Name: Localización de factor de una sola célula en cromatina utilizando escisión de entrada ultra baja bajo objetivos y liberación con nucleasa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprende a localizar factores en cromatina a nivel de célula única con CUT&RUN en formato manual de 96 pocillos. Esta técnica reduce requisitos de entrada celular y tiempo de procesamiento respecto a ChIP-seq convencional.

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Agradecemos a los miembros del Laboratorio Hainer por leer y comentar una versión anterior de este manuscrito. Este proyecto utilizó el NextSeq500 disponible en el Núcleo de Secuenciación de Ciencias de la Salud de la Universidad de Pittsburgh en el Hospital Pediátrico UPMC de Pittsburgh para la secuenciación con un agradecimiento especial a su director, William MacDonald. Esta investigación fue apoyada en parte por el Centro de Computación de Investigación de la Universidad de Pittsburgh a través de los recursos informáticos proporcionados. Este trabajo fue apoyado por el Número de Subvención R35GM133732 de los Institutos Nacionales de Salud (a S.J.H.).

<ol><li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li>
<li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking%3A+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li>
<li>Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+has+a+local+effect+on+transcription+and+histone+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).</li>
<li>Albert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+and+rotational+settings+of+H2A.Z+nucleosomes+across+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).</li>
<li>Blat, Y., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesins+bind+to+preferential+sites+along+yeast+chromosome+III%2C+with+differential+regulation+along+arms+versus+the+centric+region%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region.</a> Cell. 98 (2), 249-259 (1999).</li>
<li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+location+and+function+of+DNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide location and function of DNA binding proteins.</a> Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li>
<li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).</li>
<li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprecipitation+of+native+chromatin%3A+NChIP%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31 (1), 76-82 (2003).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
<li>Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+epigenomic+profiling+using+100+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells.</a> Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).</li>
<li>Shankaranarayanan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-tube+linear+DNA+amplification+%28LinDA%29+for+robust+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq.</a> Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Grosselin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+ChIP-seq+identifies+heterogeneity+of+chromatin+states+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer.</a> Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).</li>
<li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).</li>
<li>Zwart, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+carrier-assisted+ChIP-seq+method+for+estrogen+receptor-chromatin+interactions+from+breast+cancer+core+needle+biopsy+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples.</a> BMC Genomics. 14, 232(2013).</li>
<li>Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cChIP-seq%3A+a+robust+small-scale+method+for+investigation+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications.</a> BMC Genomics. 16, 1083(2015).</li>
<li>Brind'Amour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nature Communications. 6, 6033(2015).</li>
<li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. hI. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChlC+and+ChEC%3B+genomic+mapping+of+chromatin+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li>
<li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733(2015).</li>
<li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856(2017).</li>
<li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+CUT%26RUN+chromatin+profiling+tools%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Improved CUT&RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314(2019).</li>
<li>Hainer, S. J., Bošković, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+pluripotency+factors+in+single+cells+and+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos.</a> Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUT%26Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).</li>
<li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+%28ACT-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).</li>
<li>Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+profiling+of+multiple+chromatin+proteins+in+the+same+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells.</a> Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).</li>
<li>Patty, B. J., Hainer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+chromatin+profiling+genome-wide+using+uliCUT%26RUN+in+single+cells+and+individual+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&RUN in single cells and individual blastocysts.</a> Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).</li>
<li>Zheng, X. -Y., Gehring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-input+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+endosperm+using+CUT%26RUN%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&RUN.</a> Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin%2C+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li>
<li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos relacionados con este proyecto.

CUT&RUN es un protocolo eficaz para determinar la localización de proteínas en la cromatina. Tiene muchas ventajas en relación con otros protocolos, que incluyen: 1) alta relación señal-ruido, 2) protocolo rápido y 3) baja cobertura de lectura de secuenciación requerida, lo que lleva a ahorros de costos. El uso de proteína A o proteína A/G-MNasa permite aplicar CUT&RUN con cualquier anticuerpo disponible; por lo tanto, tiene el potencial de perfilar rápida y fácilmente muchas proteínas. Sin embargo, la adaptación a una s...

Muchas proteínas nucleares funcionan interactuando con la cromatina para promover o prevenir actividades basadas en plantillas de ADN. Para determinar la función de estas proteínas que interactúan con la cromatina, es importante identificar las ubicaciones genómicas en las que se unen estas proteínas. Desde su desarrollo en 1985, la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) ha sido el estándar de oro para identificar dónde se une una proteína a la cromatina 1,2. La técnica chIP tradicional tiene el siguiente flujo de trabajo básico: las células se cosechan y se reticulan (generalmente con formaldehído), la cromatina se corta (generalmente con métodos de sonicación severos, lo que requiere reticulación), la proteína de interés se inmunoprecipita utilizando un anticuerpo que se dirige a la proteína (o proteína marcada) seguido de un anticuerpo secundario (acoplado a agarosa o perlas magnéticas), la reticulación se invierte, la proteína y el ARN se digieren para purificar el ADN, y este ADN enriquecido con ChIP se utiliza como plantilla para el análisis (utilizando sondas radiomarcadas 1,2, qPCR3, microarrays 5,6 o secuenciación4). Con el advenimiento de los microarrays y la secuenciación profunda masivamente paralela, ChIP-chip 5,6 y ChIP-seq4 se han desarrollado más recientemente y permiten la identificación de todo el genoma de la localización de proteínas en la cromatina. La reticulación ChIP ha sido una técnica potente y fiable desde su advenimiento con importantes avances en resolución por ChIP-exo7 y ChIP-nexus8. En paralelo al desarrollo de ChIP-seq, se han establecido protocolos nativos (no reticulación) para ChIP (N-ChIP), que utilizan la digestión de nucleasas (a menudo utilizando nucleasa microcócica o MNasa) para fragmentar la cromatina, a diferencia de la sonicación realizada en las técnicas tradicionales de ChIP de reticulación9. Sin embargo, un inconveniente importante de las tecnologías de reticulación ChIP y N-ChIP ha sido el requisito de un alto número de células debido al bajo rendimiento de ADN después de la manipulación experimental. Por lo tanto, en años más recientes, muchos esfuerzos se han centrado en optimizar las tecnologías ChIP para la entrada de células bajas. Estos esfuerzos han dado lugar al desarrollo de muchas tecnologías poderosas basadas en ChIP que varían en su aplicabilidad y requisitos de insumos 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Sin embargo, han faltado tecnologías basadas en ChIP-seq de una sola célula, especialmente para las proteínas no histonas.
En 2004, se desarrolló una tecnología alternativa para determinar la ocupación de proteínas en la cromatina denominada Escisión Endógena de Cromatina (ChEC) e Inmunoapalamento de Cromatina (ChIC)19. Estas técnicas de locus único utilizan una fusión de MNasa a la proteína de interés (ChEC) o a la proteína A (ChIC) para el corte directo del ADN adyacente a la proteína de interés. En años más recientes, tanto ChEC como ChIC se han optimizado para el perfil de proteínas de todo el genoma en la cromatina (ChEC-seq y CUT&RUN, respectivamente)20,21. Si bien ChEC-seq es una técnica poderosa para determinar la localización de factores, requiere el desarrollo de proteínas de fusión de MNasa para cada objetivo, mientras que ChIC y su variación de todo el genoma, CUT&RUN, se basan en un anticuerpo dirigido hacia la proteína de interés (como con ChIP) y la proteína A-MNasa recombinante, donde la proteína A puede reconocer la región constante IgG del anticuerpo. Como alternativa, se ha desarrollado una fusión proteína A/proteína G-MNasa (pA/G-MNasa) que puede reconocer una gama más amplia de regiones constantes de anticuerpos22. CUT&RUN se ha convertido rápidamente en una alternativa popular a ChIP-seq para determinar la localización de proteínas en todo el genoma de la cromatina.
La entrada ultrabaja CUT&RUN (uliCUT&RUN), una variación de CUT&RUN que permite el uso de entradas bajas y de una sola celda, se describió en 201923. Aquí, se describe la metodología para una aplicación manual de una sola celda en formato de 96 pocillos. Es importante destacar que desde el desarrollo de uliCUT&RUN, se han desarrollado dos alternativas para el perfilado de histonas, CUT&Tag e iACT-seq, proporcionando perfiles robustos y altamente paralelos de proteínas histonas24,25. Además, scCUT&Tag ha sido optimizado para perfilar múltiples factores en una sola célula (multiCUT&Tag) y para su aplicación a proteínas no histonas26. Juntos, CUT&RUN proporciona una alternativa atractiva a ChIP-seq de baja entrada donde uliCUT&RUN se puede realizar en cualquier laboratorio de biología molecular que tenga acceso a un clasificador celular y equipo estándar.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microfuga transparentes de 1,5 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>90410</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 1,5 mL gradilla magnética</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga fría compatible con tubo de 1,5 mL</td><td>Eppendorf 5404000537</td><td></td><td></td></tr><tr><td>placas de cultivo de tejidos estériles de 10 cm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150464</td><td></td></tr><tr><td>10X T4 Tampón de ADN Ligasa</td><td>Nuevo Inglaterra Biolabs</td><td>B0202S</td> Tubos cónicos de <td></td></tr><tr><td>15 mL VWR</td><td></td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>1X Tampón TE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12090015</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L Tubos de PCR</td><td>Eppendorf</td><td>951010022</td><td></td></tr><tr><td>tampón de ligasa rápida 2X</td><td>Tampón de ligasa</td><td>M2200</td> de <td>New England Biolabs</td> Tampón de ligasa</tr><tr><td>5X TAMPÓN KAPA HiFi</td><td>de Roche</td><td>7958889001</td><td>5X tampón de PCR de alta fidelidad</td></tr><tr><td>7-amino-actinomicina D (7-AAD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB559925</td><td></td></tr><tr><td>rack magnético de 96 pocillos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12027 o 12331D</td><td></td></tr><tr><td>placa de 96 pocillos</td><td>VWR</td><td>82006-636</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP perlas</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>de poliestireno-magnetita; Debido a la posible variabilidad entre los lotes de cuentas AMPure XP, se recomienda calibrar su solución de cuentas AMPure. Ver fabricante' s instrucciones Anticuerpo</td></tr><tr><td>a la proteína de interés</td><td>varía ATP</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0441</td><td></td></tr><tr><td>BioMag Plus Concanavalin A beads</td><td>Polysciences</td><td>86057-10</td><td>ConA-conjugado microesferas paramagnéticas</td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio (CaCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ62905AP</td><td></td></tr><tr><td>Clasificador de células</td><td>BD FACSAria II clasificador</td><td></td> de células <td>Requiere formación</td></tr><tr><td>Medios específicos de células para el cultivo celular</td><td>Varía</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C298-500</td><td>El cloroformo es irritante de la piel y dañino si se ingiere; manéjelo en una campana de gases químicos con guantes, una bata de laboratorio y gafas</td></tr><tr><td>protectoras Computadora con procesador de 64 bits y acceso a un clúster</td><td></td><td></td> de supercomputación<td>Para análisis computacionales de conjuntos de datos de secuenciación resultantes</td></tr><tr><td>Columnas de espín de ADN</td><td>Epoch Life Sciences</td><td>1920-250</td><td></td></tr><tr><td>dNTP set</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>El equipo de electroforesis</td><td>varía Etanol</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>22032601</td><td>El etanol al 100% vol/vol es altamente inflamable; mango en una campana de gases químicos con guantes, una bata de laboratorio, y gafas</td></tr><tr><td>de ácido etilendiaminotetraacético&nbsp; (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482100</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Glucógeno</td><td>VWR</td><td>97063-256</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Heterólogo S. cerevisiae Espiga de ADN en</td><td>casa</td><td></td><td>Preparado a partir de ADN genómico extraído en gel de agarosa y reticulado, digerido por MNasa y purificado de proteína/ARN y diluido a 10 ng/mL. Recomendamos el ADN genómico de la levadura, pero se pueden utilizar otros organismos si es necesario.</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico&nbsp; (HCl)</td><td>El</td> ácido clorhídrico <td>A144-212</td> de <td>Fisher Scientific es muy corrosivo; manéjelo en una campana de gases químicos con guantes, una bata de laboratorio y gafas</td></tr><tr><td>protectoras El cubo de hielo</td><td>varía</td> Plataforma <td></td><td></td></tr><tr><td>de secuenciación Illumina (p. ej., NextSeq500)</td><td>Incubadora Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>con control de temperatura y atmósfera</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51030284</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HotStart HiFi ADN polimerasa con 5X TAMPÓN KAPA HiFi</td><td>Roche</td><td>7958889001</td><td>hotstart polimerasa de alta fidelidad</td></tr><tr><td>Campana de flujo laminar Bakery</td><td>Company</td><td>SG404</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de manganeso (MnCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>Juego de micropipetas</td><td>Rainin</td><td></td> 30386597 <td></td></tr><tr><td>Minifuge</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador NEB</td><td>Adaptador de E6612AVIAL de New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imprimación universal NEB Imprimación</td> universal <td>E6611AVIAL</td> de <td>New England Biolabs</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleótidos multiplex NEBNext para kit Illumina</td><td>New England Biolabs</td><td>E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L</td><td>Imprimadores indexados</td></tr><tr><td>Anticuerpo de control negativo</td><td>Anticuerpos-ABIN101961</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>en líneaAgua libre de nucleasas</td><td>New England Biolabs</td><td>B1500S</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador PCR</td><td>Eppendorf</td><td>2231000666</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de bloqueo de fase</td><td>Qiagen</td><td>129046</td><td></td></tr><tr><td>fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (PCI)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15593049</td><td>El fenol es dañino si se ingiere o entra en contacto con la piel; manéjelo en una capucha de gases químicos con guantes, una bata de laboratorio y gafas protectoras</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10814010</td><td></td></tr><tr><td>Ayuda para pipetas</td><td>Drummond Scientific</td><td># 4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicol (PEG) 4000</td><td>VWR</td><td>A16151</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio (KOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-1</td><td>PRECAUCIÓN El KOH es un irritante para los ojos y la piel como solución sólida y corrosiva. Manéjelo en una campana de gases químicos con guantes, una bata de laboratorio y gafas</td></tr><tr><td>protectoras Inhibidores de la proteasa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>ProteinA/G-MNase</td><td>Epicypher</td><td>15-1016</td><td>pA/G-MNasa</td></tr><tr><td>ProteinA-MNasa, purificada a partir de pK19pA-MN</td><td>Addgene</td><td>86973</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Kit</td><td></td> de ensayo New England Biolabs P8107S <td></td></tr><tr><td>Qubit 1X dsDNA HS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33230</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ensayo Qubit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>Quick Ligase con tampón 2X Quick Ligase</td> New <td>England Biolabs</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>RNasa A</td> New <td>England Biolabs</td><td>T3010</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio&nbsp; (NaOAc)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5150-1L</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td>SDS es venenoso si se inhala; manéjelo con cuidado en espacios bien ventilados con guantes, protección para los ojos y un respirador de grado N95 cuando manipule</td></tr><tr><td>hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-1</td><td>El NaOH es un irritante para los ojos y la piel como una solución sólida y corrosiva. Manéjelo en una campana de gases químicos con guantes, una bata de laboratorio y gafas</td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de luz invertida estándar</td><td>Leica 11526213</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiales estándar de gel de agarosa de laboratorio</td><td>Varía Los materiales de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>laboratorio estándar, como las pipetas serológicas y las puntas de pipeta</td>, <td>Varía T4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADN ligasa</td><td>Nuevo Inglaterra Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN polimerasa</td> New <td>England Biolabs</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Vórtice de sobremesa</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215414</td><td></td></tr><tr><td>Taq ADN polimerasa</td> New <td>England Biolabs</td><td>M0273S</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td>alternativamente, puede usar un baño de agua</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>Triton X-100 es peligroso; use una bata de laboratorio, guantes y gafas protectoras cuando manipule</td></tr><tr><td>tripsina</td><td>Fisher Scientific</td><td></td> MT25052 <td></td></tr><tr><td>Rotador de tubos Enzima</td><td>VWR</td><td></td> 10136084 <td></td></tr><tr><td>USER</td><td>New England Biolabs</td><td>M5505S</td><td></td></tr></tbody></table>

localización de factor de una sola célula en cromatina utilizando escisión de entrada ultra baja bajo objetivos y liberación con nucleasa

Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease

Determinar las ubicaciones de unión de una proteína en la cromatina es esencial para comprender su función y los posibles objetivos reguladores. La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) ha sido el estándar de oro para determinar la localización de proteínas durante más de 30 años y se define por el uso de un anticuerpo para extraer la proteína de interés de la cromatina sonicada o digerida enzimáticamente. Más recientemente, las técnicas de anclaje de anticuerpos se han vuelto populares para evaluar la localización de proteínas en la cromatina debido a su mayor sensibilidad. Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease (CUT&RUN) es el derivado de todo el genoma del inmunoaprestigio de cromatina (ChIC) y utiliza la proteína A recombinante unida a la nucleasa microcócica (pA-MNasa) para identificar la región constante IgG del anticuerpo dirigida a una proteína de interés, lo que permite la escisión específica del sitio del ADN que flanquea la proteína de interés. CUT&RUN se puede utilizar para perfilar modificaciones de histonas, factores de transcripción y otras proteínas de unión a la cromatina, como los factores de remodelación de nucleosomas. Es importante destacar que CUT&RUN se puede utilizar para evaluar la localización de proteínas asociadas eucromáticas o heterocromáticas y modificaciones de histonas. Por estas razones, CUT&RUN es un método potente para determinar los perfiles de unión de una amplia gama de proteínas. Recientemente, CUT&RUN ha sido optimizado para el perfil del factor de transcripción en poblaciones bajas de células y células individuales y el protocolo optimizado se ha denominado CUT&RUN de entrada ultra baja (uliCUT&RUN). Aquí, se presenta un protocolo detallado para el perfil de factor de una sola celda utilizando uliCUT& RUN en un formato manual de 96 pocillos.

Aquí, se presenta un protocolo detallado para el perfil de proteínas unicelulares en cromatina utilizando un formato manual de 96 pocillos uliCUT&amp;RUN. Si bien los resultados variarán según la proteína que se perfila (debido a la abundancia de proteínas y la calidad de los anticuerpos), el tipo de célula y otros factores contribuyentes, los resultados anticipados para esta técnica se discuten aquí. La calidad celular (apariencia celular y porcentaje de células viables) y la clasificación de una sola célula deben evalu...

CUT&RUN y sus variantes se pueden utilizar para determinar la ocupación de proteínas en la cromatina. Este protocolo describe cómo determinar la localización de proteínas en la cromatina utilizando uliCUT&RUN unicelular.

Localización de factor de una sola célula en cromatina utilizando escisión de entrada ultra baja bajo objetivos y liberación con nucleasa

Determining the binding locations of a protein on chromatin is essential for understanding its function and potential regulatory targets. Chromatin ...

CUT&RUN es una técnica poderosa para determinar la localización de proteínas en la cromatina, y aquí describimos una versión unicelular de esta técnica en un formato manual de 96 pocillos. La mayoría de las técnicas de localización de proteínas, como ChIP-seq, requieren una alta entrada de células y tardan aproximadamente tres días en completarse. CUT&RUN, debido a la alta señal y el bajo fondo, se ha optimizado para aplicaciones de celda baja y de una sola celda, y se puede completar en un solo día.Imaginamos que esta técnica se puede aplicar a casi cualquier muestra biológica y puede ser especialmente poderosa para determinar la localización de factores en muestras raras y de baja abundancia, como muestras de pacientes preciosos. Antes de realizar cualquier experimento de una sola célula, pruebe el anticuerpo y la técnica en un gran número de células no preciosas. La principal limitación de este experimento es la dependencia de un anticuerpo robusto.Demostrando el procedimiento está Santana Lardo, un experimentado especialista en investigación de mi laboratorio. Después de clasificar las células individuales y los núcleos de unión a las perlas, coloque la placa de 96 pocillos en un bastidor magnético de 96 pocillos y permita que las perlas se unan durante un mínimo de cinco minutos. Luego, retire y deseche el sobrenadante.Agregue 100 microlitros de tampón de bloqueo a las perlas unidas al núcleo, mezcle con pipeteo suave e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Coloque la placa en un estante magnético de 96 pocillos y deje que el sobrenadante se despeje durante un mínimo de cinco minutos. Luego, retire y deseche el sobrenadante sin molestar las cuentas.Retire la placa del bastidor magnético y vuelva a suspender las perlas en 100 microlitros de tampón de lavado por reacción con un pipeteo suave. Vuelva a colocar la placa en el bastidor magnético de 96 pocillos, permita que el sobrenadante se despeje y luego retire y deseche el sobrenadante. Resuspend las perlas en 25 microlitros de tampón de lavado por reacción con pipeteo suave.Haga una mezcla maestra de anticuerpos primarios alícuota 25 microlitros de tampón de lavado por reacción y luego agregue 0.5 microlitros de anticuerpo por reacción. Agregue 25.5 microlitros de la mezcla tampón de lavado de anticuerpos, seguido de un pipeteo suave a cada muestra que se esté tratando con un anticuerpo dirigido a la proteína de interés. Incubar durante una hora a temperatura ambiente.Luego, vuelva a colocar las muestras en el bastidor magnético de 96 pocillos. Una vez que el sobrenadante esté despejado, retírelo y deséchelo sin molestar las cuentas. Después de retirar la placa de la rejilla magnética, lave las perlas con 100 microlitros de tampón de lavado y vuelva a suspender mediante pipeteo.Después de colocar la placa de nuevo en un bastidor magnético de 96 pocillos y desechar el sobrenadante como se demostró anteriormente, vuelva a suspender cada muestra en 25 microlitros de tampón de lavado. Haga una mezcla maestra de proteína A MNasa agregando 25 microlitros de tampón de lavado y una cantidad optimizada de proteína A MNasa por reacción. Agregue 25 microlitros de mezcla maestra de proteína A MNasa a cada muestra, incluidas las muestras de control.Incubar las muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente. Coloque la placa en un bastidor magnético de 96 pocillos. Deje que el sobrenadante se despeje durante un mínimo de cinco minutos y luego retire y deseche el sobrenadante sin molestar las perlas.Después de retirar la placa de la rejilla magnética, lave las perlas con 100 microlitros de tampón de lavado y vuelva a suspender mediante pipeteo suave. Coloque la placa en un estante magnético de 96 pocillos y deseche el sobrenadante como se demostró anteriormente. Luego, retire las muestras del bastidor magnético y vuelva a suspender las perlas en 50 microlitros de tampón de lavado mediante un pipeteo suave.Equilibre las muestras a cero grados Celsius en una mezcla de agua helada durante cinco minutos y luego retire las muestras del baño de agua helada. Agregue un microlitro de cloruro de calcio de 100 milimolares usando una pipeta multicanal. Mezcle bien de tres a cinco veces con pipeteo suave usando una pipeta multicanal de gran volumen y luego devuelva las muestras a cero grados centígrados.Inicie un temporizador de 10 minutos tan pronto como la placa vuelva al baño de agua helada. Detenga la reacción mediante el pipeteo de 50 microlitros de una solución que contiene el doble de la concentración de RSTOP+ y tampón en cada pozo en el mismo orden en que se agregó el cloruro de calcio. Incubar las muestras durante 20 minutos a 37 grados centígrados.Gire la placa a 16, 000 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Coloque la placa en un bastidor magnético de 96 pocillos. Deje que el sobrenadante se despeje durante un mínimo de cinco minutos.Luego, transfiera los sobrenadantes a un plato fresco de 96 pocillos y deseche las cuentas. Para la extracción de ADN, agregue un microlitro de 10% SDS y 0.83 microlitros de 20 miligramos por mililitro de proteinasa K a cada muestra y mezcle las muestras mediante pipeteo suave. Incubar las muestras durante 10 minutos a 70 grados centígrados.Devuelva la placa a temperatura ambiente. Añadir 46,6 microlitros de cloruro de sodio cinco molares y 90 microlitros de 50%PEG4000 y mezclar mediante pipeteo suave. Agregue 33 microlitros de perlas de magnetita de poliestireno a cada muestra e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.Coloque la placa en una rejilla magnética y deje que el sobrenadante se despeje durante unos cinco minutos. Luego, deseche cuidadosamente el sobrenadante sin molestar las cuentas. Enjuague dos veces con 150 microlitros de etanol al 80% sin molestar las perlas.Gire la placa brevemente a 1000 veces G durante 30 segundos. Vuelva a colocar la placa en un bastidor magnético de 96 pocillos y retire todo el etanol residual sin molestar las perlas. Seque las muestras al aire durante unos dos a cinco minutos.Resuspend las perlas en 37,5 microlitros de clorhidrato TRIS 10 milimolar de pH 8 e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Vuelva a colocar la placa en una rejilla magnética y deje que las cuentas se unan durante cinco minutos. Transfiera 36.5 microlitros del sobrenadante a una placa de 96 pocillos nueva compatible con termociclador y deseche las perlas.Después de realizar la evaluación de la calidad celular, se examinó la apariencia y el porcentaje de células, lo que demuestra que no se deben utilizar células madre embrionarias de baja calidad. La clasificación de una sola célula se realizó utilizando la tinción Hoechst 33342, y las células de prueba se contaron para garantizar que se encontrara cero o una célula en cada pozo. El análisis de gel de agarosa reveló una escalera de bajo peso molecular y bibliotecas individuales de uliCUT&RUN unicelulares.El análisis de biblioteca subóptimo y óptimo muestra una escalera de bajo peso molecular, una biblioteca subóptima debido a la digestión ineficiente de Mnase y una biblioteca exitosa con una digestión adecuada. La distribución del analizador de fragmentos muestra que el tamaño esperado de una sola célula oscila entre 150 y 500 pares de bases. Sin embargo, en proteínas grandes, el ADN tendrá alrededor de 270 pares de bases.La ocupación de proteínas utilizando el navegador del genoma de un solo locus que representa un alto número de células o control negativo y CTCF uliCUT & RUN de una sola célula reveló que una sola célula representaba en gran medida picos fuertes, similares a los uliCUT & RUN de células altas. Los mapas de calor de CTCF unicelular o control negativo revelaron un patrón claro de enriquecimiento de lectura directamente sobre los sitios de unión a CTCF establecidos en las células. Los mapas de calor unidimensionales muestran una mayor densidad de lectura sobre los sitios de unión CTCF establecidos en bibliotecas de células individuales en relación con las regiones circundantes y los controles sin anticuerpos, lo que demuestra un enriquecimiento específico de anticuerpos en los sitios de unión establecidos.Equilibrar los núcleos unidos a perlas en el baño de agua helada y no sobrecalentar la muestra con la adición de cloruro de calcio es importante para evitar la digestión excesiva de la cromatina.

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Investigación

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Biology

Biología

Describimos la división endógena de la cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChEC-seq), un método ortogonal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para cartografiar los sitios de unión a proteínas del genoma con proteínas de fusión de nucleasa micrococcal (MNasa).

Genoma de todo el mapa de las interacciones Proteína-ADN con ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Este protocolo describe el uso combinatorio de ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq y perfiles para las líneas celulares y células primarias del ribosoma. Permite el seguimiento de cambios en el factor de transcripción vinculante, novo de transcripción, procesamiento de RNA, rotación y traducción con el tiempo y viendo el curso general de los acontecimientos en las células activadas o cambiantes.

Análisis en tiempo real del Factor de transcripción vinculante, transcripción, traducción y rotación para mostrar los eventos globales durante la activación celular

La identificación de interacciones físicas entre los genes y elementos reguladores es un reto, pero ha sido facilitada por los métodos de captura de conformación de cromosoma. Esta modificación al Protocolo de 4C-seq mitiga sesgo PCR minimizando la amplificación excesiva de plantillas de PCR y maximiza el mappability de Lee mediante la incorporación de un paso de síntesis de enzima de la restricción además.

Captura de alto rendimiento identificación de secuencias reguladoras de genes utilizando secuenciación de próxima generación de conformación Circular cromosoma (4C-seq)

Se describe un método altamente paralelo para medir el escote específico del sitio del ADN a nivel de molécula única. Este protocolo muestra la técnica mediante la restricción endonucleasa NdeI. El método se puede modificar fácilmente para estudiar cualquier proceso que resulte en una escisión de ADN específica del sitio.

Ensayo cinético de molécula única de alto rendimiento paralelo para la escoja de ADN específica del sitio

La escisión bajo objetivos y etiquetado (CUT&amp;Tag) es una estrategia eficiente de perfiles epigenómicos de cromatina. Este protocolo presenta una estrategia refinada de CUT&amp;Tag para el perfilado de modificaciones de histonas en plantas.

Elaboración de perfiles de modificación de H3K4me3 en plantas utilizando escisión bajo objetivos y etiquetado

Hi-C 3.0 es un protocolo Hi-C mejorado que combina reticulantes de formaldehído y glutarato de disuccinimidil con un cóctel de enzimas de restricción DpnII y DdeI para aumentar la relación señal-ruido y la resolución de la detección de interacción de cromatina.

Captura de la conformación cromosómica a través de escalas de longitud

Aquí se presenta un protocolo para mapear la organización tridimensional del genoma con resolución de nucleosomas utilizando el método de captura de conformación cromosómica de todo el genoma Micro-C-XL.

Mapeo de las interacciones del genoma 3D de los mamíferos con Micro-C-XL

Se presenta aquí un protocolo eficiente para el aislamiento de células satélite de músculo de extremidades de ratón con aislamiento de células satélite de células satélite de células satélite de músculo de extremidades de ratón adaptado al estudio de la regulación de la transcripción en fibras musculares por escisión bajo dianas y liberación mediante nucleasa (CUT&amp;RUN).

Un protocolo eficiente para el análisis CUT&amp;RUN de células satélite de ratón aisladas de FACS

La expresión génica está regulada por interacciones de promotores génicos con elementos reguladores distales. Aquí, describimos cómo la baja entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite la identificación de estas interacciones en tipos de células raras, que antes no se podían medir.

Un flujo de trabajo integrado para estudiar la arquitectura del genoma espacio-temporal centrada en el promotor en poblaciones celulares escasas

Este protocolo guía a los principiantes en bioinformática a través de una línea de análisis introductoria de CUT&amp;RUN que permite a los usuarios completar un análisis inicial y la validación de los datos de secuenciación de CUT&amp;RUN. Completar los pasos de análisis descritos aquí, combinados con la anotación de picos aguas abajo, permitirá a los usuarios extraer información mecanicista sobre la regulación de la cromatina.

Análisis introductorio y validación de datos de secuenciación CUT&#38;RUN

Se describe un protocolo optimizado de Cliavage Under Targets and Release Using Nuclease followed by next generation sequencing (CUT&amp;RUN-seq) para líneas celulares de cáncer de pulmón de células pequeñas neuroendocrinas. Permite el mapeo genómico de diversas modificaciones de histonas y sitios de unión a factores de transcripción (por ejemplo, E2F7) para investigar la desregulación epigenética y transcripcional en la patobiología de SCLC.

Mapeo genómico de modificaciones de histonas y sitios de unión a factores de transcripción en líneas celulares de cáncer de pulmón de células pequeñas neuroendocrinas utilizando CUT&amp;RUN

Aprende a localizar factores en cromatina a nivel de célula única con CUT&RUN en formato manual de 96 pocillos. Esta técnica reduce requisitos de entrada celular y tiempo de procesamiento respecto a ChIP-seq convencional.

Localización de factor de una sola célula en cromatina utilizando escisión de entrada ultra baja bajo objetivos y liberación con nucleasa (Video) | JoVE Journal

Localización de factor de una sola célula en cromatina utilizando escisión de entrada ultra baja bajo objetivos y liberación con nucleasa

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