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Artículo de método

Medición de la migración y la formación de biopelículas de diversas bacterias

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DOI:

10.3791/63595

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2 de mayo de 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Southern University of Science and Technology, 2Desa Mahkota Form Six College, Ministry of Education Malaysia, 3Department of Critical Care Medicine, The Second Affiliated Hospital School of Medicine, Southern University of Science and Technology

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un método práctico para el aislamiento e identificación de microorganismos dentro del huésped. De esta manera, se describen claramente las propiedades fisicoquímicas de los microorganismos y las posibles formas de vida en el huésped.

Resumen

Dado que los microbios que prosperan en el cuerpo huésped tienen principalmente capacidades adaptativas que facilitan su supervivencia, los métodos para clasificar e identificar su naturaleza serían beneficiosos para facilitar su caracterización. En la actualidad, la mayoría de los estudios se centran en un solo método de caracterización específico; Sin embargo, el aislamiento e identificación de microorganismos del huésped es un proceso continuo y generalmente requiere varios métodos de caracterización combinatoria. En este trabajo, describimos métodos para identificar la capacidad de formación de biopelículas microbianas, el estado de respiración microbiana y su comportamiento de quimiotaxis. Los métodos se utilizan para identificar cinco microbios, tres de los cuales se aislaron del tejido óseo de ratas Sprague-Dawley (SD) (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus y Enterococcus faecalis) y dos de la American Type Culture Collection (ATCC): Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Enterococcus faecalis V583. Los microbios aislados del tejido óseo de rata SD incluyen los microbios grampositivos. Estos microbios se han adaptado para prosperar en entornos estresantes y limitantes de nutrientes dentro de la matriz ósea. Este artículo tiene como objetivo proporcionar a los lectores los conocimientos específicos para determinar la naturaleza y el comportamiento de los microbios aislados en un entorno de laboratorio.

Introducción

El huésped mamífero representado por el cuerpo humano contiene una gran cantidad de microorganismos. Estos microorganismos están ampliamente distribuidos en la boca, el tracto digestivo, el intestino y la sangre del huésped y tienen diferentes efectos en la salud del huésped. La cavidad oral alberga una gran cantidad de microbios que pueden modular la susceptibilidad del huésped a las infecciones. Microbios como los estreptococos (por ejemplo, S. mitis/oralis, S. pseudopneumoniae y S. infantis) y Prevotella spp. colonizan la cavidad oral, formando una biopelícula multiespecie en la superficie de la lengua que causa mal aliento y funciona como un reservorio microbiano para la infección microbiana. Estos patógenos pueden infectar el hueso maxilar infiltrándose en los ligamentos periodontales que sostienen la raíz del diente en el hueso maxilar. La caracterización de estos microbios aislados del cuerpo del huésped es a menudo un proceso tedioso, particularmente cuando los microbios exhiben rasgos individuales que requieren un tratamiento específico y condiciones de crecimiento. Los microbios, como los patógenos Helicobacter pylori, Clostridium difficile y Fusobacterium nucleatum, prosperan en el duro entorno del intestino, con requisitos específicos de oxígeno, nutrientes y crecimiento, lo que presenta un desafío en los procesos de caracterización, particularmente en la investigación de la patogenicidad de estos microbios. Por lo tanto, se necesita un método estandarizado de aislamiento e investigación de estos microorganismos para que los científicos y los profesionales de la medicina desarrollen nuevos tratamientos médicos.

Este protocolo utiliza microbios que prosperan en la matriz ósea de las ratas. Tradicionalmente, con la excepción del sistema óseo representado por la mandíbula, donde la presencia de dientes hace que la matriz ósea sea más susceptible a la infección queotros huesos, generalmente se cree que el hueso sano del huésped es un ambiente estéril. Sin embargo, los estudios han encontrado que los microorganismos ingresan a la circulación sistémica a través de la pared intestinal, afectando en última instancia la mineralización ósea2. Como prueba de concepto, utilizamos el protocolo descrito para caracterizar las propiedades bioquímicas de aislados microbianos del fémur y la tibia de ratas SD sanas (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. y Enterococcus faecalis). Estos aislados microbianos se seleccionaron porque el hueso es un entorno cerrado e hipóxico, y la caracterización de estos microbios a partir del hueso puede ser una tarea difícil. Diversos artículos han detallado los procesos utilizados en el estudio de estos microbios; Sin embargo, son pocos los que proporcionan un protocolo completo para identificar microorganismos aislados del huésped.

Al establecer las condiciones de cultivo adecuadas, los requisitos de oxígeno del microbio deben comprenderse mediante el uso de medio de tioglicolato fluido (FTM). Los microbios con diferentes requisitos de oxígeno forman capas estratificadas en el líquido FTMtransparente 3. Sobre la base del perfil de estratificación, se utiliza el requerimiento de oxígeno del microbio para investigar el crecimiento de las células. Los microbios que prosperan en la superficie del líquido FTM son aerobios obligados, mientras que los microbios que crecen en el fondo son anaerobios obligados. Los microbios que crecen como una suspensión en el líquido FTM son anaerobios facultativos o aerotolerantes. La tasa de crecimiento microbiano se establece observando la fase de crecimiento exponencial de las células microbianas. A continuación, se compara el perfil de crecimiento con la formación de biopelículas del microbio. Las biopelículas están compuestas en gran medida por múltiples especies que afectan directa e indirectamente a la salud de las demás. Durante este proceso, las interacciones beneficiosas entre las comunidades microbianas seleccionan la unión, proporcionando una estructura espacial que favorece la evolución de las interacciones recíprocas activas. Por ejemplo, el cocultivo de Paenibacillus amylolyticus y Xanthomonas retroflexus exhibe interacciones simbióticas facultativas en un ambiente estático, promoviendo un rápido crecimiento de biopelículas13. Los microbios se adaptan a los tejidos del huésped a través de la formación de biopelículas para una localización sostenida, protegiéndose contra entornos hostiles y evadiendo el sistema inmunológico del huésped 4,5,6,7. Las biopelículas suelen ser estructuras densas y multicapa que ayudan a los microorganismos a resistir los estímulos subcríticos externos; por ejemplo, E. faecalis en la pulpa dental mejora su resistencia a los antibióticos al aumentar la formación de biopelículas cuando se enfrenta a subconcentraciones de tetraciclina y vancomicina8.

La quimiotaxis permite que los microorganismos se muevan de acuerdo con gradientes químicos, y las vías de señalización están ampliamente distribuidas en una variedad de bacterias patógenas. Algunos microorganismos patógenos migran a sitios específicos, bajo la guía de señales químicas, para causar enfermedades infecciosas14. Por ejemplo, Xanthomonas spp. expresan 19 proteínas quimiorreceptoras y 11 flagelinas en el huésped, lo que desencadena la unión bacteriana y, en última instancia, la ulceración15. También hay proteínas específicas en las bacterias (proteínas de unión a pectina) que guían la migración específica de las bacterias a los nutrientes, lo que puede conducir a un mejor crecimiento16. Esto también es crítico para las bacterias que pueden existir en ambientes pobres en nutrientes. Las células microbianas a menudo dependen de la motilidad quimiotáctica para atraerse a un entorno de crecimiento propicio mientras evaden otras células depredadoras y toxinas que dañan la viabilidad celular. Sobre la base de enfoques de agar blando previamente establecidos para determinar la quimiotaxis, desarrollamos un método difusible para generar un gradiente de quimioatrayente para probar la quimiotaxis microbiana.

En este trabajo se describen los métodos para determinar las condiciones de crecimiento, la formación de biopelículas y el tropismo químico de las bacterias, utilizando como ejemplos Corynebacterium stationis, Staphylacoccus cohnii, Enterococcus faecalis, Staphylacoccus aureus ATCC 25923 y Enterococcus faecalis V583 (ver Figura 1). La optimización de las condiciones de crecimiento microbiano utiliza FTM para determinar los requisitos de oxígeno del microbio, mientras que la formación de biopelículas utiliza superficies de vidrio como soporte sólido y la masa de biopelícula se contratiñe con violeta cristalino. El tropismo químico del microbio se basa en su comportamiento quimiotáctico, donde a través de la impresión 3D (Figura Suplementaria S1), se utiliza un método estandarizado para generar un reservorio químico para el quimioatrayente en una matriz de agar suave (Figura Suplementaria S2).

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Protocolo

NOTA: Consulte la Tabla de Materiales para obtener detalles sobre todos los materiales y equipos utilizados en este protocolo. Utilizar técnicas asépticas para evitar la contaminación.

1. Recuperación bacteriana para conseguir una sola colonia

  1. Prepare placas de agar sólidas.
    1. Prepare el medio que contiene agar TerrificBroth(TB), con cada litro de líquido que contiene 11,8 g de triptona, 23,6 g de extracto de levadura, 9,4 g de K2HPO4, 2,2 g de KH 2 PO4 y 15 g de agar, pH = 7.
    2. Esterilizar la solución en autoclave a 121 °C durante 20 min utilizando un tapón permeable al aire o una película selladora de botellas con una rejilla de ventilación.
    3. Antes de que el líquido se enfríe y solidifique, vierta el caldo de TB que contiene agar en placas de Petri de plástico de 10 cm a un volumen de 25 ml por placa.
      NOTA: El caldo debe verterse en el plato antes de que se solidifique a temperaturas inferiores a 60 °C. Utilizar técnicas asépticas para evitar la contaminación.
  2. Inoculación bacteriana en la placa
    1. Extraiga las cepas objetivo almacenadas a -80 °C y descongélelas a temperatura ambiente en un armario de seguridad biológica.
    2. Utilice una pipeta de 10 μL para absorber 10 μL de suspensión bacteriana y extiéndala sobre la placa de TB mediante rayas.
    3. Selle la placa para evitar la contaminación. Coloque la placa en una incubadora bioquímica a 37 °C. Verifique visualmente el crecimiento de la colonia después de ~ 24 h. Elija colonias individuales y amplíelas por PCR para confirmar que contienen solo un tipo de bacteria.

2. Cultivo líquido bacteriano a la fase de crecimiento logarítmico

  1. Prepare el medio de cultivo líquido.
    1. Consulte la preparación de placas de agar sólido en el Paso 1.1.1. para preparar un medio líquido TB, 1 L del cual contiene 11,8 g de triptona, 23,6 g de extracto de levadura, 9,4 g de K2HPO4 y 2,2 g de KH2PO4, pH ~ 7.
      NOTA: No agregue agar. Las bacterias crecen más rápido en un entorno de nutrientes líquidos.
    2. Esterilizar la solución en autoclave a 121 °C durante 20 min utilizando un tapón permeable al aire o una película selladora de botellas con una rejilla de ventilación.
    3. Almacene el medio de cultivo líquido a 4 °C.
  2. Inoculación y cultivo de bacterias
    1. En el armario de seguridad biológica, elija una sola colonia con un asa de inoculación o una pipeta de 10 μL e inocule las bacterias en el medio líquido preparado para la tuberculosis en un matraz Erlenmeyer.
    2. Sellar el matraz Erlenmeyer con una gasa y colocarlo en un agitador (200 rpm) a 37 °C para cultivar las bacterias.
      NOTA: El medio líquido se vuelve gradualmente turbio durante 5 h; El tiempo que tarda en volverse turbio varía con las diferentes bacterias.

3. Experimento FTM y determinación de la curva de crecimiento

  1. Preparación del medio de tioglicolato fluido (FTM)
    1. Prepare el medio de tiolglicolato (TM), cada litro del cual contiene 15 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de glucosa, 0,5 g de L-cisteína, 0,5 g de tioglicolato de sodio, 2,5 g de cloruro de sodio, 0,001 g de resazurina y 0,75 g de agar.
      NOTA: El medio sólido disponible en el mercado puede reconstituirse fácilmente con agua y esterilizarse (Paso 3.1.2.).
    2. Pesar 29,3 g de tioglicolato medio sólido, añadir 1 L de agua destilada, calentar y remover hasta que se disuelva por completo y hasta que la solución se ponga rosada.
    3. Agregue TM (19 mL) a un tubo de ensayo con un tapón de sellado. Después del sellado, autoclave la solución a 121 °C durante 20 minutos con un tapón permeable al aire o una película selladora de botellas con una rejilla de ventilación.
      NOTA: Después de calentar, la solución se vuelve de color amarillo claro.
  2. Inoculación, cultivo y observación de bacterias
    1. Prepare la suspensión bacteriana para que crezca hasta OD 0,6-0,8 en medio líquido para TB (ver Paso 2.2.).
    2. Abra el tapón de sellado del tubo de ensayo en condiciones asépticas en el gabinete de seguridad biológica, agregue 1 mL del cultivo bacteriano al tubo de ensayo que contiene FTM lo antes posible y vuelva a sellar inmediatamente el tubo de ensayo.
    3. Agite el tubo suavemente para asegurarse de que las bacterias se distribuyen homogéneamente en el líquido y coloque el tubo de ensayo a 37 °C para el cultivo estático.
    4. Después de 48 h de incubación, observe el crecimiento de diferentes bacterias en FTM en varios tubos de ensayo y tome fotografías.
  3. Determinación de la curva de crecimiento en condiciones aeróbicas
    1. Prepare el cultivo bacteriano inicial con un valor de DO adecuado (consulte el paso 2.2) y cultive las bacterias hasta que alcancen la fase de crecimiento logarítmico.
      NOTA: Corynebacterium stationis, Staphylacoccus cohnii, Enterococcus faecalis, Staphylacoccus aureus ATCC 25923 y Enterococcus faecalis V583 utilizados en este protocolo tardaron ~5 h en alcanzar la fase logarítmica.
    2. Añada 200 μL del cultivo bacteriano (del paso 3.3.1) en medio líquido de TB a cada pocillo de una placa de 96 pocillos por triplicado. Utilice un lector de microplacas para determinar el valor de DO a 600 nm y diluya los diferentes cultivos bacterianos de modo que la diferencia de DO entre los diferentes pocillos que contienen bacterias y el medio líquido de TB (en blanco) esté entre 0,01 y 0,02.
    3. Tome una nueva placa de 96 pocillos, agregue medio TB, transfiera los diferentes cultivos bacterianos diluidos del Paso 3.3.2., por triplicado, a la placa y colóquela en un banco de trabajo ultra limpio.
    4. Selle la placa de 96 pocillos con cinta de sellado, colóquela en el lector de microplacas y configure el programa de la siguiente manera:
      1. Ajuste la temperatura a 37 °C ± 0,5.
      2. Ajuste el bucle cinético a un total de 60 ciclos, cada uno durante 30 minutos.
      3. Ajuste la absorbancia a 600 nm.
      4. Ajuste Agitación a 1.600 s en un ciclo.
      5. Ejecute el programa y deténgalo cuando la curva de crecimiento se estabilice.
  4. Determinación de la curva de crecimiento en condiciones anaeróbicas
    1. Siga el paso 3.3. pero mantenga la placa de 96 pocillos con el medio TB y las suspensiones bacterianas en una incubadora anaeróbica antes de sellar la placa con cinta de sellado. Bombee y llene la caja anaeróbica con nitrógeno para reducir la concentración de oxígeno al <3%. Selle la placa de 96 pocillos con cinta de sellado y déjela en la caja anaeróbica.

4. Prueba de capacidad de formación de biofilm

  1. Cultive las bacterias hasta la fase de crecimiento logarítmico en medio líquido.
    1. Consulte la sección 2 para inocular las bacterias en el medio líquido para la tuberculosis.
    2. Cultivar las bacterias durante la noche en un agitador a 37 °C, asegurándose de que el diámetro exterior600 del medio de cultivo bacteriano esté entre 0,6 y 0,8.
  2. Divida el cultivo bacteriano y cultive en diferentes condiciones.
    1. Cuando el diámetro exterior600 del cultivo bacteriano esté entre 0,6 y 0,8, añada 10 ml de esta suspensión bacteriana a un tubo de ensayo de vidrio.
    2. Divida cada cultivo bacteriano en dos grupos: condiciones aeróbicas y anaeróbicas, y realice todas las operaciones por triplicado.
      1. Para el grupo aeróbico, envuelva el tubo de ensayo que contiene la suspensión bacteriana con papel de aluminio e incube en un baño de agua a 37 °C a temperatura constante.
      2. Para el grupo anaeróbico, envuelva el tubo que contiene la suspensión bacteriana con papel de aluminio y transfiéralo a una incubadora anaeróbica. Retire el papel de aluminio de la incubadora anaeróbica y reduzca la concentración de oxígeno en la incubadora al <3% bombeándola y llenándola de nitrógeno. Cierre el tubo de ensayo con un tapón de vidrio esmerilado, sáquelo después del sellado e incube en un baño de agua a 37 °C.
    3. Cada 6 h, tomar tres tubos de ensayo de cada uno de los dos grupos (aeróbicos/anaeróbicos) para observar el crecimiento del biofilm en la parte inferior, y tinte siguiendo el paso 4.3.
  3. Deseche la suspensión bacteriana y seque la biopelícula.
    1. Saque los tubos de ensayo en diferentes puntos de tiempo y aspire con cuidado la capa superior de la suspensión bacteriana. Observe la biopelícula blanca que se adhiere al fondo del tubo de ensayo.
      NOTA: Tenga cuidado de no alterar la biopelícula al aspirar la suspensión bacteriana.
    2. Agregue con cuidado 2 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a lo largo de la pared del tubo de ensayo, agítelo suavemente para lavar las bacterias planctónicas adsorbidas en la biopelícula y aspire cuidadosamente el tampón PBS.
    3. Coloque el tubo de ensayo con la biopelícula adsorbida en la parte inferior en el horno para que se seque durante 30 minutos.
  4. Tinción
    1. Saque los tubos de ensayo, agregue 2 ml de solución de tinción de violeta cristalino al 0,1% a cada tubo de ensayo y tiña las biopelículas durante 30 minutos a temperatura ambiente.
    2. Utilice una pipeta para aspirar cuidadosamente la solución de tinte violeta cristalino. Agregue con cuidado agua destilada a lo largo de la pared del tubo de ensayo para lavar la solución de tinte violeta cristalino restante, repitiendo 3x-5x hasta que el agua destilada agregada se vuelva casi incolora. Observe la biopelícula púrpura en la parte inferior del tubo de ensayo.
    3. Vuelve a secar el tubo de ensayo.
  5. Disuelva la biopelícula con etanol al 95% y mida la DO600 de la solución de biopelícula.
    1. Saque el tubo de ensayo seco, agregue 10 ml de etanol al 95% a cada tubo de ensayo y agite bien para asegurarse de que el cristal violeta se haya disuelto completamente en el etanol.
    2. Con un volumen de 200 μL por pocillo, agregue violeta cristalino en etanol a una placa de 96 pocillos y mida su absorbancia a una longitud de onda de 600 nm.
      NOTA: De acuerdo con la ley de Beer-Lambert, la absorbancia está relacionada linealmente con la concentración de la solución, por lo que el valor de OD600 puede reflejar la concentración de violeta cristalino, que refleja la cantidad de biopelícula en la suspensión bacteriana en diferentes momentos.

5. Prueba de quimiotaxis bacteriana

  1. Preparar placas de agar eutrófico diferencial.
    1. Consulte el Paso 1 para preparar un medio MH de media dosis que contenga agar al 0,5%, cada litro del cual contiene 11,8 g de triptona, 23,6 g de extracto de levadura, 9,4 g de K2HPO4, 2,2 g de KH2PO4 y 5 g de agar, pH ~ 7.
    2. Consulte el Paso 1 para preparar un medio 5x TB que contenga 0,5% de agar, cada litro del cual contiene 59 g de triptona, 118 g de extracto de levadura, 47 g de K2HPO4, 11 g de KH2PO4 y 5 g de agar, pH ~ 7.
    3. Esterilizar la solución en autoclave a 121 °C durante 20 min utilizando un tapón permeable al aire o una película selladora de botellas con una rejilla de ventilación.
    4. Antes de que el líquido se enfríe y solidifique, vierta 25 ml de caldo MH de media dosis (que contenga agar al 0,5%) por plato, cubra el plato con una tapa impresa en 3D y colóquelo en un gabinete de seguridad biológica. Después de enfriar, retire la tapa para observar el pozo cilíndrico (1,4 cm de diámetro) en el medio semisólido.
      NOTA: La tapa impresa en 3D con material de resina no se puede esterilizar con vapor a alta temperatura. Para matar las bacterias de la superficie, se puede rociar con etanol al 95% y luego irradiar con una lámpara UV durante 30 minutos en una cabina de seguridad biológica. Al quitar la tapa, aplique fuerza en la dirección vertical y levántela con cuidado para evitar daños al agar semisólido.
    5. Antes de que el caldo 5x TB (que contiene 0,5% de agar) se solidifique, use una pipeta para agregar el caldo 5x TB al pocillo en la placa semisólida hasta que el caldo esté al ras de la superficie del medio.
    6. Enfriar la placa en una cabina de seguridad biológica para obtener una placa de agar semisólida que contenga cuerpos eutróficos. Tenga cuidado de evitar la contaminación de la placa por microorganismos ambientales.
      NOTA: El medio semisólido sigue siendo algo fluido y, por lo tanto, debe enfriarse completamente antes de almacenarse boca abajo.
  2. Inoculación bacteriana, cultivo y fotografía
    1. Coloque la placa de agar con el medio de cultivo semisólido en una cabina de seguridad biológica y enfríela durante ~ 30 minutos bajo irradiación UV para evitar la contaminación bacteriana.
    2. Utilice una pipeta de 10 μL para absorber 4 μL de la suspensión bacteriana cultivada a un diámetro exterior de ~0,6-0,8, inserte la punta de la pipeta en el centro de las placas de Petri de plástico y pipetee la suspensión bacteriana.
    3. Espere a que la suspensión bacteriana se absorba en el medio durante 1 minuto. Cuando la suspensión bacteriana se haya absorbido por completo, divida la placa en dos grupos (aeróbicos/anaeróbicos) por triplicado.
    4. Selle el grupo aeróbico con cinta de sellado y coloque esas placas boca abajo en una incubadora bioquímica a 37 °C para cultivo estático. Selle el grupo anaeróbico en una caja anaeróbica como se describe en el paso 4.2, invirtiendo las placas a 37 °C para el crecimiento.
    5. Verifique la propagación y migración de bacterias cada 12 h (a las 0 h, 12 h, 24 h, 36 h y 48 h), y use el sistema de imágenes para tomar imágenes de la placa.
  3. Utilice el software ImageJ para calcular las distancias de migración bacteriana.
    1. Importe el archivo de imagen adquirido mediante el sistema de imágenes.
    2. Establece la barra de escala y aplícala a todas las imágenes.
      1. Al tomar imágenes, agregue una regla, cree un segmento de línea, seleccione un segmento de línea recta (por ejemplo, 1 cm, y luego establezca la longitud de este segmento de línea en 1 cm) y marque la longitud del tablero.
      2. Abra la ventana Establecer escala ; haga clic en Analizar | Establecer escala.
      3. Escriba la longitud real en Distancia conocida y Unidad de longitud.
      4. Compruebe Global.
      5. Introduzca la dirección de la carpeta de la imagen original y la dirección del archivo de salida.
    3. Utilice la herramienta de línea recta para seleccionar las comunidades una por una y ajustar la tolerancia hasta que la línea recta de la herramienta se ajuste al límite de la colonia bacteriana que se extiende a ambos lados.
    4. Mida la distancia de migración de la colonia desde el centro hasta ambos extremos por separado y derive la longitud en línea recta haciendo clic en Analizar | Medir.
    5. Repita los pasos 5.3.3-5.3.4 hasta que se midan todas las comunidades y guarde los resultados en un archivo de .csv para su posterior análisis.

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Resultados

Este trabajo describe los enfoques adoptados para caracterizar los microbios aislados del microbioma del huésped (Figura 1). Como prueba de concepto, se aislaron tres microbios del huésped de la rata SD (C. stationis, S. cohnii y E. faecalis), y se probaron dos microorganismos adquiridos comercialmente (S. aureus ATCC 25923 y E. faecalis V583) utilizando este protocolo. Para establecer los requerimientos de oxígeno de los microbios individuales us...

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Discusión

Aislar e identificar cinco especies de bacterias por métodos secuenciales. El crecimiento de las bacterias tiene requisitos mínimos de nutrientes: el medio mínimo: un medio que contiene solo sales inorgánicas, una fuente de carbono y agua. Aunque las bacterias del grupo experimental se encontraron en placas sólidas de MH, utilizamos media dosis de medio MH para verificar la quimiotaxis de las bacterias y obtuvimos buenos resultados. Sin embargo, también realizamos experimentos de control...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

El desarrollo de esta técnica contó con el apoyo de los fondos del Fondo de Investigación para Jóvenes Científicos Internacionales (22050410270) de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, el Fondo Especial de Shenzhen para la Innovación y el Emprendimiento de Talentos de Alto Nivel en el Extranjero Peacock Team (KQTD20170810111314625) y el Programa del Equipo de Investigación Innovadora y Empresarial de Guangdong (2019ZT08Y191). Nos gustaría ofrecer nuestro sincero agradecimiento a la señorita Chen Xinyi por su ayuda en la revisión del documento y la gestión del laboratorio.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Químico/Solución
% de colorante violeta cristalinoSolarbioG1062100 mL
AgarSigma-AldrichV900500Utilizado para obtener placas semisólidas, 20 g Tubo de
centrífugaCorning43079015 mL
Medio de tioglicolato fluidoKinghuntK000129.3 g
Mueller Hinton II Caldo medioSolarbioNO.11865100 g
Placas de PetriBkmanB-SLPYM90-15 Placas dePetri de plástico, circulares, 90 mm x 15 mm
Cloruro de potasioVETECWXBC4493V0,2 g
Dihidrógeno de potasio Fosfatoaladdin04-11-77580,24 g
Cloruro de sodioMacklinS8052758.0 g
Fosfato de sodio dibásicoaladdin7558-79-41.44 g
Excelente medio de caldo SolarbioLA2520200 g
Kits/ Equipo
Incubadora anaeróbicaLongyue
Incubadora bioquímicaBlue pardLRH-70
Lector de microplacas
Tanon 5200multi sistema de imagenTanon5200CE
Baño de agua termostáticoJinghongDK-S28
1Spark

Referencias

  1. Bernardi, S., et al. Combining culture and culture-independent methods reveals new microbial composition of halitosis patients' tongue biofilm. MicrobiologyOpen. 9 (2), 958(2020).
  2. Tellez, G., Latorre, J. D., Kuttappan, V. A., et al. Rye affects bacterial translocation, intestinal viscosity, microbiota composition and bone mineralization in Turkey poults. PLOS One. 10, (2015).
  3. Brewer, J. H. Clear liquid mediums for the "aerobic" cultivation of anaerobes. Journal of the American Medical Association. 115 (8), 598(1940).
  4. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  5. Liu, C., et al. The regulation of bacterial biofilm formation by cAMP-CRP: a mini-review. Frontiers in Microbiology. 11, 802(2020).
  6. Kumar, A., et al. Biofilms: survival and defense strategy for pathogens. International Journal of Medical Microbiology. , (2017).
  7. Penesyan, A., et al. Secondary effects of antibiotics on microbial biofilms. Frontiers in Microbiology. 11, 2109(2020).
  8. Bernardi, S., et al. Subinhibitory antibiotic concentrations enhance biofilm formation of clinical Enterococcus faecalis isolates. Antibiotics. 10 (7), 874(2021).
  9. Tsukatani, T., Fumihiko, S., Rieko, K. A rapid and simple measurement method for biofilm formation inhibitory activity using 96-pin microtiter plate lids. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 36 (12), 1-9 (2020).
  10. Hartmann, R., et al. Emergence of three-dimensional order and structure in growing biofilms. Nature Physics. 15, 251-256 (2019).
  11. Liu, Z., et al. Advances in bacterial biofilm management for maintaining microbiome homeostasis. Biotechnology Journal. 15 (10), 1900320(2020).
  12. Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Evolving concepts in biofilm infections. Cellular Microbiology. 11 (7), 1034-1043 (2009).
  13. Røder, H. L., et al. Enhanced bacterial mutualism through an evolved biofilm phenotype. The ISME Journal. 12 (11), 2608-2618 (2018).
  14. Matilla, M. A., Tino, K. The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity. FEMS Microbiology Reviews. 42 (1), 052(2018).
  15. Moreira, L. M., et al. Chemotactic signal transduction and phosphate metabolism as adaptive strategies during citrus canker induction by Xanthomonas citri. Functional & Integrative Genomics. 15 (2), 197-210 (2015).
  16. Konishi, H., et al. Bacterial chemotaxis towards polysaccharide pectin by pectin-binding protein. Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
  17. Kostic, A. D., et al. Fusobacterium nucleatum potentiates intestinal tumorigenesis and modulates the tumor-immune microenvironment. Cell Host & Microbe. 14 (2), 207-215 (2013).
  18. Kochan, T. J., et al. Updates to Clostridium difficile spore germination. Journal of Bacteriology. 200 (16), 00218(2018).

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