Name: Sistema de cultivo tridimensional sin suero para células madre de la glándula lagrimal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Aprende un método de cultivo tridimensional sin suero para células madre de la glándula lagrimal de ratón BALB/c. Esta técnica permite la expansión a largo plazo y diferenciación en células acinares y ductales para regeneración ocular.

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Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 31871413) y dos Programas de Ciencia y Tecnología de Guangdong (2017B020230002 y 2016B030231001). Estamos realmente agradecidos a los investigadores que nos han ayudado durante el estudio y a los miembros del personal que trabajan en el centro de animales por su apoyo en el cuidado de los animales.

<ol><li>Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+injection+of+interleukin-1+induces+reversible+aqueous+tear+deficiency%2C+lacrimal+gland+inflammation%2C+and+acinar+and+ductal+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation.</a> Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).</li>
<li>Gromova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+gland+repair+using+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lacrimal gland repair using progenitor cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).</li>
<li>Buzhor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapy+approaches%3A+the+hope+for+incurable+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases.</a> Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).</li>
<li>Tiwari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+human+lacrimal+gland+cultures+with+secretory+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function.</a> PLoS One. 7 (1), 29458(2012).</li>
<li>You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+propagation+of+mesenchymal+stem+cells+from+the+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).</li>
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<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Lugli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-spondin+1+and+noggin+facilitate+expansion+of+resident+stem+cells+from+non-damaged+gallbladders%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders.</a> EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1), 299-312 (2015).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1), 324-338 (2015).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%2B%28ve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Linnemann, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+regenerative+potential+in+primary+human+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells.</a> Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li>
<li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).</li>
<li>Maimets, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vitro+expansion+of+salivary+gland+stem+cells+driven+by+Wnt+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals.</a> Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).</li>
<li>Xiao, S., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+long-term+serum-free+culture+for+lacrimal+gland+stem+cells+aiming+at+lacrimal+gland+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20(2020).</li>
<li>Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+progenitor+cells+in+uninjured%2C+adult+rat+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).</li>
<li>Mishima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+side+population+cells+restores+the+function+of+damaged+exocrine+glands+through+clusterin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin.</a> Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).</li>
<li>Aluri, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+improves+tear+production+in+a+mouse+model+of+sj%C3%B6gren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren's syndrome.</a> Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).</li>
<li>Dietrich, J., Schrader, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+lacrimal+gland+regeneration%3A+current+concepts+and+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches.</a> Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+growing+organoids+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: growing organoids from stem cells.</a> Cell. 161 (7), 1700(2015).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
<li>Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+matrix+%28BME%29+has+multiple+uses+with+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Existen métodos bien establecidos para el aislamiento y el cultivo in vitro de células madre lagrimales para el cultivo de células madre lagrimales y la reparación de lesiones LG. Shatos et al.17 y Ackermannet al. 6 células madre lagrimales cultivadas y subcultivadas con éxito de ratas y ratones mediante métodos de cultivo 2D, respectivamente, lo que permite trasplantar células madre lagrimales para el tratamiento del TDA. Los estudios sobre células madre<...

Las células madre de la glándula lagrimal (LGSC) mantienen la renovación celular de la glándula lagrimal (LG) y son la fuente de células acinares y ductales. Por lo tanto, el trasplante lgsc se considera un enfoque alternativo para tratar el daño inflamatorio severo y la enfermedad del ojo seco con deficiencia acuosa (AÑAD)1,2,3. Se han aplicado varios métodos de cultivo para enriquecer LGSCs. Tiwari et al. separaron y cultivaron células primarias de LG utilizando colágeno I y gel de matriz complementado con varios factores de crecimiento; sin embargo, las células LG no pudieron ser cultivadas continuamente4. Utilizando cultivo bidimensional (2D), las células madre derivadas de LG de ratón fueron aisladas por You et al.5 y Ackermann et al. 6, se encontró que expresa los genes marcadores de células madre / progenitoras, Oct4, Sox2, Nanog y nestina, y podría ser subcultivado. Sin embargo, no hay indicios claros de que estas células puedan diferenciarse en células acinares o ductales, y no existe un experimento de trasplante para verificar el potencial de diferenciación in vivo.
Recientemente, las células c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1-/CD34-/CD45- se aislaron de LIG de ratón mediante citometría de flujo, se encontró que expresaban marcadores de células progenitoras LG, como Pax6 y Runx1, y se diferenciaron en conductos y acini in vitro. En ratones con ADD, la inyección ortotópica con estas células podría reparar las GL dañadas y restaurar la función secretora de lasGL 2. Sin embargo, el número de células madre aisladas por este método fue pequeño, y no hay condiciones de cultivo adecuadas para expandir las LGSC aisladas. En resumen, es necesario establecer un sistema de cultivo adecuado para aislar y cultivar eficazmente las LGSC adultas con expansión estable y continua para el estudio de las LGSC en el tratamiento de la ADICIÓN.
Los organoides derivados de células madre o células madre pluripotentes son un grupo de células que son histológicamente similares a los órganos relacionados y pueden mantener su propia renovación. Después de que el organoide del intestino de ratón fue cultivado con éxito por Sato et al. en 20097, se cultivaron organoides de otros órganos en sucesión, según el sistema de cultivo de Sato, como la vesícula biliar8, el hígado9, el páncreas10, el estómago11, la mama12, el pulmón13, la próstata14 y la glándula salival15 . Debido a la alta proporción de células madre adultas antes de la diferenciación celular en cultivo organoide, el método de cultivo organoide tridimensional (3D) se considera óptimo para el aislamiento y cultivo de células madre adultas de LG.
En el presente estudio se estableció un sistema de cultivo LGSC de ratón adulto mediante la optimización del método de cultivo 3D, libre de suero. Está comprobado que las LGSC cultivadas tanto en ratones normales como en ratones ADDED mostraron una capacidad estable de autorrenovación y proliferación. Después del trasplante en los GL de ratón ADDED, los LGSC colonizaron los LGs deteriorados y mejoraron la producción de lágrimas. Además, se aislaron LGSC fluorescentes rojos de ratones ROSA26mT/mG y se cultivaron. Este trabajo proporciona una referencia confiable para el enriquecimiento LGSC in vitro y el autoinjerto LGSC en aplicación clínica para la terapia CON ADD.

<table><tbody><tr><td>Animal (Ratón)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bal B/C</td><td>Centro de Investigación de Animales Modelo de la Universidad</td><td></td><td></td>de Nanjing</tr><tr><td>C57 BL/6J</td><td>Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad</td><td></td><td></td>Sun Yat-sen</tr><tr><td>NOD/ShiLtJ</td><td>Centro de Investigación de Animales Modelo de la Universidad</td><td></td><td></td>de Nanjing</tr><tr><td>ROSA26mT/mG</td><td>Centro de Investigación de Animales Modelo de la Universidad</td><td></td><td></td> de Nanjing</tr><tr><td>Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balanza analítica</td> Deshidratador automático <td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr> Cámara de recuento <tr><td>de</td> sangre <td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BLAU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contador de células</td><td>CountStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubadora de temperatura constante</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECL Sistema de imagen en gel</td><td>GE healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baño eléctrico para baño de agua</td><td>Yiheng Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparato de electroforesis</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencia instrumento de PCR cuantitativo</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frozen Tissue Slicer</td><td>Centrífuga horizontal Lecia</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>CENCE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia invertida</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micrografía láser de barrido laminar</td><td>Carl Zeiss Contenedor de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nitrógeno líquido</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baja temperatura alta centrífuga de velocidad</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horno de microondas</td><td>Panasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro ultravioleta Nanodrop</td><td>Medición térmica</td> de <td>la concentración</td><td></td>de ARN</tr><tr><td>Máquina de corte de parafina</td><td>Amplificador Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Comprobador de valores de pH</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; C Refrigerador</td><td>Haier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oscilador termostático de cultivo</td><td>ZHICHENG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrumento de inclusión de parafina tisular</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-80&deg; C Refrigerador de temperatura ultrabaja</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-20&deg; C Refrigerador de temperatura ultrabaja</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de purificación de agua ultrapura</td><td>ELGA</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>u>Reactivo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Animal Experiment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCG</td><td>Sigma</td><td>9002-61-3</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>14158-65-7</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sódico</td><td>Sigma</td><td>57-33-0</td><td></td></tr><tr><td><Cultivo Celular Fuerte></fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa I</td><td>Gibco</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>BD 354235</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D0697</td><td></td></tr><tr><td>DMSO Sigma</td><td></td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500895</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>Gibco</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050087</td><td></td></tr><tr><td>Humano FGF10</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (Gel de matriz)</td><td>BD</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Murine Wnt3A</td><td>PeproTech</td><td>315-20</td><td></td></tr><tr><td>Murine EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>R-espondina 1</td><td>PeproTech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de tripsina (TI)</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td>Derivado de Glycine max; puede inhibir la tripsina, la quimotripsina y la plasminasa en menor medida. Un mg inhibirá 1.0-3.0 mg de tripsina.</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; T4799</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td>HE tinción & Inmunotinción</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 burro anti-ratón IgG Thermo</td><td></td><td>A-21202</td><td>Dilución utilizada: IHC) 2 &mu; g/mL, (IF) 0,2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 burro anti-Conejo IgG Thermo</td><td></td><td>A-21206</td><td>Dilución utilizada: (IHC) 2 &mu; g/mL, (IF) 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 burro anti-ratón IgG Thermo</td><td></td><td>A-10037</td><td>Dilución utilizada: (IHC) 2 &mu; g/mL, (IF) 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 burro anti-Conejo IgG Thermo</td><td></td><td>A-10042</td><td>Dilución utilizada: (IHC) 2 &mu; g/mL, (IF) 4 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-AQP5 contra conejos</td><td>Abcam</td><td>ab104751</td><td>Dilución utilizada: (IHC) 1 &mu; g/mL, (IF) 0,1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-E-cadherina Rata</td><td>Abcam</td><td>ab11512</td><td>Dilución utilizada: (IF)&nbsp; 5 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-Queratina14 anticuerpo de conejo</td><td>Abcam</td><td>ab181595</td><td>Dilución utilizada: (IHC) 1 &mu; g/mL, (IF) 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Ki67 contra conejos</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>Dilución utilizada: (IHC) 1 &mu; g/mL, (IF) 1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-mCherry ratón</td><td>Abcam</td><td>ab125096</td><td>Dilución utilizada: (IHC) 2 &mu; g/mL, (IF) 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-mCherry conejo</td><td>Abcam</td><td>ab167453</td><td>Dilución utilizada: (IF)&nbsp; 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>C6H8O7</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501702-0500</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Sangon Biotech</td><td>201-069-1</td><td></td></tr><tr><td>DAB Kit (20x)</td><td></td><td>CWBIO CW0125</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>BASO</td><td>68115</td><td></td></tr><tr><td>Montaje fluorescente Medio</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501912-0500</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-Ratón Anticuerpo IgG (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>Dilución utilizada: 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anticuerpo IgG anti-Conejo de Cabra (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td>Dilución utilizada: 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>BASO</td><td>517-28-2</td><td></td></tr><tr><td>Histogel (Hidrogel de incrustación)</td><td>Thermo</td><td>HG-400-012</td><td></td></tr><tr><td>30% H2O2</td><td>Guangzhou Química</td><td>KD10</td><td></td></tr><tr><td>30% Solución de peróxido de hidrógeno</td><td>Guangzhou Química</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Guangzhou Química</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Na3C6H5O7.2H2O</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501293-0500</td><td></td></tr><tr><td>Bálsamo neutro</td><td>SHANGHAI YIYANG</td><td>YY-Bálsamo</td><td></td>neutro</tr><tr><td>Suero de cabra no inmunizado</td><td>BOSTER</td><td>AR0009</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Sangon Biotech</td><td>A601891-0500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>DAMAO</td><td>200-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Guangzhou Química</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio tribásico dihidratado</td><td>Sangon Biotech</td><td>200-675-3</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Guangzhou Química</td><td>IB11-AR-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.T.C. Compuesto</td><td>SAKURA</td><td>SAKURA.4583</td><td></td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>DINGGUO</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Guangzhou Química</td><td>128686-03-3</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR & qRT-PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol</td><td>Guangzhou Química</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Guangzhou Química</td><td>865-49-6</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Sangon Biotech</td><td>214-984-6</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico</td><td>Guangzhou Química</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix</td><td>Roche</td><td>488735200H</td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td><td>TOYOBO-Taq</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ADN polimerasa</td><td>TAKARA</td><td>R10T1</td><td></td></tr><tr><td>Goldview (ácido nucleico tinción)</td><td>BioSharp</td><td>BS357A</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Magen</td><td>R4801-02</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Construcción vectorial & Transfección celular</agar fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td>OXID-Ampicilina</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma</td><td>56-75-7</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extracción de plásmidos sin endotoxinas</td><td>Thermo</td><td>A36227</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Lipo3000 Plásmido Kit de transfección</td><td>Thermo</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>LR Kit de reacción</td><td>Thermo</td><td>11791019</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extracción de plásmidos</td><td>TIANGEN</td><td>DP103</td><td></td></tr><tr><td>Trans5&alpha; Célula químicamente competente</td><td>TRANSGEN</td><td>CD201-01</td><td></td></tr><tr><td>Trytone</td><td>OXID-Extracto</td> <td>de</td><td></td></tr> <tr><td>levadura</td><td>OXID</td><td><</td><td></td></tr><tr><td>fuerte>Primers y secuencia</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Imprimación</fuerte>: AQP5 Secuencia: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: &beta;-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCGTGGTTC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTCGTCCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vector</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLX302 lentivirus vector sin carga</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pENRTY-mCherry</td><td>Laboratorio Xiaofeng Qin, Universidad</td><td></td><td></td> Sun Yat-sen</tr></tbody></table>

sistema de cultivo tridimensional sin suero para células madre de la glándula lagrimal

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

La terapia basada en células madre de la glándula lagrimal (LG) es una estrategia prometedora para las enfermedades de la glándula lagrimal. Sin embargo, la falta de un método de cultivo confiable y libre de suero para obtener un número suficiente de células madre LG (LGSC) es un obstáculo para futuras investigaciones y aplicaciones. El método de cultivo tridimensional (3D), libre de suero para LGSC de ratones adultos está bien establecido y se muestra aquí. Las LGSC podrían ser continuamente pasajeras e inducidas a diferenciarse a células acinares o similares a las ductales.
Para el cultivo primario lgsc, los LGs de ratones de 6-8 semanas de edad fueron digeridos con dispasa, colagenasa I y tripsina-EDTA. Un total de 1 × 104 células individuales fueron sembradas en 80 μL de matriz de células madre de células madre de gel-glándula lagrimal (LGSCM) en cada pocillo de una placa de 24 pocillos, precubierta con 20 μL de matriz gel-LGSCM. La mezcla se solidificó después de la incubación durante 20 min a 37 °C, y se agregaron 600 μL de LGSCM.
Para el mantenimiento de LGSC, los LGSC cultivados durante 7 días se desagregaron en células individuales por dispasa y tripsina-EDTA. Las células individuales fueron implantadas y cultivadas de acuerdo con el método utilizado en el cultivo primario LGSC. Las LGSC podrían pasar más de 40 veces y expresar continuamente los marcadores de células madre/progenitoras Krt14, Krt5, P63 y nestina. Las LGSC cultivadas en LGSCM tienen capacidad de autorrenovación y pueden diferenciarse en células acinares o ductales in vitro e in vivo.

Establecer un sistema de cultivo 3D sin suero En este estudio, se desarrolló LGSCM que contiene EGF, Wnt3A, FGF10 e Y-27632 para LGSC de ratón, y los LGSC se aislaron y cultivaron con éxito mediante un método de cultivo 3D (Figura 1A). Un exitoso sistema de cultivo 3D, libre de suero de LGSCs de ratones C57BL / 6, ratones NOD / ShiLtJ, ratones BALB / c y ratones ROSA26mT / mG se ha establecido utilizando este método16. Para un ratón mach...

El método tridimensional de cultivo sin suero para células madre adultas de la glándula lagrimal (LG) está bien establecido para la inducción de la formación y diferenciación de organoides LG en células acinares o similares a las ductales.

Sistema de cultivo tridimensional sin suero para células madre de la glándula lagrimal

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...

Este protocolo proporciona una estrategia ventajosa para enriquecer las células madre de la glándula lagrimal para la regeneración y reconstrucción de la glándula lagrimal. Las células madre de la glándula lagrimal muestran capacidad de expansión a largo plazo y el potencial de diferenciación. La principal ventaja de esta técnica es que el medio de cultivo para las células madre de la glándula lagrimal está libre de suero, lo que muestra el enorme valor para la reparación de la glándula lagrimal Comience por obtener un ratón macho BALB / c de seis a ocho semanas de edad sacrificado y corte la piel detrás de la oreja para exponer la glándula lagrimal y el tejido conectivo que lo rodea.Pelar el tejido conectivo mediante disección roma con la ayuda de pinzas y eliminar la glándula lagrimal. Sumerja las glándulas lagrimales en un plato de seis centímetros con cuatro mililitros de etanol al 75% durante 10 segundos y enjuague inmediatamente con una solución de PBS 10 milimolar dos veces. Cortar las glándulas lagrimales en pequeños fragmentos de aproximadamente un milímetro cúbico.Transfiéralos a un tubo centrífugo estéril de 15 mililitros y trate los tejidos con 500 microlitros de 25 uni

three-dimensional-serum-free-culture-system-for-lacrimal-gland-stem

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Cultivo de células primarias de tejido intacto utilizando organoides proporciona un sistema modelo que imita el microambiente multi-celular in vivo. Desarrollamos un modelo de cultivo libre de suero primaria tejido epitelio de mama que perpetúa los linajes de cultivo de células mixtas y exposiciones morfología diferenciados, sin interrupción tejido enzimática. Organoides mamarios permanecen viables durante&gt; 6 meses.

No enzimática, libre de suero Cultivo de Tejidos de lesiones de mama pre-invasivas para la generación espontánea de mammospheres

La glándula lagrimal (LG) es un órgano de ramificación que produce los componentes acuosos de lágrimas necesarias para el mantenimiento de la visión y la salud ocular. Aquí describimos murino LG disección y ex vivo las técnicas de cultivo de descifrar las vías de señalización implicadas en el desarrollo de LG.

La manipulación de la murino Glándula Lagrimal

Aquí presentamos un protocolo para desarrollar un sistema tridimensional (3-D) de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (HiPSCs) llamado cuerpo embrioide libre de suero (SFEB). Este modelo tridimensional puede ser utilizado como un cultivo de corte organotípico para modelar el desarrollo cortical humano y para la interrogación fisiológica del desarrollo de circuitos neuronales.

Desarrollo de cuerpos embrionarios libres de suero derivados de HiPSC para la interrogación de cultivos de células madre tridimensionales usando ensayos fisiológicamente relevantes

Este Protocolo introduce un método de dos pasos simples para diferenciar células epiteliales limbares córneas de células de vástago pluripotent humana bajo condiciones de cultivo libre de xeno - y alimentador. Los métodos de cultivo celular presentados aquí permiten la producción a gran escala, costo-eficiente de células de calidad clínica aplicables al uso de terapia celular corneal.

Eficiente y escalable diferenciación dirigida de clínico Compatible córnea Limbal epitelial las células madre de células madre pluripotentes humanas

Este protocolo describe un enfoque para producir hepatoesferas a partir de células madre pluripotentes humanas utilizando un sistema de cultivo definido y un autoensamblaje celular. Este protocolo es reproducible en una serie de líneas celulares, rentable y permite la producción de hepatóferas humanas estables para aplicación biomédica.

Producción libre de suero de heferas humanas tridimensionales a partir de células madre pluripotentes

Este protocolo describe cómo establecer, mantener, modificar genéticamente, diferenciar, caracterizar funcionalmente y trasplantar organoides de la glándula lagrimal derivados de tejido primario de ratón y humano.

Establecimiento, mantenimiento, diferenciación, manipulación genética y trasplante de organoides de ratón y glándula lagrimal humana

Aquí, presentamos un protocolo que demuestra el uso del hidrogel como un marco de cultivo celular tridimensional (3D) para el cultivo de células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC) e introduce la fotobiomodulación (PBM) para mejorar la proliferación de ADSC dentro del entorno de cultivo 3D.

Cultivo Celular Tridimensional de Células Madre Derivadas del Temisio Adiposo en Hidrogel con Aumento de Fotobiomodulación

Este protocolo describe un método optimizado para disociar glándulas lagrimales de ratón envejecidas y obtener células individuales viables para la secuenciación de ARN unicelular. La digestión enzimática secuencial y el manejo suave preservan la integridad celular, produciendo suspensiones de alta calidad adecuadas para el aislamiento específico de cada tipo celular y el análisis transcriptómico de cambios asociados al envejecimiento en poblaciones de glándulas lacrimales.

Protocolo para la Disociación de Células Individuales, Secuenciación de ARN y Aislamiento de Células Mioepiteliales y Fibroblastos de las Glándulas Lagrimales y Salivales Envejecidas

Describimos una plataforma basada en el chip para el cultivo en tres dimensiones de las células de micro-biorreactores. Un chip puede albergar hasta 10 millones de euros. células que pueden ser cultivadas bajo condiciones definidas con precisión en lo que respecta al flujo de fluidos, etc tensión de oxígeno en un asa estéril, cerrado de circulación.

Basada en el chip tridimensional de cultivo celular en perfundido Micro-biorreactores

Lisado de plaquetas humanas es una rica fuente de factores de crecimiento y un suplemento potente en cultivo celular. Este protocolo se presenta el proceso de preparación de una gran cantidad de lisado de plaquetas humanas, partiendo de plasma rico en plaquetas, la realización de varios ciclos de congelación-descongelación y el agotamiento de los fragmentos de plaquetas.

Preparación de combinados lisado plaquetario humano (pHPL) como un suplemento eficaz de los animales libres de suero humano culturas de células madre

Aprende un método de cultivo tridimensional sin suero para células madre de la glándula lagrimal de ratón BALB/c. Esta técnica permite la expansión a largo plazo y diferenciación en células acinares y ductales para regeneración ocular.

Sistema de cultivo tridimensional sin suero para células madre de la glándula lagrimal

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