Name: Evaluación de la ubiquitilación del sustrato por E3 Ubiquitina-ligasa en lisados de células de mamíferos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprende a evaluar la ubiquitilación de sustratos por E3 ligasa en células HEK293T mediante inmunoprecipitación e inmunotransferencia. Este método accesible facilita el estudio de interacciones ligasa-sustrato en enfermedades como cáncer y trastornos neurológicos.

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F.R.T cuenta con el apoyo de la subvención FAPESP número 2020/15771-6 y CNPq Universal 405836/2018-0. P.M.S.P y V.S son compatibles con CAPES. C.R.S.T.B.C fue apoyado por la beca FAPESP número 2019/23466-1. Agradecemos a Sandra R. C. Maruyama (FAPESP 2016/20258-0) por el apoyo material.

NOTA: En la Figura 1 se representa una descripción general del protocolo de ensayo de ubiquitilación en células de mamíferos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63561/63561fig01.jpg"> Figura 1. Descripción general del procedimiento de ensayo de ubiquitilación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63561/63561fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
1. Cultivo celular
<ol><li>Cultivar la línea celular HEK293T en una placa de cultivo tratada con TC de 100 mm a una confluencia del 80%-90% en los medios de crecimiento (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) alta glucosa suplementada con 10% de suero fetal bovino (FBS) y penicilina (100 unidades), estreptomicina (100 μg) y L-glutamina (0,292 mg/ml)). Incubar el cultivo a 37 °C en una incubadora de cultivo celular humidificado al 5% de CO2.</li>
	<li>Para pasar las células, aspire los medios de la placa de cultivo utilizando una pipeta serológica. Lave las células una vez con 1 ml de solución salina esterilizada 1x tamponada con fosfato (PBS 1x).</li>
	<li>Separe las células agregando 1 ml de solución de tripsina/EDTA (ácido etilendiaminotetraacético). Incubar el plato a 37 °C durante 5 min. Resuspend las células utilizando una pipeta serológica en 2 ml de medios de crecimiento.</li>
	<li>Transfiera la suspensión celular a un tubo fresco y limpio de 15 ml y centrífuga a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Retire el sobrenadante vertiéndolo con cuidado. Resusped suavemente el pellet celular en 3 ml de medios de crecimiento mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo para obtener una suspensión celular homogénea.</li>
	<li>Transfiera 1 ml de la suspensión celular a una placa de cultivo tratada con TC de 100 mm que contenga 9 ml de medios de crecimiento. NOTA: Si las células están en buenas condiciones, cada plato de cultivo de HEK293T, en el que la confluencia es del 80%-90%, puede generar tres platos de cultivo con 80% de confluencia 2 días después del paso.</li>
</ol>2. Transfección celular
NOTA: No se recomienda transfectar el cultivo celular si la confluencia alcanzada es inferior al 80%.
<ol><li>Antes de la transfección, certifique si las células están libres de contaminación y en una confluencia adecuada para las transfecciones transitorias.</li>
	<li>Para cada muestra de transfección, prepare los complejos ADN-Polietilenimina (PEI 1 μg/μL a pH 7.2) de la siguiente manera:<ol>
<li>Diluir 3 μg de cada plásmido en 100 μL de medio sérico reducido opti-MEM I sin suplementación y mezclarlo suavemente pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo. NOTA: Aquí, las células fueron transfectadas con 4 μg de cada plásmido: Vector vacío (pcDNA3) o FLAG-Fbxo7 constructos y UXT-V2-HA, con o sin 6xHis-myc-ubiquitin. El contenido total de ADN fue de 12 μg.</li>
		<li>Descongele el PEI en RT y agréguelo a la solución siguiendo una proporción de 3 μL de PEI por 1 μg de ADN. Homogeneizar la solución mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Luego incubarlo durante 15 min en RT para permitir la formación de complejos ADN-PEI. NOTA: La proporción óptima de volumen de PEI por cantidad de ADN difiere según la línea celular seleccionada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Agregue el volumen total de complejos de ADN-PEI a cada plato que contenga el cultivo celular y mézclelo suavemente balanceando la placa hacia adelante y hacia atrás. Incubar las células a 37 °C en una incubadora de cultivo celular humidificado al 5% de CO2.</li>
	<li>Reemplace el medio de crecimiento después de 5 h, ya que la exposición prolongada a PEI puede ser tóxica para las células HEK293T. Incubar las células a 37 °C en una incubadora de cultivo celular humidificado al 5% de CO2 durante 36 h.</li>
</ol>3. Lisis celular e inmunoprecipitación
<ol><li>Después del período de incubación y 6 h antes de la lisis celular, tratar las células transfectadas con 10 μM del inhibidor del proteasoma MG-132. Una vez más, incubar las células a 37 °C en una incubadora de cultivo celular humidificado al 5% de CO2.</li>
	<li>Aspirar el medio de cada plato de cultivo utilizando una pipeta serológica y lavarlo una vez con 1 mL de 1x PBS. Separe las células añadiendo 1 ml de tripsina e incubando el plato a 37 °C durante 5 min. Resuspend las células en 1 mL de medios de crecimiento.</li>
	<li>Transfiera la suspensión celular a un tubo fresco y limpio de 15 ml y centrífuga a 500 x g durante 5 minutos a RT.</li>
	<li>Retire el sobrenadante vertiéndolo con cuidado. Resuspender suavemente el pellet celular en 200 μL de tampón de lisis NP-40 helado (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 225 mM KCl y 1% NP-40), complementado con el cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa (10 mM NaF y 1 mM Na3VO4), y transferir la solución a un microtubo limpio de 1.5 mL.</li>
	<li>Incubar el lisado celular durante 30 min sobre hielo. Después de la incubación, centrifugar los lisados celulares a 16.900 x g durante 20 min a 4 °C.</li>
	<li>Mientras tanto, equilibre las perlas de agarosa-anti-HA con un tampón de lisis NP-40 helado. Utilice 15 μL de perlas de agarosa-anti-HA para cada muestra. Lavar las perlas con 200 μL de tampón de lisis NP-40 pulsiéndolo en un tubo de microcentrífuga a 3.000 x g durante 1 min a 4 °C. Con una pipeta, aspira y desecha el sobrenadante con mucho cuidado; repita este proceso tres veces. Después, mantenga las cuentas equilibradas en hielo hasta su uso.</li>
	<li>Después de centrifugar los lisados celulares, recupere el sobrenadante. Cuantificar el contenido de proteínas en el lisado total utilizando el método de Bradford16.</li>
	<li>Asegurar que cada muestra sometida a inmunoprecipitación presente una cantidad igual de proteína. Incubar el volumen necesario de lisado celular con las perlas equilibradas de agarosa-anti-HA durante 4 h, girando suavemente en una incubadora giratoria a 4 °C, lo que permite que el UXT-V2-HA se una a las perlas de agarosa-anti-HA.</li>
	<li>Recoge las perlas de agarosa-anti-HA pulsándolas en un tubo de microcentrífuga a 3.000 x g durante 1 min a 4 °C. Aspira con cuidado y desecha el sobrenadante. Lave las perlas tres veces con tampón de lisis de células NP-40 helado y dos veces con tampón FLAG/HA helado (10 mM Hepes pH 7.9, 15 mM MgCl2, 225 mM KCl y 0.1% NP-40).</li>
	<li>Después del lavado final, retire todo el sobrenadante con cuidado con una pipeta y eluya la proteína poliubiquitilada con péptido HA (300 μg / ml) diluido en tampón FLAG / HA. Incubar las perlas de agarosa-anti-HA con péptido HA durante 1 h a 4 °C en una plataforma agitadora de balanceo.</li>
	<li>Girar las perlas a 3.000 x g durante 2 min a 4 °C y pipetear cuidadosamente el sobrenadante que contiene las proteínas poliubiquitinadas. Si es necesario, guarde el eluido en un microtubo fresco y limpio a -20 °C.</li>
	<li>Resolver los eluidos y los lisados celulares en SDS-PAGE al 10% (electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida)17 e inmunoblotting.</li>
	<li>En este estudio, se realizó una transferencia húmeda wb. Para este tipo de transferencia, coloque el gel en un sándwich de transferencia compuesto de papel de filtro-gel-membrana-papel de filtro, acolcharlo con almohadillas y presionarlo junto con una rejilla de soporte. Coloque este sistema verticalmente en un tanque lleno de tampón de transferencia y entre electrodos de alambre de acero inoxidable / platino. La transferencia ocurre durante 90 min a 150 V en tampón de transferencia húmeda (glicina 192 mM, tris-base 25 mM, 0.025% SDS, 20% metanol). NOTA: Dado que los extractos celulares fueron cuantificados (paso 3.7), ejecute un SDS-PAGE con una cantidad igual de proteína para cada muestra. Además, para resolver el eluido, ejecute volúmenes iguales de cada muestra.</li>
	<li>Sondear la membrana de immunoblot utilizando anticuerpos seleccionados 11. Asegúrese de que se detecta una señal de frotis en el eluido del sustrato poliubiquitilado extraído en el proceso IP mediante el uso de anticuerpos anti-myc en las muestras que contienen la ligasa E3 de tipo salvaje, el sustrato y myc-ub. En el lisado celular (entrada), asegúrese de que se detecte la señal del sustrato elegido, la proteína Fbxo7, las proteínas ubiquitiladas y una proteína de limpieza (por ejemplo, GAPDH y β-actina) para garantizar la misma cantidad de proteínas en cada carril. NOTA: La dilución de cada anticuerpo utilizado se preparó de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
</ol>

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<li>Callis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitination+machinery+of+the+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">The ubiquitination machinery of the ubiquitin system.</a> The Arabidopsis Book. 12, 0174(2014).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no hay conflicto de intereses.

La ubiquitilación es una modificación post-traduccional esencial que regula los niveles de varias proteínas y desempeña un papel crucial en muchas vías de señalización y procesos biológicos, asegurando un entorno intracelular saludable. El sistema ubiquitina-proteasoma (SAI) es uno de los principales focos de la investigación farmacéutica reciente, proporcionando la posibilidad de estabilizar supresores tumorales o inducir la degradación de productos oncogénicos22. Por ejemplo, la proliferación ab...

Las modificaciones post-traduccionales (PTM) son un mecanismo importante con respecto a la regulación de proteínas, que es esencial para la homeostasis celular. La ubiquitilación de proteínas es una modificación dinámica e intrincada que crea una variedad de señales diferentes que resultan en varios resultados celulares en organismos eucariotas. La ubiquitilación es un proceso reversible que consiste en la unión de una proteína de ubiquitina que contiene 76 aminoácidos al sustrato, que se produce en una cascada enzimática compuesta por tres reacciones distintas1. El primer paso se caracteriza por la activación de la ubiquitina, que depende de una hidrólisis de ATP para formar una ubiquitina ligada al tioéster de alta energía entre la ubiquitina C-terminal y el residuo de cisteína presente en el sitio activo de la enzima E1. Posteriormente, la ubiquitina se transfiere a la enzima E2 formando un complejo similar al tioéster con la ubiquitina. Después, la ubiquitina se une covalentemente al sustrato por la E2, o más a menudo, por la enzima E3, que reconoce e interactúa con el sustrato 2,3. Ocasionalmente, las enzimas E4 (factores de elongación de la cadena de ubiquitina) son necesarias para promover el ensamblaje de la cadena de multiubiquitina3.
La ubiquitina tiene siete residuos de lisina (K6, K11, K27, K29, K33, K48 y K63), lo que permite la formación de cadenas de poliubiquitina que generan enlaces distintos para producir diferentes estructuras tridimensionales que van a ser reconocidas por varias proteínas efectoras 4,5. Por lo tanto, el tipo de cadena de poliubiquitina introducida en el sustrato es esencial para decidir su destino celular 6,7,8. Además, el sustrato también podría ser ubiquitinado a través de sus residuos N-terminales llamados N-degrons. Las ubiquitinas-ligasas específicas E3 son responsables del reconocimiento de N-degron, lo que permite la poliubiquitilación del residuo de lisina cercano9.
Hoy en día, hay más de 40 sustratos diferentes específicos de SCF caracterizados. Entre ellos, se pueden encontrar reguladores clave de varias vías biológicas, incluida la diferenciación y el desarrollo celular, así como la supervivencia y la muerte celular, 10,11,12,13. Por lo tanto, la identificación de sustratos específicos de cada ubiquitina-ligasa E3 es esencial para diseñar un mapa completo de diversos eventos biológicos. A pesar de que la identificación de sustratos verdaderos es bioquímicamente desafiante, el uso de métodos basados en la bioquímica es muy adecuado para evaluar la especificidad de la cadena y la distinción entre mono y poliubiquitilación14. Este estudio describe un protocolo completo para el ensayo de ubiquitilación utilizando la línea celular de mamíferos HEK293T que sobreexpresa el sustrato UXT-V2 (isoforma 2 de chaperona similar a la prefoldina expresada ubicuamente) con el complejo E3 ubiquitina-ligasa SCF (Fbxo7). UXT-V2 es un cofactor esencial para la señalización de NF-κB, y una vez que esta proteína es derribada en las células, inhibe la activación de NF-κB inducida por TNF-α11. Así, para detectar UXT-V2 poliubiquitilado, se utiliza el inhibidor del proteasoma MG132 ya que tiene la capacidad de bloquear la actividad proteolítica de la subunidad 26S del complejo proteasoma15. Además, el extracto celular se somete a una IP a pequeña escala para purificar el sustrato, utilizando un anticuerpo específico inmovilizado a resina de agarosa para su posterior detección por WB utilizando anticuerpos seleccionados. Este protocolo es muy útil para validar la ubiquitilación del sustrato en el entorno celular, y también se puede adaptar para diferentes tipos de células de mamíferos y otros complejos de ubiquitina-ligasa E3. Sin embargo, es necesario validar el sustrato probado a través de un ensayo de ubiquitilación in vitro también, ya que ambos protocolos se complementan entre sí en cuanto a la identificación de sustratos verdaderos.

<table><tbody><tr><td>Microtubo de 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>PMI110-06A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Placa de cultivo tratada con TC de 100 mm</td><td>Tubo de</td> 430167 <td></td></tr><tr><td>Corning de 15 ml</td><td>Placa</td><td></td> de 430766 <td></td></tr><tr><td>de 96 pocillos</td><td>Cralplast</td><td>655111</td><td></td></tr><tr><td>Agarose-anti-HA Perlas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6779</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti ratón</td><td>Seracare</td><td>5220-0341</td><td>Cabra anti-Ratón IgG</td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti Conejo</td><td>Seracare</td><td>5220-0337</td> Cabra <td>anti-Conejo Anti-Tigre</td></tr><tr><td>Anti-Actina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3853</td><td>Dilución utilizada: 1:2000</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Fbxo7</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB1407251</td><td>Dilución utilizada: 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-HA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3663</td><td>Dilución utilizada: 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Myc</td><td>Señalización celular</td><td>2272</td><td>Dilución utilizada: 1:1000</td></tr><tr><td>Reactivo Bradford</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916-500ML</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-100G</td><td>Albúmina de suero bovino</td></tr><tr><td>Incubadora de células</td><td>Nuaire</td><td>NU-4850</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>500 x g durante 5 min</td></tr><tr><td>ChemiDoc</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH digital</td><td>Kasvi</td><td>K39-2014B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio</td><td>Corning</td><td>10-017-CRV</td><td>Alta glucosa</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>F4135</td><td>Filtrado uso previo</td></tr><tr><td>Péptido HA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2149</td><td></td></tr><tr><td>células HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR Life Science</td><td>0365-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kline rotador</td><td>Global Trade Technology</td><td>GT-2OIBD</td><td></td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Boston Biochem</td><td>I-130</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5418R</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4 (Ortovanadato)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrana secante de nitrocelulosa</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td>10600016</tr><tr><td>NP40 (IGEPAL CA-630)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio óptico</td><td>OPTIKA microscopios</td><td>SN510768</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3</td><td>Invitrogen</td><td>V79020</td><td>Para la expresión de mamíferos</td></tr><tr><td>pcDNA3-2xFlag-Fbxo7</td><td>&nbsp; Amablemente donado por el Dr. Marcelo Dam; rio</td><td></td><td>Tag 2xFlag (N-terminal). Enzimas de restricción: EcoRI y XhoI</td></tr><tr><td>pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-&Delta; Caja F</td><td>&nbsp; Amablemente donado por el Dr. Marcelo Dam; rio</td><td></td><td>Tag 2xFlag (N-terminal). Enzimas de restricción: EcoRI y XhoI. &Delta; 335-367</td></tr><tr><td>pcDNA3-UXTV2-HA</td><td>&nbsp; Amablemente donado por el Dr. Marcelo Dam; rio</td><td></td><td>Tag HA (C-terminal). Enzimas de restricción: EcoRI y XhoI</td></tr><tr><td>pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin</td><td>&nbsp; Amablemente donado por el Dr. Marcelo Dam; rio</td><td></td><td>Tag 6x-his-myc (N-terminal). Enzimas de restricción: EcoRI y KpnI</td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamina 100x</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato 10x</td><td>AccuGENE</td><td>51226</td><td>Para obtener un PBS 1x, diluya el PBS 10x en agua ultrapura</td></tr><tr><td>Polietilenimina (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>VWR Life Science</td><td>0860-50G</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de la proteasa SIGMAFAST</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Agitador Mecedora</td><td>Kasvi</td><td>19010005</td><td></td></tr><tr><td>Sistema SDS-PAGE</td><td>BioRad</td><td>165-8004</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de soluciones</td><td>Phoenix Luferco</td><td>AP-22</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (TrypLe Express)</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de luminol Western Blotting</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2048</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de la ubiquitilación del sustrato por e3 ubiquitina-ligasa en lisados de células de mamíferos

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

La ubiquitilación es una modificación post-traduccional que ocurre en las células eucariotas que es crítica para la regulación de varias vías biológicas, incluida la supervivencia, proliferación y diferenciación celular. Es un proceso reversible que consiste en una unión covalente de ubiquitina al sustrato a través de una reacción en cascada de al menos tres enzimas diferentes, compuestas de E1 (enzima de activación de ubiquitina), E2 (enzima conjugante de ubiquitina) y E3 (enzima ubiquitina-ligasa). El complejo E3 juega un papel importante en el reconocimiento y ubiquitilación del sustrato. Aquí, se describe un protocolo para evaluar la ubiquitilación del sustrato en células de mamíferos utilizando la coinfección transitoria de un plásmido que codifica el sustrato seleccionado, una ubiquitina ligasa E3 y una ubiquitina etiquetada. Antes de la lisis, las células transfectadas se tratan con el inhibidor del proteasoma MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) para evitar la degradación proteasómica del sustrato. Además, el extracto celular se somete a inmunoprecipitación a pequeña escala (IP) para purificar el sustrato poliubiquitilado para su posterior detección por western blotting (WB) utilizando anticuerpos específicos para la etiqueta de ubiquitina. Por lo tanto, se describe un protocolo consistente y sin complicaciones para el ensayo de ubiquitilación en células de mamíferos para ayudar a los científicos a abordar la ubiquitilación de sustratos específicos y las ligasas de ubiquitina E3.

UXT (transcripción expresada ubicuamente) es una proteína similar a la prefoldina que forma complejos de plegamiento de proteínas expresados ubicuamente en tejidos de ratones y humanos como el corazón, el cerebro, el músculo esquelético, la placenta, el páncreas, el riñón y el hígado18. Se han descrito dos isoformas de empalme de UXT, que se denominan UXT-V1 y UXT-V2, que realizan funciones distintas y ubicaciones subcelulares. UXT-V1 se localiza predominantemente en el citoplasma y en el interior...

Proporcionamos un protocolo detallado para un ensayo de ubiquitilación de un sustrato específico y una ubiquitina ligasa E3 en células de mamíferos. Se utilizaron líneas celulares HEK293T para la sobreexpresión de proteínas, el sustrato poliubiquitilado se purificó a partir de lisados celulares por inmunoprecipitación y se resolvió en SDS-PAGE. Se utilizó immunoblotting para visualizar esta modificación post-traduccional.

Evaluación de la ubiquitilación del sustrato por E3 Ubiquitina-ligasa en lisados de células de mamíferos

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

Este protocolo permite evaluar la ubiquitilación de un sustrato específico por una ligasa E3. Sabemos que la caracterización de la interacción ligasa-sustrato es crucial para comprender su función en las células. Esta técnica no requiere reactivos costosos o equipos sofisticados.Necesita plásmidos y codificar los genes de interés, desarrollando un ensayo de inmunoprecipitación con lisados celulares, y un Western blot para detectar la ubiquitilación del sustrato. Varias enfermedades humanas como el cáncer y los trastornos neurológicos están asociadas con la desregulación de la ligasa E3. Por lo tanto, la identificación de la ubiquitilación del sustrato por ligasa E3 específica podría ayudar a tratar o diagnosticar esas enfermedades.La demostración del procedimiento será realizada por Valentine Spagnol. Para comenzar, cultive la línea celular HEK293T a 80 a 90% de confluencia en el medio Eagles modificado de Dulbecco suplementado con 10% de suero bovino fetal y 100 unidades de penicilina, 100 microgramos de estreptomicina y 0.292 miligramos por mililitros de L-glutamina. Luego, incuba este cultivo a 37 grados Centígrados en una incubadora de cultivo celular humidificado al 5% de dióxido de carbono.Pase las células aspirando los medios de la placa de cultivo utilizando una pipeta serológica y lávelas una vez con un mililitro de PBS 1X esterilizado. A continuación, separe las células agregando un mililitro de solución de ácido tripsina etilendiaminotetraacético y después de cinco minutos de incubación a 37 grados centígrados, resuspenda estas células en dos mililitros de medios de crecimiento utilizando una pipeta serológica. Transfiera la suspensión celular a un tubo fresco y limpio de 15 mililitros y centrífuga a 500 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente.Luego, retire suavemente el sobrenadante y resuspenda el gránulo celular en tres mililitros de medios de crecimiento mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo para obtener una suspensión celular homogénea. Luego, transfiera un mililitro de esta suspensión celular a una placa de cultivo tratada con TC de 100 milímetros que contenga nueve mililitros de medios de crecimiento. Antes de la transfección, certifique si las células están libres de contaminación y en una confluencia adecuada para las transfecciones transitorias.Para cada muestra de transfección, prepare los complejos ADN-polietilenimina diluyendo tres microgramos de cada plásmido en 100 microlitros de medio sérico reducido Opti-MEM 1 sin suplementación y mezclándolo suavemente canalizando la solución hacia arriba y hacia abajo. A continuación, descongele el ADN-polietileneimino a temperatura ambiente y agréguelo a la solución siguiendo una proporción de tres microlitros de ADN-polietileneimina por un microgramo de ADN. Homogeneizar la solución mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo.Luego, incubarlo durante 15 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación de complejos de ADN-polietileneimina. Agregue el volumen total de complejos de ADN-polietileneimina a cada plato que contenga el cultivo celular y mézclelo suavemente balanceando la placa hacia adelante y hacia atrás. Luego, incuba estas células a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo celular humidificado.Después de la incubación y seis horas antes de la lisis celular, tratar las células transfectadas con el inhibidor del proteasoma 10 micromolar MG132 e incubar las células en la incubadora de cultivo celular humidificado. A continuación, aspire los medios de cada plato de cultivo con una pipeta serológica y lave las células una vez con un mililitro de 1X PBS. Luego, separe las células agregando un mililitro de tripsina e incube el plato a 37 grados centígrados durante cinco minutos.Resuspender las células en un mililitro de medios de crecimiento y transferir la suspensión celular a un microtubo fresco y limpio de dos mililitros y centrifugarla a 500 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Una vez que termine la centrifugación, retire el sobrenadante vertiéndolo con cuidado y resuspenda suavemente el gránulo celular en 200 microlitros de tampón de lisis MP40 helado complementado con el cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa. Luego transfiera esta solución a un microtubo limpio de 1.5 mililitros.Incubar esta célula lisar durante 30 minutos en hielo, y después de la incubación, centrifugar la célula lisa a 16, 900 veces G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Mientras tanto, equilibre las perlas anti-HA de agarosa con un tampón de lisis MP40 helado. Utilice 15 microlitros de perlas anti-HA de agarosa para cada muestra.Lave las perlas con 200 microlitros de tampón de lisis MP40 pulsándolas en un tubo de microcentrífuga a 3.000 veces G durante un minuto a cuatro grados centígrados. A continuación, aspire y deseche el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta y repita este proceso tres veces. Después, mantenga las cuentas equilibradas en hielo hasta su uso.Después de centrifugar los lisados celulares, recuperar el sobrenadante y cuantificar el contenido de proteína en el lisado total utilizando el método bradford para asegurar que cada muestra sometida a inmunoprecipitación presenta una cantidad igual de proteína. Incubar el volumen necesario de lisado celular con las perlas anti-HA de agarosa equilibradas durante cuatro horas, girando suavemente en una incubadora giratoria a cuatro grados centígrados, lo que permite que el UXT-V2-HA se una a las perlas anti-HA de agarosa. Recoja las perlas anti-HA de agarosa pulsándolas en un tubo de microcentrífuga a 3.000 veces G durante un minuto a cuatro grados centígrados.Aspira con cuidado y desecha el sobrenadante. Lave las perlas tres veces con tampón de lisis de celda MP40 helado y dos veces con tampón FLAG HA helado. Después del lavado final, retire todo el sobrenadante con cuidado con una pipeta y eluya la proteína poliubiquitilada con 300 microgramos por mililitro de péptido HA diluido en tampón FLAG HA.Incubar las perlas anti-HA de agarosa con péptido HA durante una hora a cuatro grados centígrados en una plataforma agitadora oscilante. A continuación, gire las perlas a 3, 000 veces G durante dos minutos a cuatro grados Celsius y retire cuidadosamente el sobrenadante que contiene las proteínas poli-ubiquitinadas. Si es necesario, guarde el eluyente en un microtubo fresco y limpio a menos 20 grados centígrados.Resuelva los eluyentes y los lisados celulares en electroforesis e inmunoblotting en gel de dodecil sulfato de sodio al 10%. Para realizar un Western blotting de transferencia húmeda, coloque el gel en un sándwich de transferencia compuesto de papel de filtro, papel de filtro de membrana de gel, acolcharlo con almohadillas y presionarlo junto con una rejilla de soporte. Luego, coloque este sistema verticalmente en un tanque lleno de tampón de transferencia entre los electrodos de alambre de acero inoxidable o platino.La transferencia ocurre durante 90 minutos a 150 voltios en un búfer de transferencia húmedo. Finalmente, sondee la membrana de immunoblot usando anticuerpos anti-myc. La poli-ubiquitilación específica de UXT-V2-HA mediada por la proteína F-box 7 en las células se observó después de sondear el eluyente de la inmunoprecipitación anti-HA con un anticuerpo anti-myc, que detecta el myc-ub conjugado al sustrato.La especificidad de anti-myc para sustrato poli-ubiquitilado se visualizó en los carriles uno y dos, en los que no se detectó un frotis de proteínas poli-ubiquitiladas cuando las células fueron co-transfectadas con la proteína F-box 7 y myc-ub en ausencia de plásmido UXT-V2-HA. Además, no se visualizó ningún frotis correspondiente a la poli-ubiquitinación proteica en la combinación de la proteína F-box 7 y UXT-V2-HA sin el plásmido myc-ub. Cuando un mutante de la proteína F-box 7 o de la proteína F-box 7 de tipo F de vector vacío incapaz de ensamblar SCF activo fue transectado en combinación con UXT-V2-HA y myc-ub, se observó una fuerte señal de frotis de UXT-V2 poli-ubiquitilado solo para la proteína F-box 7 de tipo salvaje, lo que sugiere que UXT-V2 fue poli-ubiquitilado por el complejo y las células de la proteína F-box de SCF en comparación con los controles.Las etapas de monoprecipitación, incluida la incubación de lisados celulares con las perlas equilibradas y la elución de proteínas inmunoprecipitadas, son esenciales para lograr el objetivo de este protocolo. Después de este procedimiento, se debe realizar un ensayo de ubiquitilación in vitro para confirmar la especificidad de la ubiquitilación del sustrato por la ligasa E3.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Ubiquitinación es una modificación postraduccional clave llevadas a cabo por un conjunto de tres enzimas. Las mutaciones de los genes implicados en esta modificación se asocian con muchas enfermedades humanas diferentes. Aquí se describen los protocolos para detectar la ubiquitinación de proteínas en las células...

La detección de ubiquitinación de proteínas

Este video demuestra el método in vitro para la SUMOilación de proteínas de sustrato utilizando una cascada de enzimas secuencial. Además, el estado SUMOilado de la proteína se identifica mediante la técnica de electroforesis e inmunotransferencia.

Ensayo de SUMOilación: una técnica in vitro para detectar el estado de SUMOilación de proteínas sustrato mediante inmunotransferencia

A diferencia de ligasas de ubiquitina ligasas E3 SUMO algunos han sido identificados. Este modificado en vitro protocolo de sumoilación es capaz de identificar nuevos SUMO E3 ligasas por un ensayo de reconstitución en vitro .

In Vitro Ensayo de la sumoilación estudiar SUMO E3 ligasa actividad

Presentamos un método para la purificación, detección e identificación de péptidos digliquenados que se originan a partir de proteínas ubiquitinadas a partir de muestras biológicas complejas. El método presentado es reproducible, robusto y supera a los métodos publicados con respecto al nivel de profundidad del análisis ubiquitinome.

Detección de sitios de ubiquitinación de proteínas por enriquecimiento de péptidos y espectrometría de masas

La ubiquitinación es una modificación post-traduccional que desempeña un papel importante en los procesos celulares y está estrechamente coordinada por la desubiquitinación. Los defectos en ambas reacciones subyacen a patologías humanas. Proporcionamos protocolos para la realización de la ubiquitinación y la reacción de desubiquitinación in vitro utilizando componentes purificados.

Ensayos in Vitro Ubiquitination y Deubiquitination de histonas nucleosomales

Este protocolo tiene como objetivo establecer proteomes específicos de ubiquitina (Ub) y ubiquitinas (Ubls) con el fin de identificar alteraciones de este tipo de modificaciones post-traduccionales (PtM), asociadas a una condición específica como un tratamiento o un fenotipo.

Perfilado de Ubiquitina y Ubiquitina-como Modificaciones Post-traduccionales dependientes e Identificación de Alteraciones Significativas

El objetivo de este manuscrito es presentar un esquema para los estudios bioquímicos y funcionales completos de las ligasinas de ubiquitina tipo RING E3. Esta canalización de varios pasos, con protocolos detallados, valida una actividad enzimática de la proteína probada y demuestra cómo vincular la actividad a la función.

Caracterización funcional de las ligasinas de ubiquitina RING-Tipo E3 In Vitro y In Planta

Este método describe la evaluación de los cambios globales en la topología de la cadena de ubiquitina. La evaluación se realiza mediante la aplicación de un enfoque proteómico específico basado en espectrometría de masas.

Análisis de la cadena de ubiquitina por monitoreo paralelo de reacciones

El presente estudio proporciona protocolos detallados de ensayo de ubiquitilación in vitro para el análisis de la actividad catalítica de la ubiquitina ligasa E3. Las proteínas recombinantes se expresaron utilizando sistemas procariotas como el cultivo de Escherichia coli.

In vitro Análisis de la función E3 Ubiquitina Ligasa

La ubiquitinación es un regulador crítico de las funciones intracelulares de las proteínas. Aquí describimos dos métodos de lisis celular para detectar los niveles de ubiquitinación de proteínas del sustrato en células de mamíferos y comparamos su eficacia para analizar los niveles de ubiquitinación. La sobreexpresión de proteínas en HEK293T células fue inducida por transfección transitoria, y proteínas ubiquitinadas fueron detectadas mediante análisis de western blot.

Estrategias comparativas para la detección de ubiquitinación en lisados celulares de mamíferos utilizando SMAD2/SMURF2 como modelo

Este protocolo describe un método para ubiquitinar Streptococcus pneumoniae utilizando lisado celular de mamífero o complejo enzimático puro de ubiquitina puro, seguido de un tratamiento con complejo proteico purificado VCP/p97-UFD1-NPLOC4 para evaluar su actividad bacteriolítica, permitiendo el estudio de efectores inmunitarios dependientes de ubiquitina.

In vitro Reconstitución de la ubiquitinación bacteriana y eliminación mediada por VCP/p97

Aprende a evaluar la ubiquitilación de sustratos por E3 ligasa en células HEK293T mediante inmunoprecipitación e inmunotransferencia. Este método accesible facilita el estudio de interacciones ligasa-sustrato en enfermedades como cáncer y trastornos neurológicos.

Evaluación de la ubiquitilación del sustrato por E3 Ubiquitina-ligasa en lisados de células de mamíferos

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