Evaluación de un biomarcador fiable en un modelo de sepsis de sepsis inducida por punción cecal y ligadura cecal
9 de diciembre de 2022
Este protocolo presenta los detalles operatorios de la ligadura y punción cecal (CLP) en un modelo de sepsis en ratones. CLP es una de las técnicas más utilizadas para crear un modelo animal de sepsis. Por lo tanto, se requiere un protocolo CLP estandarizado para el logro de resultados de investigación confiables.
El objetivo principal de este estudio es utilizar un modelo de ratón de ligadura cecal y sepsis inducida por punción para evaluar el biomarcador sanguíneo confiable de sepsis. La ligadura y punción cecal, o CLP en resumen, es un modelo clínicamente relevante de sepsis. CLP es un modelo comúnmente utilizado en la investigación de la sepsis.
La histona citrulinada H3, o CitH3, se origina a partir de la NETosis inducida por sepsis. Nuestro estudio anterior demuestra que CitH3 es un biomarcador diagnóstico confiable de sepsis. Seleccione ratones machos C57BL/6.
Pesar el ratón y anestesiar al ratón por inhalación de isoflurano al 1,5%. Fije el ratón en una almohadilla térmica. Aplique crema depilatoria en el abdomen y déjela por no más de un minuto antes de eliminar la crema y el vello.
Preparar instrumentos quirúrgicos estériles adecuados para la cirugía de animales roedores. Desinfecte la piel abdominal con yodo al menos tres veces. Cubra el área quirúrgica quirúrgica con la cortina quirúrgica estéril adecuada.
Use tijeras quirúrgicas estériles para hacer una incisión de aproximadamente dos centímetros en la pared abdominal, a lo largo de la línea alba. Identificar y aislar el ciego fuera de la cavidad peritoneal con pinzas estériles. Ligate 75 volumen del ciego con sutura de seda 4-0.
No ligar los vasos sanguíneos mesentéricos. Cabe señalar que un porcentaje diferente de ciego ligado determina la gravedad de la sepsis. El 25% conduce a una sepsis de bajo grado, el 50% conduce a la sepsis de grado medio y el 75% conduce a una sepsis de alto grado.
Perforar el ciego mediante una perforación completa con una aguja de calibre 21 en el punto medio entre el extremo de la cola y la ligadura. Exprima suavemente las heces del ciego a través de agujeros de penetración. Cabe señalar que la cantidad de heces comprimidas en la cavidad peritoneal debe ser consistente, ya que las heces también determinan la gravedad de la sepsis.
Reemplace el ciego y las heces en la cavidad abdominal suavemente. Cierre la capa muscular abdominal y la capa de piel con sutura de seda 6-0. Desinfecte la incisión con yodo.
La inyección de ketoprofeno, cinco miligramos por kilogramo, debe realizarse en el cuadrante inferior izquierdo del abdomen para evitar el ciego. Coloque el mouse en una almohadilla térmica hasta la recuperación completa. El ratón está alojado en una habitación con temperatura controlada y se le da acceso gratuito a alimentos y agua.
Los animales serán sacrificados por sobredosis de dióxido de carbono con síntomas de sepsis, relevantes para nuestros puntos finales predefinidos basados en nuestro estudio presentado. Los ratones se dividen aleatoriamente en el grupo simulado, el grupo CLP y el grupo de tratamiento CLP más Cl-amidina o YW3-56. Los ratones en el grupo simulado reciben todos los procedimientos de CLP excepto la ligadura de ciego y la punción.
Recolectar sangre periférica a las 24 horas postoperatorias y preparar el suero mediante centrifugación. La concentración de CitH3 se determinó mediante Western blot y un kit ELISA de desarrollo propio. Como se muestra en la figura dos, no se detectó CitH3 en el grupo simulado.
Los niveles de CitH3 se elevaron después del inserto de CLP, que se atenuó significativamente por la inhibición de la EAP. Basándonos en nuestros datos, concluimos que la CitH3 circulante es un biomarcador diagnóstico confiable de sepsis.
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Descripción general
Este protocolo presenta los detalles operatorios de la ligadura y punción cecal (CLP) en un modelo murino de sepsis. CLP es una de las técnicas más ampliamente utilizadas para crear un modelo animal de sepsis, lo que requiere un protocolo estandarizado para obtener resultados de investigación confiables.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Investigación sobre sepsis
Antecedentes
- La ligadura y punción cecal (CLP) es un modelo clínicamente relevante de sepsis.
- La CLP se utiliza comúnmente en la investigación de la sepsis.
- Los biomarcadores confiables son esenciales para diagnosticar la sepsis.
- La histona H3 citrulinada (CitH3) está asociada con la NETosis inducida por sepsis.
Objetivo del estudio
- Evaluar biomarcadores sanguíneos confiables de la sepsis utilizando un modelo murino.
- Establecer un protocolo estandarizado de CLP para garantizar la consistencia en la investigación.
- Investigar el potencial diagnóstico de CitH3 en la sepsis.
Métodos Utilizados
- Selección de ratones macho C57BL/6 para el estudio.
- Inducción de sepsis mediante ligadura y punción cecal.
- Evaluación de biomarcadores en sangre tras la inducción.
- Comparación de los niveles de CitH3 para evaluar la fiabilidad diagnóstica.
Resultados principales
- Demostración de CitH3 como un biomarcador diagnóstico confiable.
- Protocolo CLP estandarizado que produce resultados consistentes.
- Identificación de la NETosis inducida por sepsis en el modelo.
- Validación del modelo murino para investigaciones futuras sobre sepsis.
Conclusiones
- El modelo CLP es efectivo para estudiar la sepsis.
- La CitH3 sirve como un biomarcador prometedor para el diagnóstico de la sepsis.
- Los protocolos estandarizados mejoran la fiabilidad de la investigación.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los biomarcadores tempranos fiables son fundamentales para reducir los riesgos en el descubrimiento de fármacos contra la sepsis y permitir la continuidad traslacional desde modelos preclínicos hasta la investigación clínica. El modelo de ratón inducido por CLP, combinado con la medición cuantitativa de CitH3, proporciona una plataforma estandarizada para la validación de dianas y el análisis mecanicista en la sepsis. Este enfoque respalda la confianza predictiva y la selección de carteras en puntos críticos de inflexión dentro del proceso de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite pruebas rigurosas de hipótesis sobre la fisiopatología de la sepsis utilizando un modelo animal clínicamente relevante.
- Apoya la validación funcional de dianas al cuantificar CitH3 como un biomarcador mecanicista de la NETosis.
- Facilita la reducción de riesgos biológicos y la priorización de dianas candidatas para su posterior desarrollo.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Proporciona un sistema reproducible para evaluar terapéuticos candidatos que actúan sobre los mecanismos de la sepsis.
- Normaliza la cuantificación de biomarcadores mediante ensayos validados de ELISA y de inmunotransferencia western para CitH3.
- Permite comparar de forma confiable los efectos de las intervenciones entre grupos experimentales.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Alinea los resultados de biomarcadores preclínicos con las necesidades diagnósticas clínicas para la sepsis.
- Apoya la continuidad desde los hallazgos en modelos animales hasta las estrategias de biomarcadores traslacionales en humanos.
- Reduce el riesgo traslacional mediante el establecimiento de puntos finales sólidos y relevantes para la enfermedad.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este modelo y la metodología del biomarcador conectan el descubrimiento inicial, la identificación de compuestos prometedores y la validación preclínica en la investigación de la sepsis.
- Biología del Descubrimiento: Permite la comprobación de hipótesis mecanicistas y la aclaración de vías en la NETosis inducida por sepsis.
- Tamizaje: Proporciona lecturas cuantitativas de H3Cit para el desarrollo estandarizado de ensayos y la evaluación de compuestos.
- Análisis: Ofrece mediciones reproductibles de biomarcadores para comparar la eficacia de intervenciones y la gravedad de la enfermedad.
- Investigación Traducional: Facilita la alineación de datos preclínicos de biomarcadores con estrategias diagnósticas clínicas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma estandarizada y reutilizable para la investigación continua sobre sepsis y la evaluación de terapias.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas en la sepsis.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización entre equipos de investigación y estudios.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción de proyectos y la eficiencia del capital al permitir una triage temprana guiada por biomarcadores.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de programas contra la sepsis.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía animal, desarrollo de ensayos de biomarcadores y análisis cuantitativo.
- Necesita acceso a kits de ELISA validados, infraestructura para inmunotransferencia (western blotting) y instalaciones estandarizadas para animales.
- Exige una rigurosa estandarización entre equipos de trabajo respecto a las variables del procedimiento de CLP y los protocolos de medición de biomarcadores.
- La adaptación a otros modelos de enfermedad o especies puede requerir optimización y validación del protocolo.
- Las limitaciones incluyen la variabilidad del modelo según la técnica quirúrgica y la necesidad de criterios de punto final consistentes.
