Name: Un enfoque no secuenciador para la detección rápida de la edición de ARN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Aprende a detectar edición de ARN mediante electroforesis en gradiente de microtemperatura (µTGGE), un método portátil y económico que identifica modificaciones sin secuenciación directa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabajo fue apoyado por una subvención para la investigación científica de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (17H02204 y 18K19288). Ruchika fue apoyada financieramente por el gobierno japonés (beca MEXT). Agradecemos a la Sra. Radhika Biyani (Laboratorio Takagi, JAIST) y al Dr. Kirti Sharma (BioSeeds Corporation) por su ayuda con los experimentos relacionados con la electroforesis.

1. Optimización del fragmento objetivo
NOTA: Se utilizaron cuatro genes editados en el desarrollo de este protocolo, incluidos dos genes nucleares (AT2G16586 y AT5G02670) de A. thaliana, y los genes que codifican la proteína fluorescente azul (BFP) y la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) expresadas en células HEK293.
<ol><li>Para identificar fragmentos de genes con diferentes perfiles de fusión, que representan regiones editadas versus no editadas, genere curvas de fusión predichas utilizando la herramienta basada en la web uMelt HETS, una extensión del software original uMelt13. NOTA: Esta herramienta predice las formas de las curvas de fusión para productos heterodúplex y homodúplex.</li>
	<li>Para cada gen objetivo, diseñe tres pares de fragmentos de genes (300-324 pb de longitud). Cada par se compone de un fragmento con un sitio editado y un fragmento de tipo comodín correspondiente con un sitio no editado, ubicado en el extremo terminal de 5', la posición media o el extremo terminal de 3'.</li>
	<li>Seleccione el par no editado/editado que mostró la diferencia máxima entre las regiones de fusión en el eje de helicidad para un análisis más detallado. Para el análisis μTGGE, sintetice el fragmento de gen seleccionado mediante amplificación por PCR, tal como se describe en la sección 2 siguiente.</li>
	<li>Diseñe los cebadores hacia adelante y hacia atrás utilizando el software DNADynamo (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm) y verifique utilizando la herramienta NCBI Primer-BLAST.</li>
	<li>Diluir los cebadores en tampón TE (10 mM Tris-HCl que contiene 1 mM EDTA· Na2) y almacenarlos a una concentración de 100 pmol/μL. Antes de su uso, diluya cada imprimación a una concentración de 10 pmol/μL utilizando agua destilada.</li>
</ol>2. Extracción de ARN y amplificación RT-PCR del fragmento objetivo
<ol><li>Extracción de ARN<ol>
<li>Extraiga el ARN total de la fuente de genes editados y no editados utilizando métodos estándar, como la extracción de TRIzol14 o kits disponibles comercialmente.</li>
		<li>Realizar la síntesis del ADNc correspondiente utilizando un protocolo RT-PCR estándar como se describe en el paso 2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transcripción inversa<ol>
<li>Agregue 1 μL de imprimación oligo(dT), 1 μL de mezcla de dNTP de 10 mM, 10 μL de ARN total y 10 μL de agua destilada estéril a un tubo de microcentrífuga libre de nucleasas.</li>
		<li>Calentar la mezcla a 65 °C durante 5 min y luego incubar en hielo durante al menos 1 min.</li>
		<li>Recoger el contenido del tubo por centrifugación a velocidad máxima (12.000 x g) durante 2-3 s, y añadir 4 μL de tampón ReverTra Ace 5x, 1 μL de 0,1 M TDT y 1 μL de transcriptasa inversa M-MLV (Virus de la Leucemia Murina moloney) (200 U/μL, Tabla de Materiales).</li>
		<li>Mezclar mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo suavemente. Si utiliza cebadores aleatorios, incube el tubo a 25 °C durante 5 min.</li>
		<li>Incubar el tubo a 55 °C durante 60 min y luego inactivar la reacción calentando a 70 °C durante 15 min, en un calentador digital de baño seco/bloque.</li>
		<li>Mida la concentración de ADNc utilizando un espectrofotómetro y guárdela a -25 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Amplificación por PCR y secuenciación confirmatoria de productos
	<ol>
<li>Añadir los siguientes reactivos a un tubo de microcentrífuga libre de nucleasa: 4 μL de tampón de polimerasa Taq 5x, 2 μL de mezcla de dNTP de 2 mM, 2 μL de MgCl2 de mM, 1,6 μL del conjunto de imprimación (adelante y atrás; cada uno 10 mM), 2 μL de plantilla de ADNc, 0,1 μL de Taq polimerasa (2,5 U/μL) y 8,3 μL de agua destilada estéril (volumen final, 20 μL).</li>
		<li>Realizar PCR con las siguientes condiciones de ciclo: desnaturalización inicial a 95 °C durante 2 min; 35 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 2 min, recocido a una temperatura adecuada (dependiendo del juego de imprimación específico utilizado) durante 30 s, y extensión a 72 °C durante 2 min; y luego una extensión final a 72 °C durante 7 min.</li>
		<li>Para purificar los productos de PCR, agregue 2 U de exonucleasa I y 0.5 U de fosfatasa alcalina de camarón (ExoSAP). Incubar el tubo en un termociclador a 37 °C durante 1 h, seguido de 80 °C durante 15 min, y luego mantener a 4 °C hasta el siguiente paso.</li>
		<li>Para la secuenciación confirmatoria, agregue 11,5 μL de agua destilada estéril, 2,5 μL de imprimación directa o inversa y 1 μL de productos de PCR (con ExoSAP) a un nuevo tubo de microcentrífuga. NOTA: Utilice los servicios de secuenciación de ADN (por ejemplo, Eurofins Genomics) para el análisis de secuenciación.</li>
		<li>Para validar la especificidad de los productos de PCR, realice la secuenciación con cebadores hacia adelante y hacia atrás. Los pares de cebadores utilizados en el análisis representativo se dan en la Tabla 1.</li>
		<li>Diluya los productos de PCR purificados a una concentración de 200 ng/μL con agua desionizada. A continuación, mezcle 6 μL del producto purificado con 3 μL de 6x colorante de carga de gel en un tubo de 250 μL y eleve el volumen total a 12 μL con agua estéril. Guarde el producto de PCR (a -25 °C) hasta que esté listo para continuar con μTGGE como se describe a continuación.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Análisis μTGGE
NOTA: El análisis μTGGE se realiza utilizando un sistema miniaturizado y económico. En la Figura 2 se muestra una descripción general del sistema completo, incluidos los casetes de gel, el soporte de casete de gel, la plataforma de electroforesis de gel horizontal, la fuente de alimentación y el sistema de imágenes de gel.
<ol><li>Montaje de los casetes de gel<ol>
<li>El casete de gel utilizado para el análisis de μTGGE se muestra en la Figura 2A. El diseño consta de tres placas de gel de 1 pulgada: una placa de gel inferior, una placa de gel superior y una placa de borde de carril. Coloque la placa de gel superior entre las otras dos placas y enséblela en el soporte de cassette de gel para la polimerización del gel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de gel de poliacrilamida<ol>
<li>Añadir 7,2 g de urea a un tubo de 50 ml y disolver en 10 ml de agua estéril. Calentar la muestra en un microondas durante 20-30 s y luego llevarla a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Añadir 3 mL de tampón tris/borato/EDTA (TBE) de 5x (Tabla de materiales), 2,25 ml de acrilamida/bis al 40% (p/v) (19:1), 75 μL de 10x persulfato de amonio y 15 μL de tetrametilendiamina a la solución.</li>
		<li>Vierta inmediatamente la solución de gel en el soporte del cassette de gel lentamente, evitando la formación de burbujas de aire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Generación de perfiles de fusión utilizando la unidad μTGGE<ol>
<li>Utilice la versión miniaturizada y económica del aparato μTGGE que se muestra en la Figura 2 con un gradiente de temperatura (25-65 °C) establecido perpendicularmente a la dirección de la migración del ADN.</li>
		<li>Remoje las almohadillas tampón de electroforesis superior e inferior (0,5 cm x 2,5 cm) en 2 ml de 1 tampón TBE.</li>
		<li>Coloque el cassette de gel en la unidad de cámara de electroforesis horizontal y coloque las almohadillas tampón superior e inferior en consecuencia, como se muestra en la Figura 2.</li>
		<li>A continuación, cargue 10 μL del producto de PCR en el pozo medio (más largo) y 1 μL del producto de PCR en cada pozo lateral.</li>
		<li>Después de una espera de 1 minuto, conecte la unidad de alimentación y suministre 100 V durante 12 minutos a un gradiente de temperatura lineal de 25-65 ° C.</li>
		<li>Una vez completada la carrera, saque el cassette y retire la cubierta de vidrio superior.</li>
		<li>Vierta 300 μL de 10 veces la mancha SYBR Gold sobre el gel. Visualice los perfiles de fusión utilizando la linterna LED azul instalada en el dispositivo electroforético del tamaño de la palma de la mano. NOTA: Se debe guardar un archivo simplificado de la imagen del gel para el cálculo de la puntuación de similitud de patrón (PaSS).</li>
		<li>Repita cada experimento electroforético 3x para confirmar la reproducibilidad de los datos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Cálculos de PaSS
NOTA: Los cálculos se realizan utilizando el software μTGGE Analyzer.
<ol><li>Descargue y abra el software.</li>
	<li>Abra el archivo JPEG que contiene la imagen del gel. Tenga en cuenta que el software solo aceptará archivos en formato JPEG.</li>
	<li>Haga clic en el botón Marco y seleccione el área apropiada (marco) de la imagen del gel.</li>
	<li>Haga clic en el botón Corrección de coordenadas y agregue dos puntos de referencia, como se muestra en la Figura 1B.</li>
	<li>Haga clic en el botón Adición de puntos de característica y agregue puntos de muestra como se muestra en la Figura 1B. A continuación, guarde los datos de imagen de gel procesados en formato μTGGE (*.tgg).</li>
	<li>Haga clic en el botón Ejemplo y seleccione la opción Buscar puntos simples para comparar dos o más imágenes.</li>
</ol>

<ol><li>Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+high-throughput+method+for+the+detection+and+quantification+of+RNA+editing+based+on+high-resolution+melting+of+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons.</a> Nucleic Acids Research. 35 (17), 114(2007).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+PCR+method+for+the+quantitative+analysis+of+RNA+editing+at+specific+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites.</a> Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).</li>
<li>Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptor+RNA+editing%3A+a+molecular+analysis+of+GluR2%2C+GluR5+and+GluR6+in+human+brain+tissues+and+in+NT2+cells+following+in+vitro+neural+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation.</a> Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).</li>
<li>Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O'Connell, M. A., Keegan, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-processing+events+in+mRNAs+identified+by+DHPLC+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis.</a> Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).</li>
<li>Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Quantitative+method+to+detect+RNA+editing+events%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A Quantitative method to detect RNA editing events.</a> Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).</li>
<li>Burns, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+serotonin-2C+receptor+G-protein+coupling+by+RNA+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing.</a> Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).</li>
<li>Marian, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bottleneck+in+genetic+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The bottleneck in genetic testing.</a> Circulation Research. 117 (7), 586-588 (2015).</li>
<li>Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+biology%3A+Not+drowning+but+waving%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genome biology: Not drowning but waving.</a> Cell. 154 (5), 951-952 (2013).</li>
<li>Jones, B. M., Knapp, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+temperature+gradient+electrophoresis+for+detection+of+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms.</a> Methods in Molecular Biology. 578, Clifton, N.J. 153-165 (2009).</li>
<li>Riesner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-gradient+gel+electrophoresis+of+nucleic+acids%3A+analysis+of+conformational+transitions%2C+sequence+variations%2C+and+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions.</a> Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).</li>
<li>Biyani, M., Nishigaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hundred-fold+productivity+of+genome+analysis+by+introduction+of+micro-temperature+gradient+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).</li>
<li>Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palm-size+and+one-inch+gel+electrophoretic+device+for+reliable+and+field-applicable+analysis+of+recombinase+polymerase+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification.</a> Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).</li>
<li>Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((uMELT%3A+prediction+of+high-resolution+melting+curves+and+dynamic+melting+profiles+of+PCR+products+in+a+rich+web+application%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application.</a> Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+RNA+using+TRIzol+%28TRI+Reagent%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).</li>
<li>Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+editing+of+BFP%2C+a+point+mutant+of+GFP%2C+using+artificial+APOBEC1+deaminase+to+restore+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17304(2020).</li>
<li>Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+activity+of+adenosine+deaminase+acting+on+RNA+%28ADARs%29+isoforms+for+correction+of+genetic+code+in+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).</li>
<li>Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+U-To-C+RNA+editing+events+for+nuclear+genes+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana.</a> Cells. 10 (3), 635(2021).</li>
<li>Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+U-to-C+RNA+editing+affects+the+mRNA+stability+of+nuclear+genes+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

La edición de ARN juega un papel importante en la biología; sin embargo, los métodos actuales de detección de edición de ARN, como la cromatografía y la secuenciación, presentan varios desafíos debido a su alto costo, requisitos de tiempo excesivos y complejidad. El protocolo descrito aquí es un método simple, rápido y rentable para detectar la edición de ARN que utiliza un sistema portátil, de tamaño micrométrico y basado en TGGE. Este sistema se puede utilizar para diferenciar entre genes editados y no editados antes d...

Las variantes de nucleótido único (SNV) en el ARN genómico, incluidas las variantes de A a I, C a U y U a C, pueden indicar eventos de edición de ARN. Sin embargo, la detección de SNVs en el ARN sigue siendo una tarea técnicamente desafiante. Convencionalmente, la proporción de ARN editado a no editado se determina mediante secuenciación directa, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real específica del alelo o cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) de desnaturalización 1,2,3,4,5,6. Sin embargo, estos enfoques no son particularmente efectivos en tiempo o costo, y sus bajas precisiones, causadas por altos niveles de ruido, plantean cuellos de botella tecnológicos para la detección de SNV basada en ARN 7,8. Aquí, describimos un protocolo basado en la electroforesis en gel de gradiente de temperatura (TGGE) para identificar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) como un método alternativo que elimina la necesidad de enfoques de secuenciación directa de ARN para los análisis de edición de ARN.
La electroforesis es un método preferido para la separación y el análisis de biomoléculas en laboratorios de ciencias de la vida. TGGE permite la separación de fragmentos de ADN de doble cadena que son del mismo tamaño pero tienen diferentes secuencias. La técnica se basa en las diferencias relacionadas con la secuencia en las temperaturas de fusión de los fragmentos de ADN y los cambios posteriores en sus movilidades en geles porosos con un gradiente de temperatura lineal 9,10. La fusión de fragmentos de ADN genera perfiles de fusión específicos. Una vez que el dominio con la temperatura de fusión más baja alcanza la temperatura correspondiente en una posición particular en el gel, se produce la transición de una estructura helicoidal a una estructura parcialmente fundida, y la migración de la molécula prácticamente se detendrá. Por lo tanto, TGGE utiliza tanto la movilidad (información de tamaño) como las transiciones estructurales inducidas por la temperatura de los fragmentos de ADN (información dependiente de la secuencia), lo que lo convierte en un enfoque poderoso para la caracterización de fragmentos de ADN. Los puntos característicos en un patrón de fusión TGGE, que corresponden a tres transiciones estructurales de la molécula de ADN, son el punto de disociación inicial de la hebra, el punto de disociación media de la hebra y el punto de disociación final de la hebra (Figura 1). Las variaciones de secuencia dentro de los dominios, incluso las diferencias de una sola base, afectan la temperatura de fusión, por lo tanto, las moléculas con diferentes secuencias mostrarán patrones discretos de fusión (desnaturalización) en los análisis TGGE. Por lo tanto, TGGE se puede utilizar para analizar SNV en ARN genómico y puede ser un método invaluable de alto rendimiento para detectar la edición de ARN. Esta ganancia de alto rendimiento se pierde cuando se utiliza TGGE tradicional basado en electroforesis en gel. Sin embargo, una versión miniaturizada de TGGE, llamada microTGGE (μTGGE), se puede utilizar para acortar el tiempo electroforético del gel y acelerar el análisis con un aumento de 100 veces en la productividad11. La simplicidad y la compacidad del método μTGGE se han mejorado con la introducción de PalmPAGE12, un sistema de electroforesis en gel aplicable en el campo, portátil y asequible.
Aquí, se utiliza un nuevo protocolo basado en TGGE para examinar tres tipos de sitios de edición de ARN (A-to-I, C-to-U y U-to-C) en cuatro genes, incluidos dos de tejidos de Arabidopsis thaliana y dos expresados en células HEK293 de mamíferos (Figura 1A). El protocolo integra el uso de PalmPAGE (hardware), un sistema portátil para la detección rápida de la edición de ARN, y uMelt (software)13. Con un tiempo de ejecución promedio de 15-30 min, este protocolo permite una identificación rápida, confiable y fácil de la edición de ARN sin la necesidad de enfoques de secuenciación directa de ARN.

<table><tbody><tr><td>2U ExoI</td><td>Takara</td><td>2650A</td><td>Exonucleasa I</td></tr><tr><td>40(p/v)%-acrilamida/bis (19:1)</td><td>Thermofisher</td><td>AM9022</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio (APS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17874</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Mini spin</td><td>eppendorf</td><td>5452000034</td><td></td></tr><tr><td>Baño seco/calefactor digital de bloque</td><td>Thermofisher</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla maestra de polimerasa Gold Taq</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>ADN polimerasa LATaq</td><td>TAKARA</td><td>RR002A</td><td>Taq polimerasa</td></tr><tr><td>micro-TGGE&nbsp; Soporte para casetes</td><td>BioSeeds Corp.</td><td>BS-GE-CH</td><td></td></tr><tr><td>Aparato micro-TGGE</td><td>Lifetech Corp.</td><td>TG</td><td></td></tr><tr><td>micro-TGGE gel cassette</td><td>BioSeeds Corp.</td><td>BS-TGGE-C</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000</td><td>Thermofisher</td><td>ND-1000</td><td>Espectrofotómetro</td></tr><tr><td>Kit Plant Rneasy Mini</td><td>Qiagen</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace Master Mix</td><td>TOYOBO</td><td>TRT101</td><td>M-MLV (Virus de la leucemia de Moloney Murina) transcriptasa inversa</td></tr><tr><td>Kit Rneasy Mini</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatasa alcalina de gambas</td><td>Takara</td><td>2660B</td><td></td></tr><tr><td>Tinción en gel de ácido nucleico de oro SYBR</td><td>Thermofisher</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Búfer TBE</td><td>Thermofisher</td><td>B52</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilediamina (TEMED)</td><td>Tesque de Nacalai</td><td>33401-72</td><td></td></tr><tr><td>Urea, nucleasa y proteasa analizadas</td><td>Tesque de Nacalai</td><td>35940-65</td><td></td></tr></tbody></table>

un enfoque no secuenciador para la detección rápida de la edición de arn

A Nonsequencing Approach for the Rapid Detection of RNA Editing

La edición de ARN es un proceso que conduce a alteraciones de la secuencia posttranscripcional en los ARN. La detección y cuantificación de la edición de ARN se basa principalmente en la secuenciación de Sanger y las técnicas de secuenciación de ARN. Sin embargo, estos métodos pueden ser costosos y llevar mucho tiempo. En este protocolo, se utiliza un sistema portátil de electroforesis en gel de gradiente de microtemperatura (μTGGE) como un enfoque no secuenciador para la detección rápida de la edición de ARN. El proceso se basa en el principio de electroforesis, que utiliza altas temperaturas para desnaturalizar muestras de ácido nucleico a medida que se mueven a través de un gel de poliacrilamida. A través de un rango de temperaturas, un fragmento de ADN forma un gradiente de ADN de doble cadena a hebras parcialmente separadas y luego a ADN de cadena simple completamente separado. Los sitios editados por ARN con distintas bases de nucleótidos producen diferentes perfiles de fusión en los análisis de μTGGE. Utilizamos el enfoque basado en μTGGE para caracterizar las diferencias entre los perfiles de fusión de cuatro fragmentos de ARN editados y sus correspondientes fragmentos no editados (tipo salvaje). Las puntuaciones de similitud de patrones (PaSS) se calcularon comparando los patrones de banda producidos por los ARN editados y no editados y se utilizaron para evaluar la reproducibilidad del método. En general, la plataforma descrita aquí permite la detección de mutaciones incluso de base única en ARN de una manera directa, simple y rentable. Se prevé que esta herramienta de análisis ayudará a nuevos hallazgos de biología molecular.

Uso de μTGGE para identificar cambios en la base de un solo nucleótido en eventos de edición de ARN Para este protocolo se utilizaron cuatro genes editados (Tabla 1), incluyendo el gen BFP producido en células HEK293 (con edición de ARN C-to-U por las enzimas desaminasas del complejo enzimático de edición de ARNm de apolipoproteína B; APOBEC115), el gen EGFP que contiene el codón de parada ocre (TAA) producido en células HEK293 (con edición de ARN A-to-I por ad...

La detección rápida y la cuantificación confiable de los eventos de edición de ARN a escala genómica siguen siendo un desafío y actualmente dependen de métodos de secuenciación directa de ARN. El protocolo descrito aquí utiliza la electroforesis en gel de gradiente de microtemperatura (μTGGE) como un método simple, rápido y portátil para detectar la edición de ARN.

Un enfoque no secuenciador para la detección rápida de la edición de ARN

RNA editing is a process that leads to posttranscriptional sequence alterations in RNAs. Detection and quantification of RNA editing rely mainly on Sanger ...

La edición de ARN juega un papel crítico en las enfermedades humanas. Los científicos están encontrando una aplicación infinita en los medicamentos. Este protocolo demuestra la aplicación de la tecnología de electroforesis de temperatura portátil como un enfoque de no secuenciación para la identificación rápida y confiable de la modificación de ARN en la edición de ARN sin la necesidad de secuenciación directa de ARN.Se utilizó el enfoque basado en la electroforesis micro tTG para caracterizar las diferencias entre el perfil de fusión de cuatro fragmentos de ARN editados y sus correspondientes fragmentos no editados. Se utilizaron las puntuaciones de similitud del patrón para evaluar la reproducibilidad del método. Esta plataforma permite la detección incluso de sustitución de base única en ARN, de manera directa, simple y rentable.Se anticipa que esta herramienta analítica ayudará a nuevos hallazgos en biología molecular Comenzar identificando fragmentos de genes con diferentes perfiles de fusión y generar curvas de fusión predichas utilizando la herramienta basada en la web Umelt HETS. Diseñe tres pares de 300 a 324 fragmentos de genes de pares de bases para cada gen objetivo. Se

a-nonsequencing-approach-for-the-rapid-detection-of-rna-editing

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Debido a la naturaleza transitoria de la pre-ARNm, que pueden ser difíciles de aislar y...

Un rápido de alto rendimiento para el método de asignación de Ribonucleoproteínas (RNP) de Derechos Humanos pre-mRNA

En este artículo se describe un ensayo basado en ribozima altamente sensible, aplicable al cribado de alto rendimiento de productos químicos dirigidos al proceso único de edición de ARN en patógenos tripanosomátidos. Los inhibidores pueden utilizarse como herramientas para el análisis basado en hipótesis del proceso de edición del ARN y, en última instancia, como terapéuticos.

RNA catalizador como reportero para rastrear fármacos contra ARN de edición en tripanosomas

Aquí se describe un protocolo destinado a investigar el impacto de corte y empalme aberrante de resistencia a fármacos en tumores sólidos y neoplasias hematológicas. Para este objetivo, se analizaron los perfiles de transcriptómica de modelos parentales y resistentes in vitro a través de RNA-seq y establecimos un método basado QRT-PCR para validar los genes candidatos.

El uso de ARN de secuenciación para detectar novela de empalme variantes relacionadas con la resistencia de drogas en<em&gt; In Vitro</em&gt; modelos de cáncer

Secuenciación de próxima generación (NGS) es una poderosa herramienta para la caracterización genómica que está limitada por la tasa alta de error de la plataforma (~0.5–2.0%). Describimos nuestros métodos de corrección de error de la secuencia que nos permiten obviar la tasa de error NGS y detectar mutaciones en fracciones de alelo variante tan raros como 0.0001.

Detección de eventos raros usando ADN Error corregido y secuenciación de ARN

Aquí presentamos un protocolo para el escote dependiente de DNAzyme de ARN. Esto permite un análisis rápido y dependiente del sitio del ARN 2'-O-metilación. Este enfoque se puede utilizar para la evaluación preliminar o importante de la actividad del esnoRNA.

Análisis dependiente de DNAzyme de rRNA 2'-O-Methylation

Presentamos un protocolo detallado de reparación de la biblioteca de ARN pequeño con menos sesgo que los métodos estándar y una mayor sensibilidad para los ARN de 2'-O-metil. Este protocolo se puede seguir utilizando reactivos caseros para ahorrar costos o usar kits para mayor comodidad.

Mejora de ARN pequeño-seq: Menos sesgo y mejor detección de 2'-O-Metil RNAs

Aquí, describimos un protocolo detallado para un método de secuenciación basado en LC-MS que se puede utilizar como método directo para secuenciar ARN corto (&lt;35 nt por ejecución) sin un intermedio de ADNc, y como método general para secuenciar diferentes modificaciones de nucleótidos en un solo estudio con precisión de una sola base.

2D-HELS MS Seq: Un método general basado en LC-MS para la secuenciación directa y de novo de mezclas de ARN con diferentes modificaciones de nucleótidos

El empalme alternativo (AS) y la poliadenilación alternativa (APA) amplían la diversidad de isoformas de transcripción y sus productos. Aquí, describimos protocolos bioinformáticos para analizar RNA-seq a granel y ensayos de secuenciación final 3' para detectar y visualizar AS y APA que varían según las condiciones experimentales.

Identificación de empalme alternativo y poliadenilación en datos de RNA-seq

La entrega de editores genómicos como ARN es un medio particularmente potente para modificar los genomas de las células y líneas celulares primarias de mamíferos. El objetivo de este protocolo es entregar editores genómicos como ARNm a células y líneas celulares primarias de mamíferos, seguido de secuenciación y análisis dirigidos de Illumina para cuantificar los resultados de edición.

Edición genómica en células primarias de mamíferos mediante electroporación del ARN editor

Cuantitativo, de alto rendimiento, en tiempo real, y sin etiquetas de detección biomolecular (ADN, proteínas, etc) sobre...

Biomoleculares de detección utilizando el sensor de reflectancia de imágenes interferométricas (IRIS)

Aprende a detectar edición de ARN mediante electroforesis en gradiente de microtemperatura (µTGGE), un método portátil y económico que identifica modificaciones sin secuenciación directa.

Un enfoque no secuenciador para la detección rápida de la edición de ARN

Explorar más videos