Name: Microscopía electrónica de fractura por congelación para el análisis de vesículas extracelulares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T12:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Aprende la técnica de fractura por congelación para analizar vesículas extracelulares de células cancerosas de vejiga. Este método permite estudiar la organización interna de membranas y caracterizar microvesículas con microscopía electrónica.

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Esta investigación fue financiada por la Agencia Eslovena de Investigación (fondos básicos de investigación no. P3-0108 y proyecto J7-2594) y el programa de Infraestructura MRIC UL IP-0510. Este trabajo contribuye a la Red Internacional cost-acción CA17116 para la traducción de la investigación sobre derivados perinatales en enfoques terapéuticos (SPRINT), apoyada por COST (Cooperación Europea en Ciencia y Tecnología). Los autores desean agradecer a Linda Štrus, Sanja Čabraja, Nada Pavlica Dubarič y Sabina Železnik por su ayuda técnica con el cultivo celular y la preparación de las muestras y a Marko Vogrinc, Ota Širca Roš y Nejc Debevec por la ayuda técnica para preparar el video.

1. Cultivo de células uroteliales cancerosas y aislamiento de EV
NOTA: Se presenta un protocolo para obtener EV de una línea celular urotelial de cáncer de vejiga invasivo humano (T24). Sin embargo, las condiciones de cultivo deben optimizarse para utilizar otros tipos de células.
<ol><li>Placa T24 células con una densidad de 3 × 104 células/cm2 en tres matraces (superficie de crecimiento de 75 cm2) y comienza con el cultivo de las células en una incubadora de CO2 durante 3 días a 37 °C y un 5% de CO2 (Figura 2A).<ol>
<li>Utilice un medio de cultivo para células T24 en una mezcla 1:1 (v/v) de A-DMEM y F12 suplementada con suero bovino fetal (FBS) al 5%, glutámax de 4 mM, estreptomicina de 100 mg/ml y penicilina de 100 U/ml. NOTA: El siguiente aislamiento produce evs enriquecidos en MVs. Antes de comenzar el aislamiento, inspeccione las células con un microscopio de luz para confirmar la viabilidad y la confluencia (Figura 2B). Comience a recolectar los EV de los medios de cultivo condicionados cuando las células T24 estén al 70% de confluencia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recoger el medio de cultivo con MVs con una pipeta de matraces (T75) en tubos de centrífuga cónicos (Figura 2C). Centrifugadora a 300 × g durante 10 min a 4 °C (Figura 2D).</li>
	<li>Recoja cuidadosamente el sobrenadante en un nuevo tubo de centrífuga con la pipeta (Figura 2E).</li>
	<li>Centrifugar el sobrenadante a 2.000 × g durante 20 min a 4 °C.</li>
	<li>Recoja cuidadosamente el sobrenadante con la pipeta en un nuevo tubo de centrífuga.</li>
	<li>Centrifugar a 10.000 × g durante 40 min a 4 °C. Busque la presencia de un gránulo blanquecino en la parte inferior del tubo. NOTA: Si es necesario, cambie el rotor de la centrífuga para alcanzar la fuerza g requerida. El pellet EV se ve como un pellet blanco en la parte inferior del tubo de la centrífuga (Figura 2F); marcar su ubicación para evitar perder el pellet durante el pipeteo (Figura 2G).</li>
	<li>Deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta. Al pellet, agregue 1,5 ml de PBS y vuelva a suspender el pellet que contiene MV. Coloque la suspensión en un nuevo tubo de centrífuga.</li>
	<li>Centrifugar a 10.000 × g durante 40 min a 4 °C y buscar la presencia de un pellet blanco en la parte inferior del tubo. NOTA: El pellet EV se ve como un parche blanco en la parte inferior del tubo de la centrífuga; marcar su ubicación para evitar perder el pellet durante el pipeteo.</li>
	<li>Deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta. Agregue suavemente el fijador, glutaraldehído al 2,5% en un tampón de cacodilato de sodio de 0,1 M (pH 7,2). Dejar actuar durante 20 min a 4 °C (Figura 2H). PRECAUCIÓN: El glutaraldehído y el cacodilato de sodio son tóxicos. Trabaje en una campana extractora, use guantes protectores y deséchelos adecuadamente.</li>
	<li>Retire con cuidado el fijador con una pipeta. Agregue el tampón de lavado (tampón de cacodilato de sodio de 0,1 M) al pellet. Dejar actuar durante 10 min a 4 °C sin resuspender el pellet.</li>
</ol>2. Congelación de vehículos eléctricos
NOTA: Antes de congelar, primero crioproteja las muestras con glicerol.
<ol><li>Preparar 0,1 M tampón de cacodilato de sodio. Retire el tampón de lavado y agregue 50 μL de glicerol al 30% en un tampón de cacodilato de 0,1 M. Resusponga suavemente los vehículos eléctricos para que la solución sea homogénea. Incubar durante 30 min a 4 °C.</li>
	<li>Limpie los portadores de cobre con un pozo central en el baño ultrasónico con cloroformo durante 5 min (Figura 3A). Séquelos al aire y márquelos con colores si se usan varias muestras (Figura 3B). Hasta su uso, mantenga los transportines en un lugar seco y limpio (por ejemplo, sobre papel de lente en una placa de Petri). No toque los transportines con las manos desnudas.<ol>
<li>Prepare pipetas, soluciones, papel de filtro, pinzas, un estereomicroscopio, un matraz Dewar con freón y nitrógeno líquido (LN2), una varilla de metal y crioviales. Enfríelo con LN2. PRECAUCIÓN: Use equipo de protección y trabaje en consecuencia cuando manipule LN2 y freón enfriado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vuelva a suspender los vehículos eléctricos de nuevo antes de congelarlos. Evitar la formación de burbujas de aire. NOTA: Realice los pasos 2.4-2.7 rápidamente.</li>
	<li>Trabajar bajo un estereomicroscopio (Figura 3C). Transfiera 1.5-1.7 μL de la muestra al pozo central del portador de cobre para hacer una caída convexa que alcance más alto que el borde del portador de cobre sin derramar la muestra sobre el borde (Figura 3D). En caso de derrame excesivo, use papel de filtro para secar el anillo exterior del portador.</li>
	<li>Mezcle el freón solidificado con una varilla de metal para licuarlo nuevamente (Figura 3E).</li>
	<li>Agarre el anillo exterior del portador de cobre con pinzas y sumérjalo en freón enfriado con un suave movimiento de pinzas durante 8 s (Figura 3F). Después de 8 s, transfiera rápidamente el portaaviones a otro matraz Dewar lleno de LN2.</li>
	<li>Proceda inmediatamente a fracturar o almacenar las muestras en LN2. En este último caso, marque un criovial y enfríe las puntas del vial y las pinzas sumergiéndolas en LN2 (Figura 3G). Bajo LN2, recoja los portadores de cobre congelado en el vial, ciérrelo y guárdelos en el recipiente LN2 (Figura 3H) hasta que se congelen.</li>
</ol>3. Fracturación de vehículos eléctricos y fabricación de réplicas
NOTA: Prepare la unidad de fracturación por congelación de acuerdo con las instrucciones de funcionamiento del fabricante. (Figura 4A). Limpie la cámara de la unidad. Coloque los cañones de platino (Pt/C) y carbono (C) en ángulos de 45° y 90°, respectivamente (Figura 4B).
<ol><li>Arranque el sistema de vacío de la unidad. Cuando se alcance una presión de 6,6 × 10−2 Pa (5 × 10−4 Torr), enfríe la cámara unitaria a −150 °C.</li>
	<li>Transfiera los portadores de cobre con muestras congeladas a una unidad de fracturación por congelación utilizando pinzas secas (Figura 4C). Use criotransferencia o trabaje rápido para evitar la descongelación de la muestra y la deposición de los cristales de hielo. Asegure los soportes en la mesa de muestras.</li>
	<li>Espere hasta que el vacío alcance nuevamente 6.6 × 10−2 Pa (5 × 10−4 Torr), y luego ajuste la temperatura del cuchillo a −100 °C (Figura 4D).</li>
	<li>Espere hasta que el vacío alcance 1.0 × 10−3 Pa (8 × 10−6 Torr).</li>
	<li>Observe la muestra con binoculares y acérquese cuidadosamente al cuchillo (Figura 4E).</li>
	<li>Comience a seccionar la muestra activando el movimiento motorizado de la cuchilla (Figura 4F) y la sección hasta que la superficie de la muestra esté lisa (Figura 4G).</li>
	<li>Para la fracturación, apague el movimiento motorizado del cuchillo y proceda con un control manual lento del cuchillo, fracturando así la muestra (Figura 4H). Para proteger la superficie fracturada de la formación de cristales de hielo y escombros hasta la sombra, mueva el cuchillo por encima de la muestra fracturada.</li>
	<li>Continúe con el sombreado Pt a 45° (Figura 4I, J).<ol>
<li>Prepare un cronómetro y/o encienda el monitor de cristal de cuarzo en la unidad de fracturación por congelación, lo que permitirá supervisar el grosor del Pt en la muestra. El espesor recomendado de la capa de Pt medido en el monitor de cristal de cuarzo es de 2,5 nm, lo que corresponde a 4 s de sombreado a una alta tensión y corriente dadas (es decir, la velocidad de sombreado de Pt es de 0,63 nm / s).</li>
		<li>Antes de comenzar el sombreado, aleje el cuchillo de la muestra. Aplique alta tensión en la pistola Pt/C (1.600 V) y aumente la corriente a 60 mA. Las chispas de Pt deben aparecer y deben comenzar a sombrear la muestra. En este punto, inicie la cuenta regresiva de 4 s y / o observe y ubique la posición de Pt en el monitor de cristal de cuarzo. NOTA: El espesor recomendado de la capa C es de 2,5 nm, lo que corresponde a 10 s de sombreado a una alta tensión y corriente dadas.</li>
		<li>Apague la corriente y la alta tensión cuando se obtenga el espesor deseado de Pt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proceda con el sombreado C a 90 ° (es decir, la velocidad del sombreado C es de 0.25 nm / s).<ol>
<li>Aplique alta tensión en la pistola C (1,900 V), aumente la corriente a 90 mA y aparezcan chispas de C y comiencen a sombrear la muestra; en ese momento, comienza la cuenta regresiva de 10 s. Apague la corriente y la alta tensión cuando se obtenga el espesor deseado de C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Limpieza de las réplicas y análisis de réplicas
<ol><li>Utilice los soportes de cobre de la mesa de muestras y transfiéralos con pinzas al agua destilada a temperatura ambiente en una placa de porcelana de 12 pocillos (Figura 4K). Las réplicas flotarán en la superficie del agua, mientras que los portadores se hundirán (Figura 4L).</li>
	<li>Transfiera las réplicas con un bucle de alambre del agua destilada a un pozo con hipoclorito de sodio. Cubra y deje pasar la noche a temperatura ambiente en una campana extractora de humos. PRECAUCIÓN: El hipoclorito de sodio es tóxico. Trabaje en una campana extractora, use guantes protectores y deséchelos adecuadamente.</li>
	<li>Transfiera las réplicas a ddH2O y lávelas durante 30 min. Repetir 3 veces.</li>
	<li>Transfiera las réplicas con un bucle de alambre a una rejilla TEM de cobre de malla (por ejemplo, malla cuadrada o panal 100+). Seque al aire las rejillas durante 2 horas y luego guárdelas en una caja de almacenamiento de rejilla hasta la microscopía. NOTA: En general, las rejillas se pueden almacenar durante meses en condiciones oscuras, secas y de temperatura ambiente.</li>
	<li>Utilice un microscopio TEM para obtener imágenes de las réplicas y obtener micrografías.<ol>
<li>Para hacerlo, inserte una cuadrícula TEM con una réplica e inicie la imagen TEM de acuerdo con los manuales de operación del fabricante. Trabajar a 80 kV o 100 kV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inspeccione la muestra y adquiera micrografías a aumentos cada vez más altos con una cámara en TEM.</li>
	<li>Analizar las micrografías de los MVs. Para las mediciones de los diámetros de MV, utilice el software Fiji/ImageJ16. El diámetro de los MVs es de 4/π veces la medición en las micrografías según Hallett et al.17.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

La caracterización de los MVs, o cualquier otra población de EV aislados, es de primordial importancia para comenzar antes de comenzar los análisis posteriores como los estudios "ómicos" o los estudios funcionales11,18. Aquí, los EV de células T24 uroteliales invasivas de cáncer de vejiga humano se aislaron por centrifugación, y siguiendo el protocolo proporcionado para el análisis por microscopía electrónica de fractura por congelación, demostramos que la fracción aislada se enriqueció en MVs11,13. El aislamiento de los MV estaba desprovisto de restos celulares u orgánulos, lo que confirma un protocolo exitoso de aislamiento y purificación.
La combinación de fijación química y congelación, que son pasos críticos del protocolo, conservó la forma esférica de los EV12. Sin embargo, se necesitan precauciones al evaluar el diámetro del EV mediante fracturación por congelación17. Dado que la fractura pasa a través de la muestra al azar, las membranas MV se dividen en sus planos ecuatoriales y no ecuatoriales. Para proporcionar un método riguroso para analizar las imágenes de especímenes fracturados por congelación y sombreados, Hallett et al. mostraron que el diámetro medio de la vesícula es 4/π veces el tamaño real del diámetro vesicular en la imagen17. Teniendo en cuenta eso, se calculó que los EV de las células T24 tenían un diámetro de 304 nm, lo que encaja en el rango teórico de distribución de tamaño del MV de 100-1000 nm19.
La fracturación por congelación puede complementar la tinción negativa, la técnica TEM más utilizada para visualizar los vehículos eléctricos. Por tinción negativa, la muestra se fija comúnmente químicamente, se seca y se une a una rejilla TEM, y se contrasta con la solución de uranilo. Sin medios de apoyo, los vehículos eléctricos tienden a colapsar, lo que les da una apariencia en forma de copa. Mediante la congelación-fractura, mostramos que las MV son esferas, lo que refleja su forma en espacios extracelulares y fluidos corporales12. Por eso, nuestros resultados también están de acuerdo con las observaciones de evs en crio-ultrafinas secciones20.
Una ventaja crucial de la técnica de congelación-fractura es su poder para resolver la organización interna de la membrana limitante, que es un factor clave para comprender cómo los EV se dirigen e interactúan con las membranas receptoras. Aquí, analizamos las membranas de los EV, sin embargo, la fracturación por congelación podría revelar la organización de la membrana de cualquier otra población de EV. Los MV están formados por la brotación de la membrana plasmática; por lo tanto, se espera que las proteínas de la membrana plasmática y los grupos de proteínas se encuentren en la membrana MV. Nuestros resultados apoyaron que los MVs de células T24 contenían partículas intramembrana, presentando proteínas de membrana integrales. Sobre la base de la distribución de partículas entre la cara E y la cara P, es razonable esperar que las partículas observadas en los MT sean proteínas transmembrana uroplaquinas, que son específicas de células uroteliales21,24. Las partículas observadas fueron escasas, lo que está de acuerdo con estudios previos que informaron una reducción de uroplaquinas durante la carcinogénesis urotelial 21,22,23. Sin embargo, para investigar más a fondo la composición proteica de las membranas MV, se recomienda el uso de la técnica de replica de marcado inmune (FRIL) de congelación-fractura. FRIL es una actualización de la técnica de congelación-fractura presentada y se dedica a revelar la identidad de las proteínas en réplicas mediante el reconocimiento de anticuerpos24,25. En resumen, la técnica de congelación-fractura es una técnica de microscopía electrónica adecuada para la caracterización de la membrana limitante de EV, así como la forma, tamaño y pureza de las fracciones EV aisladas. El protocolo presentado se puede utilizar también para la evaluación de otras poblaciones de EV aisladas; por lo tanto, la técnica de fracturación por congelación merece ser incluida en las directrices de la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares para estudios que exploren la organización de las membranas limitantes de EV.

Las vesículas extracelulares (EV) son vesículas limitadas por membrana liberadas por las células en el espacio extracelular. Las tres poblaciones principales de EV son exosomas, microvesículas (MV) y cuerpos apoptóticos, que difieren en su origen, tamaño y composición molecular 1,2,3. La composición de los EV refleja el perfil molecular de la célula donante y su estado fisiológico (es decir, sana o enferma)4,5. Esto le da a los EV un inmenso potencial en el diagnóstico, pronóstico y terapia de enfermedades humanas, y tienen aplicaciones médicas prometedoras para el uso en medicina personalizada 6,7,8.
Los EV son mediadores de la comunicación intercelular. Contienen proteínas biológicamente activas, lípidos y ARN, que interfieren con los procesos biológicos en la célula receptora y pueden cambiar su comportamiento 9,10. Sin embargo, la composición de la membrana limitante ev es crucial para la interacción con la membrana celular receptora.
Las fuentes de EV son fluidos corporales y medios de cultivo acondicionados. Para aislar a una población ev, se debe utilizar una técnica de aislamiento adecuada. Por ejemplo, la centrifugación a 10.000 × g produce una fracción enriquecida en MT, mientras que las fuerzas centrífugas de ≥100.000 × g producen una fracción enriquecida en exosomas11,12. La fracción aislada de los vehículos eléctricos debe validarse en términos de pureza, tamaño y forma. Para ese propósito, la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares 2018 recomendó tres clases de técnicas de imágenes de alta resolución: microscopía electrónica, microscopía de fuerza atómica y microscopía de superresolución basada en microscopíade luz 13. Ninguna de estas técnicas puede proporcionar información sobre el interior de la membrana EV.
La microscopía electrónica de fractura por congelación es una técnica de romper especímenes congelados para revelar sus estructuras internas, particularmente dando una vista del interior de la membrana. Los pasos de preparación de la muestra son (1) congelación rápida, (2) fracturación, (3) fabricación de la réplica y (4) limpieza de la réplica14. En el paso 1, la muestra se fija (opcionalmente) químicamente, se crioprotegi con glicerol y se congela en freón líquido. En el paso 2, la muestra congelada se fractura en una unidad de congelación-fractura, que expone el interior de la bicapa de membrana. En el paso 3, las caras fracturadas expuestas se sombrean con platino (Pt) y carbono (C) para producir réplicas. En el paso 4, se elimina el material orgánico. La réplica se analiza en el microscopio electrónico de transmisión (TEM). Para una interpretación precisa de las micrografías, se deben seguir las pautas para su correcta orientación14,15. Brevemente, la dirección de las sombras en la micrografía es una referencia para orientar la micrografía (es decir, para determinar la dirección del sombreado Pt) y, en consecuencia, para determinar formas convexas y cóncavas (Figura 1). Dos vistas interiores denominadas caras fracturadas de la bicapa de membrana se pueden ver como resultado de la división de la membrana por fracturación por congelación: la cara protoplásmica (cara P) y la cara exoplásmica (cara E). La cara P representa la valva de membrana adyacente al protoplasma celular, mientras que la cara E representa la valva de membrana adyacente al espacio extracelular. Las proteínas integrales de membrana y sus asociaciones se consideran partículas intramembrana que sobresalen14,15.
Aquí, el objetivo es aplicar la técnica de congelación-fractura para caracterizar los MV en términos de tamaño, forma y la estructura de su membrana limitante. Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento y la congelación-fractura de MVs originados en células uroteliales cancerosas de vejiga invasivas humanas.

<table><tbody><tr><td>A-DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific, EE. UU.</td><td>12491015</td><td></td></tr><tr><td>Balzers dispositivo de congelación-fractura</td><td>Balzers AG, Liechtenstein</td><td>Balzers BAF 200</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf, Alemania</td><td>modelo 5810R</td><td></td></tr><tr><td>incubadora de CO2 HeraCell&nbsp;</td><td>Heraues, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portadores de cobre</td><td>Balzers</td><td>BB 113 142-2</td><td>100+ malla</td></tr><tr><td>Rejillas de cobre</td><td>SPI, Estados Unidos</td><td>2010C</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de cultivo T75</td><td>TPP, Suiza</td><td></td><td>superficie de cultivo 75 cm2</td></tr><tr><td>F12 (HAM)</td><td>Sigma-Aldrich, Alemania</td><td>21765029</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco, Life Technologies, EE. UU</td>. <td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Placa de porcelana esmaltada de 6 pocillos</td><td>Fischer Sientific, Estados Unidos</td><td>50-949-072</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Kemika, Croacia</td><td>711901</td><td>concentración final 30 % (v/v)</td></tr><tr><td>Glutaradehído&nbsp;</td><td>Serva, Alemania</td><td>23114.01</td><td>concentración final 2.5 % (v/v)</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>35050-079</td><td>concentración final 4 mM</td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15140163</td><td>concentración final 100 U/ml</td></tr><tr><td>Microscopio invertido de fase-contrato</td><td>Nikon, Japón</td><td>modelo Eclipse</td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Eppendorf, Alemania</td><td>A 4-44</td><td></td></tr><tr><td>Rotor&nbsp;</td><td>Eppendorf, Alemania</td><td>F-34-6-38</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas</td><td>TPP, Suiza</td><td></td><td>Volumen de 50 ml</td></tr><tr><td>Solución de hipocloruro de sodio en agua</td><td>Carlo Erba, Italia</td><td>481181</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>35050038</td><td>concentración final 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión</td><td>Philips, Países Bajos</td><td>modelo CM100</td><td>trabajando a 80 kV</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>SPI, Estados</td><td></td><td></td> Unidos</tr></tbody></table>

microscopía electrónica de fractura por congelación para el análisis de vesículas extracelulares

Freeze-Fracture Electron Microscopy for Extracellular Vesicle Analysis

Las vesículas extracelulares (EV) son estructuras limitadas por membrana liberadas de las células en el espacio extracelular y están implicadas en la comunicación intercelular. Los EV consisten en tres poblaciones de vesículas, a saber, microvesículas (MV), exosomas y cuerpos apoptóticos. La membrana limitante de los EV está crucialmente involucrada en las interacciones con las células receptoras, lo que podría conducir a la transferencia de moléculas biológicamente activas a las células receptoras y, en consecuencia, afectar su comportamiento. La técnica de microscopía electrónica por congelación-fractura se utiliza para estudiar la organización interna de las membranas biológicas. Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de MV de células uroteliales cancerosas cultivadas y la congelación-fractura de MVs en los pasos de congelación rápida, fracturación, fabricación y limpieza de las réplicas, y su análisis con microscopía electrónica de transmisión. Los resultados muestran que el protocolo de aislamiento produce una población homogénea de EV, que corresponden a la forma y tamaño de los MV. Las partículas intramembrana se encuentran principalmente en la cara protoplásmica de la membrana limitante. Por lo tanto, la fractura por congelación es la técnica de elección para caracterizar el diámetro, la forma y la distribución de las proteínas de membrana de los MT. El protocolo presentado es aplicable a otras poblaciones de vehículos eléctricos.

Los MV se aislaron del medio condicionado de las células T24 uroteliales cancerosas después de centrifugaciones diferenciales. Siguiendo el protocolo, la fracción EV se detectó por primera vez después de la centrifugación a 10.000 × g cuando se vio como un pellet blanco (Figura 2G).
A continuación, los EV se procesaron de acuerdo con el protocolo anterior y se examinaron bajo TEM. El sombreado pt/C produjo (Figura 4L) réplicas relativamente grandes que con frecuencia se rompieron en fragmentos más pequeños durante la etapa de limpieza. Las réplicas grandes y sus fragmentos más pequeños fueron recogidos en la cuadrícula TEM y comparados bajo el microscopio. Los resultados no mostraron diferencias en la calidad de las superficies de réplica independientemente de su tamaño, y por lo tanto, pueden ser utilizadas todas. Los exámenes de bajo aumento mostraron regiones de la réplica con i) una superficie homogénea (fondo), ii) perfiles esféricos cóncavos y convexos (vesículas), y iii) regiones de superficie dañada (artefactos; Figura 5A). Los artefactos típicos fueron vistos como rupturas, pliegues y sombras irregulares de atenuación (es decir, réplicas de depósitos de cristal de hielo en el espécimen). También es importante tener en cuenta que no se observaron restos celulares u orgánulos celulares, lo que confirma la pureza de la muestra (Figura 5B).
Las vesículas aisladas se reunieron comúnmente en grupos de tres o más o se distribuyeron individualmente (Figura 5B). Las vesículas eran esféricas, lo que apunta a una buena preservación de la ultraestructura durante el aislamiento, la fijación y la congelación (Figura 5C). La "bola plana" y las vesículas alargadas (Figura 5C), que se vieron ocasionalmente, fueron presumiblemente artefactos de preparación y no se incluyeron en las mediciones posteriores del diámetro de la vesícula. El diámetro de los perfiles visibles fue de 238,5 nm (±8,0 nm, n = 190), lo que, teniendo en cuenta el factor de corrección propuesto por Hallett et al.17, corresponde al diámetro medio de la vesícula de 304 nm (±10 nm; Figura 5D). El tamaño se correlaciona con un rango de diámetro de MV entre 100 nm y 1000 nm y demuestra la efectividad del protocolo de aislamiento utilizado. Las imágenes de las vesículas junto con la determinación del diámetro confirmaron inequívocamente que los EV en el aislado estaban enriquecidos con MVs.
El análisis de las réplicas reveló la organización de la cara P y la cara E de las membranas limitantes de MV. Los MV se observaron como formas redondas cóncavas y convexas (Figura 5C, E, F), reflejando el plano de fractura. Las formas convexas representan caras E (es decir, valva exoplásmica fracturada de las membranas; Figura 5E). Las caras exoplásmicas de los EV tenían una apariencia lisa y uniforme. Las formas cóncavas corresponden a caras P (Figura 5F). En las caras P, se observaron algunas partículas intramembrana que sobresalían dentro de membranas lisas (Figura 5C, F). Esto implica que los MV aislados de células T24 uroteliales cancerosas contienen solo una baja cantidad de proteínas de membrana.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63550/63550fig01.jpg"> Figura 1: Presentación esquemática de la determinación de la membrana después de la fracturación por congelación. (A) Las microvesículas brotan de la membrana plasmática al espacio extracelular. (B) La microvesícula se limita con la valva de la membrana P y E hasta el fraccionamiento por congelación, que divide las valvas y expone las vistas interiores de las valvas, denominadas caras fracturadas. (C) Después del sombreado de Pt/C, se distinguen dos caras fracturadas: la cara protoplásmica (cara P) con forma convexa frente al citoplasma (protoplasma) y una cara exoplasmática (cara E) con forma cóncava frente al espacio extracelular. La Figura 1 se creó utilizando Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63550/63550fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63550/63550fig02.jpg"> Figura 2: Aislamiento de EV. (A) Las células T24 cultivadas en una incubadora de CO2 se examinan con (B) un microscopio de luz para confirmar su viabilidad y confluencia antes del aislamiento de MV. (C) El medio de cultivo celular se recoge y (D) se centrifuga consecutivamente a 300 × g y a 2.000 × g (E) cada vez que se recoge el sobrenadante. (F,G) Después de la centrifugación a 10.000 × g, se ve y marca un parche blanco que indica un gránulo. El sobrenadante se retira y el fijador (H) se agrega cuidadosamente al pellet sin resuspenderlo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63550/63550fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63550/63550fig03.jpg"> Figura 3: Congelación de vehículos eléctricos. (A) Los portadores de cobre limpio secados al aire con un pozo central se marcan (B) antes del procesamiento. Las microvesículas se resuspenden en glicerol para obtener una muestra homogénea y (C) se agregan a un pozo central de un portador de cobre bajo un estereomicroscopio. (D) Hay que añadir un volumen de la muestra tal que forme una gota convexa en el pozo central. (E) Inmediatamente antes de congelar, mezcle el freón refrigerado por LN2 con una varilla de metal para licuar el freón. (F) Congelar la muestra sumergiéndola en freón, y luego (G) transferirla a LN2. (H) Los portadores con la muestra congelada pueden recogerse en crioviales y almacenarse en un contenedor LN2 Dewar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63550/63550fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63550/63550fig04.jpg"> Figura 4: Fracturación por congelación y fabricación de una réplica. (A) Unidad de fracturación por congelación. Dentro de la cámara unitaria (B) hay una pistola de electrones de platino (Pt) y carbono (C), un cuchillo y la tabla de muestras. (C) Para comenzar la fracturación, los portadores con la muestra se transfieren a la mesa de muestras, (D) se enfría la unidad de fracturación por congelación y se establece un vacío. (E) El seccionamiento se realiza mediante el movimiento motorizado (F) del cuchillo, pero la fracturación se realiza preferiblemente manualmente. (G) Muestra antes de la seccionamiento y (H) después de la fractura. (I) Inmediatamente después de la fractura, se realiza la réplica. (J) Durante este proceso, Pt se observa en la muestra. El sombreado de platino se ve como una luz brillante (chispas) en la cámara. (K) Los portadores de muestras se recogen en un pozo de porcelana lleno de agua. (L) Réplica (flecha) flotando en la solución de hipoclorito de sodio durante la etapa de limpieza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63550/63550fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63550/63550fig05.jpg"> Figura 5: Micrografías electrónicas de MV fracturados por congelación y pt/C sombreados. (A) Una visión general del pellet EV fracturado por congelación y sombreado (i) a menor aumento. La superficie homogénea es de fondo (ii), las áreas brillantes son rupturas en las réplicas (iii), las áreas más oscuras son pliegues de réplicas (asterisco), y las sombras atenuantes irregulares se deben a cristales de hielo (dos asteriscos). (B) Agrupación de vehículos eléctricos de forma redonda con superficies cóncavas y convexas. (C) Aumento elevado de los vehículos eléctricos. En las fracturas convexas, que exhiben cara P de las membranas EV, se ven partículas intramembrana (flechas) y parches de una superficie lisa (puntas de flecha). Se encuentran vesículas extracelulares con formas alargadas (estrella) y de bola plana (dos estrellas). (D) El diámetro medio de los MT uroteliales aislados es de 304 nm ± 10 nm según las medidas de tamaño propuestas por Hallett et al.17. Los datos se presentan como media ± SEM. (E,F) Cara E y Cara P de MVs. Leyenda: flechas = partículas intramembrana en cara P, flechas rodeadas = la dirección del sombreado Pt/C. Barras de escala: A = 10 μm, B-F = 400 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63550/63550fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Presentamos un protocolo para el aislamiento y la fracturación por congelación de vesículas extracelulares (EV) originadas a partir de células uroteliales cancerosas. La técnica de congelación-fractura reveló el diámetro y la forma de los EV y, como característica única, la organización interna de las membranas EV. Estos son de inmensa importancia para comprender cómo los EV interactúan con las membranas receptoras.

Microscopía electrónica de fractura por congelación para el análisis de vesículas extracelulares

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-limited structures released from the cells into the extracellular space and are implicated in intercellular ...

En vídeo, presentamos un protocolo para la fracturación por congelación de vesículas extracelulares procedentes de células de cáncer de vejiga in vitro. Las vesículas extracelulares son vesículas limitadas por membrana que derivadas de las células se liberan en el espacio extracelular y tienen un papel en la comunicación intercelular. Dentro de las vesículas extracelulares, discriminamos tres poblaciones, exosomas, microvesículas y cuerpos apoptóticos, que difieren por su origen, tamaño y composición molecular.La composición molecular de las vesículas extracelulares refleja el perfil molecular de la célula donante e interfiere con los procesos biológicos en la célula receptora. Sin embargo, la composición de la membrana limitante de las vesículas celulares es crucial para la interacción con la membrana celular receptora. Para analizar la organización de la membrana limitante, las vesículas extracelulares deben aislarse primero y luego abordarse a la técnica de congelación-fractura.La congelación-fractura es una técnica microscópica electrónica dedicada a estudiar la organización bidimensional de las membranas biológicas, incluidas las vesículas. Los pasos de la congelación-fractura son la congelación rápida de la muestra, la fractura de la muestra, la fabricación de la réplica de la superficie congelada-fracturada y la limpieza de la réplica para eliminar los materiales biológicos. Las réplicas se visualizan finalmente con microscopio electrónico de transmisión.Nuestro objetivo fue utilizar la técnica de congelación-fractura para caracterizar las microvesículas en términos de forma, tamaño y composición de la membrana. Comience con el crecimiento de células en la incubadora de células. Inspeccione las células bajo el microscopio para confirmar su variabilidad y confluencia.Recoger los medios de cultivo con microvesículas en tubos y centrifugar a 300 g-fuerzas durante 10 minutos. Recoger sobrenadante. Posteriormente, sobrenadante de centrífuga a 2000 fuerzas g y 10,000 fuerzas g.Después de eso, observe la punta del tubo en busca de un gránulo blanquecino que indique microvesículas. Retire con cuidado el sobrenadante. Agregue 1.5 mililitros de PBS y vuelva a suspender el pellet que contiene microvesículas.Luego centrifugar a 10, 000 g-fuerzas. Observe el pellet blanquecino. Retire el sobrenadante y agregue suavemente el fijador.Dejar actuar durante 20 minutos a 4 grados centígrados. A continuación, retire el fijador y agregue el tampón de lavado para enjuagar el pellet sin volver a suspenderlo. Dejar actuar durante 10 minutos a 4 grados centígrados.Retire el tampón de lavado y agregue 30% de glicerol al pellet. Vuelva a suspender el pellet en suspensión homogénea e incube durante 30 minutos a 4 grados centígrados. Prepare portadores de cobre limpios con un hoyo central y desarrolle un matraz con el ceño fruncido y nitrógeno líquido.Bajo el microscopio, transfiera la muestra al pozo central del portador de cobre. Mezcle el freón solidificado para licuar. Agarra el anillo exterior del portador con pinzas y sumérgelo en freón enfriado.Después de ocho segundos, transfiera rápidamente el portador al matraz de desarrollo con nitrógeno líquido. Marca crio vil y enfríalo. Bajo nitrógeno líquido, recoja los portadores en el vil, ciérrelo y guárdelo en el recipiente de nitrógeno líquido hasta que se congele.Prepare la unidad de fracción de congelación de acuerdo con las instrucciones de funcionamiento del fabricante. Encienda el sistema de vacío y enfríe la cámara de la unidad a menos 150 grados centígrados. Transfiera los portadores de cobre con muestra congelada a la unidad de fraccionamiento por congelación.Ajuste la temperatura del cuchillo a menos 100 grados centígrados y espere el vacío. Comience a seccionar la muestra activando el movimiento motorizado de la cuchilla hasta que la superficie de la muestra esté lisa. Para la fracturación, apague el movimiento motorizado del cuchillo y proceda con el control manual lento del cuchillo.Continúe con el sombreado de platino en el ángulo de 45 grados. Encienda la alta tensión y aumente la corriente a la pistola de platino. Las chispas de platino deben comenzar a sombrear la muestra.Supervise la posición del platino en el monitor de espesor de cristal de cuarzo. El espesor recomendado del platino es de 2,5 nanómetros. Apague la corriente y la alta tensión.Proceda con la sombra de carbono en un ángulo de 90 grados. Encienda la alta tensión y aumente la corriente a la pistola de carbono. Las chispas de carbono deben comenzar a sombrear la muestra.Cuando se obtengan 2,5 nanómetros de carbono, apague la corriente y la alta tensión. Transfiera esas muestras con las réplicas de la unidad de congelación-fractura a una placa de 12 válvulas llena de agua de doble destilación. Las réplicas flotarán en la superficie del agua mientras los portadores se hunden.Transfiera réplicas con bucle de alambre a una placa de 12 válvulas llena de hipoclorito de sodio e incube durante la noche. Lave las réplicas en agua de doble destilación. Recógelos en una rejilla TM de cobre de malla y déjalos secar al aire durante dos horas.Utilice un microscopio electrónico de transmisión para obtener imágenes de réplicas y obtener micrografías. Para una interpretación precisa de réplicas y micrografías, siga las pautas para la orientación adecuada en la nomenclatura. Los análisis de réplicas mostraron que el medio aislado-acondicionado contenía fracción enriquecida de vesículas.Las vesículas aisladas se reunieron en grupos de tres o más o muy individualmente distribuidas. Las vesículas tenían forma esférica. El diámetro de las vesículas correspondía al diámetro de las microvesículas.La fracturación por congelación también reveló la organización bidimensional de la membrana de microvesículas. La fase exoplásmica de las microvesículas tuvo un aspecto suave y uniforme, mientras que en la fase de protoplastos observamos partículas entre membranas. Las partículas entre membranas aparecieron esporádicamente, lo que implica que las microvesículas aisladas de las células del material cancerígeno contienen solo una baja cantidad de proteínas de membrana o ensamblajes de proteínas.En resumen, la técnica de congelación-fractura utilizada en el protocolo presentado demuestra ser una técnica óptima para la caracterización de vesículas extracelulares y puede utilizarse para la evaluación de otras poblaciones de vesículas extracelulares. Una ventaja crucial de la técnica de congelación-fractura es su poder para resolver la organización interna de la membrana limitante de vesículas, que determina la función biológica de las vesículas extracelulares.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Fuente: Biller, S. J., et al. Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares cianobacterianas. J. Vis. Exp. (2022)Este video demuestra la preparación de vesículas extracelulares de cianobacterias para microscopía electrónica de transmisión mediante tinción negativa, lo que permite la visualización de alta resolución de la morfología, el tamaño y la pureza de las vesículas para análisis estructurales y comparativos.

Visualización de vesículas extracelulares cianobacterianas mediante microscopía electrónica de transmisión

Se describen las técnicas básicas y los refinamientos de procesamiento de congelación-fractura de las muestras y los nanomateriales biológicos para el examen por microscopía electrónica de transmisión. Esta técnica es un método preferido para revelar características ultraestructurales y especializaciones de las membranas biológicas y para la obtención de datos de dimensiones y espaciales a nivel ultraestructural en ciencias de los materiales y productos de la nanotecnología.

Fundamental elementos técnicos de Freeze-fractura / Freeze-grabado en Biológica Microscopía Electrónica

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La congelación de inmersión: una herramienta para los estudios ultraestructurales e inmunolocalización de células en suspensión en Microscopía Electrónica de Transmisión

En este protocolo, se describe el flujo de trabajo completo para el aislamiento rápido de vesículas extracelulares de sangre humana y caracterización de marcadores específicos por análisis de seguimiento de nanopartículas basada en fluorescencia. Los resultados presentados muestran un alto nivel de reproducibilidad y pueden regularse en sobrenadantes de cultivo celular.

Caracterización basada en fluorescencia rápida de solo vesículas extracelulares en la sangre humana con el análisis de seguimiento de nanopartículas

El protocolo describe un método reproducible diseñado para uso con sobrenadantes de cultivo celular para detectar epítopos superficiales en pequeñas vesículas extracelulares (EV). Utiliza específica inmunoprecipitación EV usando granos juntados con los anticuerpos que reconocen antígenos de superficie CD9, CD63 y CD81. El método está optimizado para el análisis de citometría de flujo aguas abajo.

Análisis Cytometric del vesículas extracelulares de medios acondicionado de célula de flujo

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Imagen de vesículas extracelulares mediante microscopía de fuerza atómica

Aquí presentamos un protocolo fácilmente aplicable para evaluar la estabilidad del almacenamiento de las vesículas extracelulares, un grupo de nanopartículas naturales producidas por las células. Las vesículas se cargan con glucuronidasa como una enzima modelo y se almacenan en diferentes condiciones. Después del almacenamiento, se evalúan sus parámetros fisicoquímicos y la actividad de la enzima encapsulada.

Evaluación de la estabilidad del almacenamiento de vesículas extracelulares

Aquí, presentamos un protocolo para etiquetar las vesículas extracelulares derivadas del lisado plaquetario para monitorear su migración y absorción en los explantes de cartílago utilizados como modelo para la osteoartritis.

Etiquetado de vesículas extracelulares para monitorear la migración y absorción en explantes de cartílago

La microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM) se utiliza para eludir el límite de difracción típico de la microscopía de luz y para ver los exosomas a escala nanométrica. Se puede emplear tanto en dos como en tres dimensiones para caracterizar exosomas.

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Este artículo propone una nueva generación de plataformas analíticas multiparamétricas con mayor rendimiento para la caracterización de subconjuntos de vesículas extracelulares. El método se basa en una combinación de métodos de biodetección multiplexada con análisis metrológicos y morfomecánicos por microscopía de fuerza atómica, junto con espectroscopia Raman, para calificar objetivos vesiculares atrapados en un biochip de microarray.

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Este protocolo describe el aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y la médula ósea mediante digestión enzimática y cromatografía de exclusión de tamaño, permitiendo la recuperación reproducible de fracciones enriquecidas con vesículas de tejidos estructuralmente complejos y de bajo rendimiento para análisis molecular posteriores.

Aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y médula ósea mediante cromatografía de exclusión de tamaño

Aprende la técnica de fractura por congelación para analizar vesículas extracelulares de células cancerosas de vejiga. Este método permite estudiar la organización interna de membranas y caracterizar microvesículas con microscopía electrónica.

Microscopía electrónica de fractura por congelación para el análisis de vesículas extracelulares

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