Name: Microscopía de fuerza atómica para estudiar las propiedades físicas de las células epidérmicas de raíces vivas de Arabidopsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Aprende a usar la microscopía de fuerza atómica para analizar propiedades físicas de paredes celulares en Arabidopsis. Este método no invasivo permite cuantificar cambios in vivo con alta resolución subcelular.

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Esta investigación ha sido financiada por el CSIC I+D 2018, beca nº 95 (Mariana Sotelo Silveira); CSIC Grupos (Omar Borsani) y PEDECIBA.

1. Preparación del material vegetal y condiciones de crecimiento
<ol><li>Para generar el material vegetal necesario, esterilice las semillas de tipo salvaje Arabidopsis y líneas mutantes de interés. NOTA: En este protocolo, utilizamos lo siguiente: ttl1: líneas de inserción de ADN-T Salk_063943 (para TTL1; AT1G53300) - Columbia-0 (Col-0) tipo salvaje; el mutante Procuste1 (prc1-1), que consiste en una mutación knock-out (Q720stop) en el gen CESA6 (AT5G64740), como se describió previamente en10,11; y TTL1 x PRC1-1 doble mutante.<ol><li>Poner un volumen aproximado de 50 μL de semillas en un microtubo. Añadir 500 μL de etanol al 70% + solución de Tween al 0,01% a temperatura ambiente. Mezclar e incubar durante 7 min.</li>
		<li>Vierta la solución de etanol y agregue 500 μL de hipoclorito de sodio al 20%. Mezclar e incubar durante 7 min.</li>
		<li>Vierta la solución de hipoclorito de sodio y lave las semillas de tres a cuatro veces con agua estéril.</li>
	</ol></li>
	<li>Enchapado<ol><li>Preparar de antemano el medio basal Murashige y Skoog (MS)12 + 1,5% sacarosa + 1% agar (pH 5,7) (ver Tabla de materiales). Autoclave el medio. Prepare una campana de flujo laminar para trabajar en un ambiente estéril y etiquete las placas de Petri cuadradas necesarias para el experimento. Vierta el medio en las placas de Petri y permita que el medio se solidifique.</li>
		<li>Emplatar las semillas esterilizadas con puntas de pipeta estériles sobre placas de Petri cuadradas que contengan el medio. Distribuye las semillas uniformemente en dos filas. Cuando las semillas estén secas, cierre las tapas y selle los platos. Estratificar las semillas a 4 °C en la oscuridad durante 4 días. NOTA: La estratificación es necesaria para sincronizar la germinación.</li>
		<li>Colocar las placas verticalmente en la cámara de crecimiento en régimen de día largo (16 h de luz/8 h de oscuridad) con 25 μmol m2 s−1 de intensidad de luz y 23 °C (día/noche). Cultiva las plántulas durante 7 días.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Tratamiento del estrés osmótico (opcional)
NOTA: Esta sección proporciona detalles sobre el crecimiento de las raíces de Arabidopsis en el potencial osmótico de -1.2 MPa según lo estimado por el osmómetro crioscópico (Tabla de materiales). Esta parte puede ser omitida o cambiada dependiendo de la pregunta experimental en cuestión.
<ol><li>Preparar MS basal medio + 1,5% sacarosa + 400 mM manitol + 1% agar (pH 5,7). Autoclave el medio. Vierta el medio en placas de Petri cuadradas en la campana de flujo laminar y permita que el medio se solidifique.</li>
	<li>Con pinzas (Tabla de materiales), coloque las plántulas de 5 días de edad precultivadas en MS basal + 1.5% de medio de sacarosa en placas de Petri cuadradas que contengan el medio complementado con manitol de 400 mM. Colocar las placas verticalmente en la cámara de crecimiento en las mismas condiciones que en el paso 1.2.3. Cultive las plántulas bajo esta condición de estrés osmótico durante 7 días. NOTA: Para evaluar la adaptación al crecimiento radicular de la raíz primaria durante el estrés osmótico severo, se sugiere utilizar plántulas 5 días después de la germinación cultivadas en condiciones controladas para asegurar que el tamaño del meristemo de la raíz ya esté establecido13. Alternativamente, el análisis se puede realizar en cada etapa del desarrollo para determinar el efecto en el desarrollo de la acción del estrés osmótico.</li>
</ol>3. Experimentos de nanoindentación de microscopía de fuerza atómica (AFM)
<ol><li>Preparación de la muestra para experimentos de nanoindentación NOTA: Este es un paso crucial para aplicar AFM al estudio de muestras biológicas vivas. La muestra debe estar firmemente unida al sustrato para que sea mecánicamente estable durante las mediciones de indentación. Al mismo tiempo, deben preservarse las cualidades estructurales de la muestra. Una estrategia efectiva para estabilizar una muestra grande para AFM es usar adhesivos. El adhesivo debe secarse rápidamente y no debe ser tóxico ni reactivo con el medio circundante. En este protocolo, se utilizaron placas de Petri de poliestireno como sustrato y se utilizó pegamento de silicona no ácida (Tabla de materiales) para unir las plántulas de Arabidopsis.<ol><li>Extienda una capa delgada de pegamento de silicona en la placa de Petri con un cubreobjetos. Dejar el pegamento en el aire durante 45 s.</li>
		<li>Con pinzas, coloque la plántula sobre el pegamento, orientándola en una dirección que evite el contacto entre las partes sobresalientes de la plántula y el voladizo. Luego, presione la raíz suavemente contra la capa de pegamento de silicona para unirla firmemente. Deje la plántula en contacto con el pegamento durante 45 s antes de continuar con los siguientes pasos del protocolo.</li>
		<li>Incubar las plántulas adheridas con 2 μg/ml de yoduro de propidio (PI; Tabla de materiales) durante 5 minutos en la oscuridad y lavarlos cuidadosamente tres veces con 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Tabla de materiales).</li>
		<li>Coloque las plántulas incubadas con PI en un microscopio de fluorescencia invertido junto con el AFM. Para observar la fluorescencia, establezca las longitudes de onda de excitación y emisión en 572 nm y 617 nm, respectivamente. La ausencia de fluorescencia dentro de las células epidérmicas confirma la viabilidad de las raíces.</li>
		<li>Cubra la plántula con 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS).</li>
	</ol></li>
	<li>Protocolo de sangría NOTA: Realice todas las mediciones de AFM dentro de 1 h después de la inmovilización de la muestra en su soporte a temperatura ambiente. La habitación donde se encuentra el AFM debe mantenerse a 25 °C con aire acondicionado. La solución de PBS debe estar a la misma temperatura.<ol><li>Monte un voladizo de nitruro de silicio estándar con una punta piramidal (consulte Tabla de materiales) en el soporte de la sonda AFM para fluido (Tabla de materiales).</li>
		<li>Alinee el láser en el voladizo cerca de la posición de la punta. A continuación, mueva el fotodiodo para colocar el punto láser en el centro del detector.</li>
		<li>Para calibrar la sensibilidad a la deflexión, coloque una placa de Petri de poliestireno con 1x PBS debajo del AFM. NOTA: Este paso es necesario para calcular la sangría. Cuando se realiza una medición de fuerza en una superficie dura, no hay hendidura en la superficie, por lo que cualquier cambio en el desplazamiento del escáner z corresponde a la deflexión en voladizo. Por lo tanto, es muy importante calibrar la sensibilidad a la deflexión en una superficie dura. El uso de una superficie blanda sobrestimará la sensibilidad a la deflexión, lo que dará como resultado constantes de resorte que son demasiado bajas.</li>
		<li>Ajuste el fotodetector de modo que la deflexión sin contacto esté cerca de 0 V. Calibre la sensibilidad a la deflexión realizando una hendidura (curva de fuerza), con un tamaño de rampa de 3 μm, una tasa de indentación y retracción de 0,6 μm/s y un umbral de activación de 0,5 V.</li>
		<li>Para calibrar la constante de resorte del voladizo, utilice la utilidad Thermal Tune del software AFM (Tabla de materiales) recomendada para sondas con constantes de resorte inferiores a aproximadamente 5 N/m o utilice el método descrito en la referencia14. Antes de activar Thermal Tune en el software, asegúrese de que la sonda no interactúe con la muestra.<ol><li>Introduzca la temperatura del voladizo. Haga clic en Calibrar &gt; Thermal Tune o en el icono Thermal Tune en la barra de herramientas de NanoScope . Seleccione un rango de frecuencia (1-100 Hz).</li>
			<li>Haga clic en Adquirir datos en el panel Thermal Tun. Espere a que el AFM adquiera datos y luego haga clic en el botón Oscilador armónico simple (fluido ).</li>
			<li>Ajuste el ancho del filtro mediano a 3. Ajuste el ancho de la bandeja PSD para reducir el ruido en los datos adquiridos mediante el promedio. Establezca límites de ajuste alrededor del primer pico de resonancia.</li>
			<li>Haga clic en Calcular constante de resorte k y, a continuación, haga clic en Sí en la ventana emergente que le pregunta si el usuario desea utilizar este valor.</li>
			<li>Repita los pasos descritos anteriormente tres veces y tome manualmente un promedio de los valores constantes de resorte. Introduzca este valor medio en el cuadro Constante de resorte de la lista de parámetros de rampa de la vista PicoForce . La calibración finaliza en este punto.</li>
		</ol></li>
		<li>Usando el microscopio óptico invertido con un aumento de 10x, 20x y 40x, coloque la sonda AFM en la superficie de la cuarta célula epidérmica alargada de la raíz primaria, asegurándose de colocarla en el centro de la célula.</li>
		<li>Con el valor constante de resorte calculado (paso 3.2.5.5), obtenga curvas de fuerza con un tamaño de rampa de 3 μm, un umbral de activación de 11 nN y una tasa de indentación y retracción de 0.6 μm/s en puntos seleccionados. NOTA: El trabajo anterior15,16 encontró que la baja frecuencia de indentación y retracción ayuda a minimizar la histéresis y la fuerza de arrastre.</li>
		<li>Obtenga curvas de fuerza de tres células por raíz para cada tratamiento (use tres réplicas biológicas por tratamiento). Captura al menos 150 curvas de fuerza para cada raíz.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Medir el módulo aparente de Young
<ol><li>Ajuste cada curva de fuerza al siguiente modelo para penetradores piramidales17: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63533/63533eq01.jpg" style="margin: auto;">, donde E es el módulo de Young aparente de la muestra, <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63533/63533eq02.jpg" style="margin: auto;"> es el módulo de Poisson de la muestra y α es el semiángulo al vértice. Descartar los ajustes con un coeficiente de correlación (r2) &lt; 0,99. Considere la relación de Poisson para material totalmente incompresible: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63533/63533eq02.jpg" style="margin: auto;"> = 0.5 y la geometría del penetrador dada por los fabricantes. NOTA: Utilice los primeros 100 nm desde el punto de contacto de la curva de carga para que el accesorio sea lo más sensible posible a la mecánica de la pared celular y para reducir el impacto de la presión de turgencia en los valores aparentes del módulo de Young8. El ajuste se ha realizado utilizando un programa personalizado de MATLAB (disponible a petición personal escribiendo a J. C. B) que permite establecer una profundidad de hendidura específica desde el punto de contacto de la curva de carga.</li>
	<li>Cree un histograma normalizado con los datos del módulo de Young aparente y ajústelo con una distribución gaussiana. Descarte los puntos de datos fuera del intervalo de confianza del 95% y vuelva a calcular tanto el histograma como el ajuste gaussiano. Calcular y reportar la media y la desviación estándar del módulo de Young aparente.</li>
	<li>Determinar la importancia de las comparaciones entre grupos mediante múltiples pruebas de comparación como ANOVA.</li>
</ol>

<ol><li>Anderson, C. T., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+construction%2C+perception%2C+and+remodeling+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).</li>
<li>Roeder, A. H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fifteen+compelling+open+questions+in+plant+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Fifteen compelling open questions in plant cell biology.</a> The Plant Cell. 34 (1), 72-102 (2022).</li>
<li>Zhang, B., Gao, Y., Zhang, L., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+cell+wall%3A+Biosynthesis%2C+construction%2C+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The plant cell wall: Biosynthesis, construction, and functions.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 63 (1), 251-272 (2021).</li>
<li>Hamant, O., Haswell, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+behind+the+wall%3A+Sensing+mechanical+cues+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Life behind the wall: Sensing mechanical cues in plants.</a> BMC Biology. 15 (59), 1-9 (2017).</li>
<li>Scheres, B., Benfey, P., Dolan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Root development.</a> The Arabidopsis Book. 1, 0101(2002).</li>
<li>Cuadrado-Pedetti, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+arabidopsis+tetratricopeptide+thioredoxin-like+1+gene+is+involved+in+anisotropic+root+growth+during+osmotic+stress+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">The arabidopsis tetratricopeptide thioredoxin-like 1 gene is involved in anisotropic root growth during osmotic stress adaptation.</a> Genes. 12 (2), 236(2021).</li>
<li>Milani, P., Braybrook, S. A., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shrinking+the+hammer%3A+micromechanical+approaches+to+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Shrinking the hammer: micromechanical approaches to morphogenesis.</a> Journal of Experimental Botany. 64 (15), 4651-4662 (2013).</li>
<li>Braybrook, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+elasticity+of+plant+cells+with+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring the elasticity of plant cells with atomic force microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 125, 237-254 (2015).</li>
<li>Bidhendi, A. J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+quantify+primary+plant+cell+wall+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Methods to quantify primary plant cell wall mechanics.</a> Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).</li>
<li>Desnos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procuste1+mutants+identify+two+distinct+genetic+pathways+controlling+hypocotyl+cell+elongation%2C+respectively+in+dark-+and+light-grown+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Procuste1 mutants identify two distinct genetic pathways controlling hypocotyl cell elongation, respectively in dark- and light-grown Arabidopsis seedlings.</a> Development. 122 (2), 683-693 (1996).</li>
<li>Fagard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procuste1+encodes+a+cellulose+synthase+required+for+normal+cell+elongation+specifically+in+roots+and+dark-grown+hypocotyls+of+arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Procuste1 encodes a cellulose synthase required for normal cell elongation specifically in roots and dark-grown hypocotyls of arabidopsis.</a> The Plant Cell. 12 (12), 2409-2423 (2000).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio+assays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).</li>
<li>Perilli, S., Sabatini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+root+meristem+size+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of root meristem size development.</a> Methods in Molecular Biology. 655, Clifton, N.J. 177-187 (2010).</li>
<li>Sader, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+virtual+instrument+to+standardise+the+calibration+of+atomic+force+microscope+cantilevers%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">A virtual instrument to standardise the calibration of atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 87 (9), 093711(2016).</li>
<li>Collinsworth, A. M., Zhang, S., Kraus, W. E., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apparent+elastic+modulus+and+hysteresis+of+skeletal+muscle+cells+throughout+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Apparent elastic modulus and hysteresis of skeletal muscle cells throughout differentiation.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1219-1227 (2002).</li>
<li>Mathur, A. B., Collinsworth, A. M., Reichert, W. M., Kraus, W. E., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial%2C+cardiac+muscle+and+skeletal+muscle+exhibit+different+viscous+and+elastic+properties+as+determined+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Endothelial, cardiac muscle and skeletal muscle exhibit different viscous and elastic properties as determined by atomic force microscopy.</a> Journal of Biomechanics. 34 (12), 1545-1553 (2001).</li>
<li>Sirghi, L., Ponti, J., Broggi, F., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+elasticity+and+adhesion+of+live+cells+by+atomic+force+microscopy+indentation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Probing elasticity and adhesion of live cells by atomic force microscopy indentation.</a> European Biophysics Journal. 37 (6), 935-945 (2008).</li>
<li>Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM-based+mapping+of+the+elastic+properties+of+cell+walls%3A+At+tissue%2C+cellular%2C+and+subcellular+resolutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: At tissue, cellular, and subcellular resolutions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51317(2014).</li>
<li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).</li>
<li>Fernandes, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+epidermal+cells+of+whole+living+roots+of+Arabidopsis+thaliana%3A+An+atomic+force+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of epidermal cells of whole living roots of Arabidopsis thaliana: An atomic force microscopy study.</a> Physical Review E. 85 (2), 21916(2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses. El script de MATLAB utilizado para ajustar los datos está disponible a petición personal escribiendo a J. C. B.

La mecánica celular y de pared celular se está volviendo cada vez más relevante para obtener información sobre cómo la mecánica afecta los procesos de crecimiento. A medida que las fuerzas físicas se propagan a distancias considerables en los tejidos sólidos, el estudio de los cambios en las propiedades físicas de la pared celular y cómo se detectan, controlan, sintonizan e impactan el crecimiento de la planta se están convirtiendo en un importante campo de estudio 2,3...

Las células vegetales están rodeadas por una pared celular que es una estructura compleja compuesta de redes interactivas de polisacáridos, proteínas, metabolitos y agua que varía en grosor de 0,1 a varios μm dependiendo del tipo de célula y la fase de crecimiento 1,2. Las propiedades mecánicas de la pared celular juegan un papel esencial en el crecimiento de las plantas. Los bajos valores de rigidez de la pared celular se han propuesto como una condición previa para el crecimiento celular y la expansión de la pared celular, y cada vez hay más pruebas de que todas las células detectan fuerzas mecánicas para realizar sus funciones. Sin embargo, todavía se debate si los cambios en las propiedades físicas de la pared celular determinan el destino celular 2,3,4. Debido a que las células vegetales no se mueven durante el desarrollo, la forma final de un órgano depende de qué tan lejos y en qué dirección se expande una célula. Por lo tanto, la raíz de Arabidopsis es un buen modelo para estudiar el impacto de las propiedades físicas de la pared celular en la expansión celular porque se producen diferentes tipos de expansión en diferentes regiones de la raíz. Por ejemplo, la expansión anisotrópica es evidente en la zona de elongación y particularmente notable en las células epidérmicas5.
El método descrito aquí se utilizó para caracterizar las propiedades físicas de la pared celular de las células epidérmicas a nanoescala de raíces vivas de Arabidopsis utilizando un microscopio de fuerza atómica (AFM) junto con un microscopio de fase de fluorescencia invertida6. Para una revisión extensa de la técnica AFM, lea 7,8,9.
Este protocolo describe un método básico de preparación de muestras y un método general para mediciones de elasticidad basadas en AFM de paredes celulares vegetales.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63533/63533fig01v2.jpg"> Figura 1: Resumen esquemático del experimento de indentación de fuerza en raíces de Arabidopsis utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM). El esquema ofrece una visión general de los pasos de un experimento de Fuerza-Indentación desde la preparación del sustrato para inmovilizar firmemente la muestra de raíz (1-2), la confirmación de la viabilidad de la raíz a través de la tinción de yoduro de propidio (3), el posicionamiento en voladizo en la superficie de una célula epidérmica alargada de la raíz primaria (4-5), la medición de curvas de fuerza (6) y el procesamiento de la curva de fuerza para calcular el módulo de Young aparente (7-8). EZ: zona de elongación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63533/63533fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>1 x Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td></td><td></td><td>Incluye cloruro de sodio y tampón de fosfato y está formulado para prevenir el choque osmótico y mantener el equilibrio hídrico en las células vivas.</td></tr><tr><td>Software AFM</td><td>Bruker, Billerica, MA, EE. UU</td><td></td><td></td></tr>. <tr><td>Microscopía de fuerza atómica (AFM)</td><td>BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Catalyst Soporte de sonda-fluido</td><td>Bruker, Billerica, MA, EE. UU</td>. <td>CAT-FCH</td><td>Un soporte de sonda para el catalizador Bioscope, diseñado para el funcionamiento de fluidos en contacto o en modo de golpeo. También es compatible con el funcionamiento por aire.</td></tr><tr><td>Osmómetro crioscópico; modelo OSMOMAT 030</td><td>Gonotech, Berlín, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog Medium</td><td>Duchess Biochemie</td><td>M0221</td><td>Concentración original, (1962)</td></tr><tr><td>Microscopio óptico invertido acoplado al AFM</td><td>Olympus IX81, Miami, FL, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEGAMIL</td><td>ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina</td><td>100429</td><td>Pegamento de silicona neutro, no ácido</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Deltalab</td><td>200201.B</td><td>Poliestireno, 55 x 14 mm, estéril por radiación.</td></tr><tr><td>Yoduro de propidio</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>Para prueba de viabilidad radicular.</td></tr><tr><td>Sonda de nitruro de silicio, DNP-10, voladizo A</td><td>Bruker, Billerica, MA, EE. UU</td><td>. DNP-10/A</td><td>Para microscopía de modulación de fuerza en operación líquida. Radio de la punta de la sonda de 20-60 nm. 175-&mu; voladizo triangular de m-largo,&nbsp; con una constante de resorte de 0,35 N/m.</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Sigma</td><td>T4537</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopía de fuerza atómica para estudiar las propiedades físicas de las células epidérmicas de raíces vivas de arabidopsis

Atomic Force Microscopy to Study the Physical Properties of Epidermal Cells of Live Arabidopsis Roots

Aquí se describe un método para caracterizar las propiedades físicas de la pared celular de las células epidérmicas de raíces vivas de Arabidopsis a través de nanoindentaciones con un microscopio de fuerza atómica (AFM) junto con un microscopio óptico de fluorescencia invertida. El método consiste en aplicar fuerzas controladas a la muestra mientras se mide su deformación, permitiendo cuantificar parámetros como el aparente módulo de Young de las paredes celulares a resoluciones subcelulares. Requiere una cuidadosa inmovilización mecánica de la muestra y una correcta selección de penetradores y profundidades de hendidura. Aunque solo se puede usar en tejidos externos, este método permite caracterizar los cambios mecánicos en las paredes celulares de las plantas durante el desarrollo y permite la correlación de estos cambios microscópicos con el crecimiento de un órgano completo.

Experimentos de forzamiento-sangría El siguiente texto presenta algunos resultados esperados cuando se realiza un experimento de sangría forzada para mostrar la salida típica que se espera cuando el protocolo está bien ejecutado.
Curvas fuerza-desplazamiento En la Figura 2 se presentan gráficas representativas de indentación de fuerza que se obtuvieron sangrando de muestras vivas en una posición colocada en el centro de la c...

El protocolo de indentación de microscopía de fuerza atómica ofrece la posibilidad de diseccionar el papel de las propiedades físicas de la pared celular de una célula particular de un tejido u órgano durante el crecimiento normal o restringido (es decir, bajo déficit de agua).

Microscopía de fuerza atómica para estudiar las propiedades físicas de las células epidérmicas de raíces vivas de Arabidopsis

A method is described here to characterize the physical properties of the cell wall of epidermal cells of living Arabidopsis roots through ...

Este método permite cuantificar los cambios en las propiedades físicas de la pared celular de la planta durante el desarrollo y relacionar estos cambios microscópicos con el crecimiento de todo un órgano. La principal ventaja de esta técnica es que no es invasiva y no requiere ningún tratamiento que permita la cuantificación in vivo de las propiedades físicas de la pared celular añadiendo resolución subcelular relativamente rápida. Para comenzar, extienda una capa delgada de pegamento de silicona en la placa de Petri con un cubreobjetos y déjelo en el aire durante 45 segundos.Usando pinzas, coloque la plántula sobre el pegamento y oriente su dirección para evitar el contacto entre las partes sobresalientes de la plántula y el voladizo. Luego presione la raíz suavemente contra la capa de pegamento de silicona para unirla firmemente. Déjelo durante 45 segundos y agregue la solución 1X PBS.Monte el voladizo de nitruro de silicio estándar con una punta piramidal en el soporte de la sonda AFM para fluido, y alinee el láser en el voladizo cerca de la posición de la punta. Luego mueva el fotodiodo para colocar el punto láser en el centro del detector. Calibre la sensibilidad a la deflexión realizando una hendidura con un tamaño de rampa de 3 micrómetros, una velocidad de indentación y retracción de 0,6 micrómetros por segundo y un umbral de disparo de 0,5 voltios.Asegúrese de que la sonda no interactúe con la muestra y calibre la constante de resorte del voladizo. Con la utilidad de ajuste térmico, haga clic en calibrar seguido de ajuste térmico o en el icono de ajuste térmico en la barra de herramientas del nanoscopio e ingrese la temperatura en voladizo. Después de seleccionar un rango de frecuencia, haga clic en el botón del fluido oscilador armónico de muestra.A continuación, haga clic en los datos adquiridos en el panel de ajuste térmico. Ahora, ajuste el ancho medio del filtro a tres. Ajuste el ancho de binwidth de PSD para reducir el ruido en los datos adquiridos promediando y estableciendo límites de ajuste alrededor del primer pico de resonancia.Haga clic en calcular la constante de resorte K y luego haga clic en sí en la ventana emergente, preguntando si el usuario desea usar este valor. Usando el microscopio óptico invertido a 10, 20 y 40 veces el aumento del ocular, coloque la sonda AFM en la superficie de la cuarta célula epidérmica alargada de la raíz primaria asegurándose de colocarla en el centro de la célula. Con el valor constante de resorte calculado previamente se obtuvieron curvas de fuerza con un tamaño de rampa de 3 micrómetros, un umbral de activación de 11 nanonewton, y una tasa de indentación y retracción de 0,6 micrómetros por segundo en puntos seleccionados.Obtenga curvas de fuerza de tres células por raíz para cada tratamiento y capture al menos 150 curvas de fuerza para cada raíz. Este gráfico muestra un resultado esperado cuando se realiza un experimento de indentación de fuerza en muestras vivas colocadas en el centro de la celda de la zona de elongación de la raíz. Cuando la punta AFM comienza a sangrar la superficie de la pared celular, la fuerza comienza a aumentar debido a la oposición de la pared celular a la difamación.El aumento de la fuerza continúa hasta que se alcanza el valor máximo de fuerza. Después de este punto, comienza la parte de descarga de la sangría. La fuerza crece después de una parábola en la parte de indentación, que es importante para ajustar cada curva al modelo de predicción para penetradores piramidales utilizados para los cálculos.Como parámetro de ajuste, la posición del punto de contacto debe corresponder a la superficie de la pared celular antes de la hendidura y se considera el origen del desplazamiento de la punta AFM. Las curvas de fuerza en las que es imposible detectar el punto de contacto antes de la hendidura deben descartarse. Además, la curva de carga y descarga del experimento de indentación de fuerza debe estar desprovista de ruido.Después de ajustar cada curva de fuerza al modelo, se obtuvieron histogramas que mostraron la distribución de la frecuencia de los valores obtenidos del módulo de Young aparente. Este histograma muestra la frecuencia obtenida con un conjunto de 201 hendiduras exitosas en nueve celdas diferentes de tres plantas diferentes de Columbia Zero cultivadas en condiciones de control. La hendidura podría ser difícil para algunos genotipos debido a la morfología de la raíz.Por ejemplo, el mutante doble TTL 1 PRC 1-1 creció en estrés osmótico severo. Estos histogramas muestran la distribución de probabilidad de los valores obtenidos del módulo de Young aparente a partir de nueve celdas diferentes. Sólo el histograma H que corresponde a una celda podría ajustarse a una distribución gaussiana.El metal aquí presentado podría combinarse con otras técnicas como estudios de tasa de crecimiento o análisis de la composición química de la pared celular. Estas otras técnicas complementarán aún más la información para comprender cómo la composición química en las propiedades físicas de la pared celular afecta el crecimiento de un órgano.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Se describe un protocolo utilizando portaobjetos de cámara y los medios para inmovilizar los cotiledones de la planta para la formación de imágenes confocal de la epidermis durante varios días de desarrollo, la documentación de diferenciación estomática. Proteínas marcadas con fluoróforo se puede seguir dinámicamente por la expresión y localización subcelular, mejorar la comprensión de sus posibles funciones durante la división celular y la diferenciación de células de tipo.

A largo plazo, de alta resolución de imagen confocal Time Lapse de<em&gt; Cotiledones Arabidopsis</em&gt; Epidermis durante la germinación

Describimos un método para mapear las propiedades mecánicas de los tejidos vegetales utilizando un microscopio de fuerza atómica (AFM). Nos centramos en cómo registrar los cambios mecánicos que tienen lugar en las paredes celulares durante el desarrollo de las plantas a mesoescala de campo amplio, lo que permite correlacionar estos cambios con el crecimiento y la morfogénesis.

Cartográficas basadas en AFM de las propiedades elásticas de las paredes celulares: en tejido, celular, y las Resoluciones Subcelulares

El objetivo de este protocolo es demostrar cómo monitorear la dinámica de proteínas con fluorescencia de etiquetado en las superficies celulares de las plantas con la microscopía de epifluorescencia de ángulo variable, mostrando parpadear puntos de PATROL1 GFP-etiquetados, una proteína tráfico de membrana, en la corteza celular del complejo estomático en Arabidopsis thaliana.

Imágenes en tiempo real de la Planta Dinámica superficie celular con Variable de ángulo epifluorescencia Microscopía

La celulosa cristalina es un componente importante de la pared celular de la planta. Sin embargo, su cuantificación a una resolución celular es técnicamente desafiante.  Aquí, reportamos el uso de la tecnología de luz polarizada y secciones transversales de raíces para obtener información de la composición de la pared celular a una resolución espacio-temporal.

Alta resolución Cuantificación de celulosa cristalina acumulación en<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Las raíces para monitorear la célula específica de tejido de pared Modificaciones

Este artículo muestra cómo cultivar plántulas de Arabidopsis thaliana en una plataforma de dos capas de microfluidos que confina la raíz principal y pelos de la raíz a un solo plano óptico. Esta plataforma puede utilizarse para imágenes ópticas en tiempo real de la morfología de la raíz fina, así en cuanto a la proyección de imagen de alta resolución por otros medios.

La morfología del pelo de la raíz de plántulas de Arabidopsis en una plataforma de microfluídica de dos capas de imagen

Aquí, presentamos la microscopía de fuerza atómica (AFM), operada como una herramienta de nano- y micro-indentación en células y tejidos. El instrumento permite la adquisición simultánea de la topografía de superficie 3D de la muestra y sus propiedades mecánicas, incluyendo el módulo de Young de la pared celular, así como la presión del turgencia.

Uso de la Microscopía de Fuerza Atómica para Medir las Propiedades Mecánicas y la Presión Turgor de Células Vegetales y Tejidos Vegetales

Aquí describimos un protocolo para la toma de imágenes de células vivas del citoesqueleto de microtúbulo cortical en el brote de meristem apical y el seguimiento de su respuesta a los cambios en las fuerzas físicas.

Imágenes de células vivas de citoesqueleto de microtúbulo y manipulación micromecánica del Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Los estudios de biomecánica de la pared celular son esenciales para comprender el crecimiento y la morfogénesis de las plantas. Se propone el siguiente protocolo para investigar las paredes celulares primarias delgadas en los tejidos internos de órganos de plantas jóvenes utilizando microscopía de fuerza atómica.

Caracterización de las propiedades mecánicas de la pared celular primaria en órganos vegetales vivos mediante microscopía de fuerza atómica

Este artículo describe dos métodos de fenotipado sin el uso de peelings epidérmicos para caracterizar los genes que controlan el desarrollo estomatizante. El primer método demuestra cómo analizar un fenotipo estomatizado utilizando una epidermis vegetal teñida con azul de toluidina. El segundo método describe cómo identificar ligandos estomacales y monitorear sus actividades biológicas.

Identificación de los genes implicados en el desarrollo estomatológico mediante la puntuación del fenotipo epidérmico

Aquí se introducen varios métodos de uso común para estudiar los eventos de tráfico de membrana de una quinasa receptora de membrana plasmática. Este manuscrito describe protocolos detallados que incluyen la preparación del material vegetal, el tratamiento farmacológico y la configuración de imágenes confocales.

Métodos basados en imágenes para estudiar los eventos de tráfico de membrana en células de linaje estomática

Este proceso utiliza microscopía confocal junto con un núcleo marcado fluorescentemente y una línea de marcadores de cromatina en Arabidopsis thaliana para registrar simultáneamente la dinámica del núcleo y la cromatina en raíces de Arabidopsis e investigar cambios en estas dinámicas en respuesta a señales de desarrollo y ambientales.

Imagen cuantitativa de células vivas de la forma nuclear y la dinámica de la cromatina durante el desarrollo y el estrés ambiental en la raíz de Arabidopsis thaliana

Aprende a usar la microscopía de fuerza atómica para analizar propiedades físicas de paredes celulares en Arabidopsis. Este método no invasivo permite cuantificar cambios in vivo con alta resolución subcelular.

Microscopía de fuerza atómica para estudiar las propiedades físicas de las células epidérmicas de raíces vivas de Arabidopsis

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