linfoides innatas del grupo 2 de la mucosa nasal del ratón para detectar la expresión de cd226

Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226

Con abundantes investigaciones sobre células linfoides innatas del grupo 2 (ILC2) publicadas a lo largo de los años, se sabe ampliamente que las ILC2 están implicadas en la regulación de diversos procesos patológicos, incluida la inmunidad antihelmintos, la reparación de tejidos, la termogénesis y las enfermedades autoinmunes como el asma y la rinitis alérgica (AR). Las ILC2 residen permanentemente en tejidos periféricos como la piel, el intestino, los pulmones y la cavidad nasal; Sin embargo, hay información limitada sobre sus funciones exactas en la inmunidad de la mucosa nasal. CD226 es una molécula coestimuladora activadora, expresada principalmente en células asesinas naturales (NK), células T y monocitos inflamatorios. Sin embargo, sigue sin conocerse si las ILC2 expresan CD226 o desempeñan un papel en la patogénesis de las enfermedades relacionadas con ILC2. Aquí, establecimos un método para aislar e identificar ILC2s de la mucosa nasal y detectamos la expresión de CD226 en ILC2s obtenidas de ratones sanos y AR. Aquí, describimos este protocolo para el aislamiento e identificación de ILC2 de la mucosa nasal del ratón, que ayudará a explorar el mecanismo patológico interno de los trastornos inmunológicos en las enfermedades de la mucosa nasal.

Se desarrolló un modelo murino inducido por OVA para explorar el papel de ILC2s en AR. La construcción del modelo murino AR se basó en estudios previos con ligeras modificaciones 28,29,30,31. Se capturó un video de 10 minutos para medir la frecuencia de los estornudos y el rascado nasal después del último desafío nasal. Los síntomas alérgicos de los ratones AR inducidos por OVA se presentaron e...

Las células linfoides innatas del grupo 2 (ILC2), implicadas en la inflamación tipo 2, participan principalmente en la respuesta a la infección por helmintos, enfermedades alérgicas, homeostasis metabólica y reparación de tejidos. En este estudio, se demuestra un procedimiento para aislar ILC2s de la mucosa nasal murina y detectar la expresión de CD226.

Aislamiento de células linfoides innatas del grupo 2 de la mucosa nasal del ratón para detectar la expresión de CD226

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various ...

Este protocolo se establece para aislar e identificar las células linfoides innatas del grupo dos de la mucosa nasal murina y explorar ciertos efectos y mecanismos subyacentes de la ILC dos en enfermedades nasales. Esta técnica permite a los investigadores aislar ILC dos del mesotelial local y exponer la expresión del antígeno de superficie mediante citometría de flujo. Nuestra técnica no incluye operaciones complicadas.Sin embargo, una cosa importante es tratar de eliminar la carne que se adhiere a los pequeños huesos por completo para evitar el impacto de otros tejidos cercanos. Antes de comenzar el experimento, aloje ratones machos y hembras machos y hembras de tipo C57 negro salvaje de 8 a 12 semanas en condiciones específicas libres de patógenos provistas de comida de laboratorio estándar y agua. Para establecer el modelo de rinitis alérgica, emulsionar 50 microgramos de ovoalbúmina en 0,2 mililitros de PBS estéril que contiene dos miligramos de hidróxido de aluminio e inyectar intraperitonealmente 50 microgramos de ovoalbúmina emulsionada en cada ratón en cero, siete y 14 días. En los días 21, 22, 23, 24 y 25, instilar intranasalmente ratones con 50 microgramos de ovoalbúmina disuelta en 30 microlitros de PBS estéril, seguido de la eutanasia de los ratones 24 horas después del último desafío.Remoje la cabeza del ratón sacrificado en etanol al 75% durante cinco minutos y evite que el etanol entre en la fosa nasal externa. Coloque el abdomen hacia abajo en la mesa de operaciones. Corte los cuatro dientes y en la línea media de la cabeza haga una incisión y abra la piel con tijeras.Luego, retire la mandíbula inferior, corte toda la nariz a lo largo del extremo del paladar y coloque el tejido en una placa de Petri de 60 milímetros que contenga cinco litros de PBS helado. Usando tijeras y fórceps, retire la carne y los músculos adheridos a los huesos. A continuación, transfiera la nariz del ratón a una nueva placa de Petri de 60 milímetros que contenga cinco mililitros de PBS helado y lave los huesos.Después del segundo lavado, transfiera la nariz a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Aplaste suficientemente el tejido y transfiéralo a un tubo de 15 mililitros que contenga dos mililitros de tampón de digestión precalentado. Cierre la tapa y coloque el tubo verticalmente en un agitador orbital a 37 grados centígrados y de 120 a 150 RPM durante 40 minutos.A continuación, agregue cinco mililitros de RPMI 1640 medio helado que contenga 10% de suero bovino fetal para detener la digestión. Luego filtre el contenido a través de un filtro de células de 70 micras para eliminar fragmentos sólidos. Después de centrifugar el filtrado a 500 G durante cinco minutos, deseche suavemente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en medio RPMI 1640 helado.Para repetir la centrifugación como se demostró anteriormente, resuspenda el pellet celular en cuatro mililitros de medio de gradiente de densidad del 40%. A continuación, inserte suavemente una pipeta Pasteur en el fondo del tubo para agregar 2,5 mililitros de medio de gradiente de densidad del 80%. Centrifugar el tubo a 400 G durante 15 minutos a temperatura ambiente con la velocidad de aceleración y desaceleración ajustada por debajo de la tercera marcha.Antes de drenar las células en la interfaz, retire la capa superior de impurezas para evitar una posible contaminación. Luego use una pipeta para drenar la capa de células mononucleares en la interfaz de medios de gradiente de 40% por 80% de densidad en un tubo de 15 mililitros que contenga dos mililitros de hielo frío. Lave las celdas con PBS helado dos veces.Cosechar las células y centrifugarlas durante cinco minutos a 500 g a cuatro grados centígrados. Vuelva a suspender el pellet celular en tampón de tinción y centrifugar de nuevo durante cinco minutos a 500 G.Deseche el sobrenadante. Resuspender e incubar las células en solución de bloqueo de 80 microlitros durante 30 minutos a cuatro grados centígrados en condiciones oscuras.Agregue un microlitro de colorante de viabilidad reparable 520 justo antes de agregar 20 microlitros del cóctel de anticuerpos de tinción superficial de la dilución adecuada a la muestra. Además, establezca los anticuerpos de isotipo coincidentes y la fluorescencia menos uno como controles negativos. A continuación, lave las células en 500 microlitros de tampón de tinción centrifugando a 500 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Luego resuspender el pellet celular en 200 microlitros de tampón de tinción. Finalmente, agregue 50 microlitros de perlas de conteo absoluto de vórtice a las células teñidas. Agitar y someterlos a un análisis de citometría de flujo.Un modelo murino inducido por óvulos desarrollado para explorar el papel de las células linfoides innatas del grupo dos mostró que la frecuencia de frotamiento nasal y estornudos en los ratones con rinitis alérgica fue significativamente mayor que en el grupo de control. En la mucosa nasal de ratones control sanos, se identificaron alrededor del 2 al 3% de las células de linaje negativo y CD 45 positivas. El número absoluto de células linfoides innatas del grupo dos varió de 2.000 a 4.000.El análisis de citometría de flujo indicó un aumento notable en el número total de células linfoides innatas del grupo dos en la mucosa nasal de rinitis alérgica en comparación con el de ratones control sanos. Se detectó una mayor expresión de CD 226 en las células linfoides innatas del grupo dos en los ratones con rinitis alérgica que en los ratones control. Además, la intensidad media de fluorescencia de CD 226 se reguló significativamente al alza en los ratones AR.Tenga en cuenta los pasos para eliminar la carne adherida al hueso nasal, establecer la velocidad de aceleración y desaceleración al centrifugar el medio y drenar las células mononucleares. Las ILC dos identificadas pueden ser un soporte para la caracterización de citometría de flujo ordenada para cultivo celular o estimulada in vitro, lo que ayudaría a explorar el riesgo específico de ILC dos en el tejido nasal. Este procedimiento de aislamiento y caracterización de linfocitos, particularmente en células linfáticas innatas en la mucosa nasal, hace de este protocolo una referencia preliminar para los investigadores que exploran el entorno inmune nasal local.

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Investigación

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