Genotipificación rápida de tejido de ratón utilizando extracto-N-Amp tejido Sigma PCR Kit

Hola, me llamo Linda y trabajo en el laboratorio del Dr. Edwin Niki en la Universidad de California en Irvine. Hoy les mostraré cómo utilizo el kit de extracción de tejidos PCR con SYBR Green de Stigma para genotipar rápidamente ratones transgénicos. Por lo general, uso este kit para genotipar nuestros ratones embrionarios cuando realizo cultivos celulares disociativos agudos y necesito determinar rápidamente el genotipo de nuestros ratones.

Pero para los fines de hoy, tenemos colas de ratones adultos en las cuales puedo mostrarles cómo uso este kit. Este protocolo incluye una digestión con ale rápida y la extracción de ADN, seguida de un rápido paso de neutralización. Luego utilizamos el ADN extraído en una PCR en tiempo real, donde podemos monitorear nuestros amplicones por PCR.

Entonces, si está listo, comencemos. Antes de empezar, queremos asegurarnos de que nuestro bloque térmico esté ajustado a 95 grados Celsius, de que el cyber green esté descongelado y se mantenga sobre hielo hasta que sea necesario, y de que nuestros otros reactivos se estén descongelando a temperatura ambiente. En mi recipiente con hielo, tengo los dos cebadores que usaremos para genotipificar, los cuales han sido diseñados específicamente para nuestro gen de interés y validados para QPCR.

También tengo mi control positivo para el gen de interés, mi control negativo y una muestra de tejido que ya he recolectado de un ratón adulto. Ahora, cuando recolecte su muestra de tejido, es muy importante ser extremadamente riguroso. Cuando recolectamos colas de ratones embrionarios, siempre enjuagamos nuestras pinzas con etanol al 70 % antes y entre cada recolección de tejido.

Y siempre enjuagamos primero las muestras de cola en TBS; debes preparar una mezcla maestra de la solución de preparación de tejido y de extracción de ADN para cada cola. Necesitarás 100 microlitros de la solución de extracción y 25 microlitros de la solución de preparación de tejido. Voy a usar mi pipeta P200 y puntas filtradas para medir 100 microlitros de la solución de extracción y 25 microlitros de la solución de preparación de tejido en un nuevo tubo eppendorf. Deberás mezclar tu solución maestra pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

Y así querrá añadir 125 microlitros de su mezcla maestra a su muestra de interés, asegurándose de que, si se trata de la cola de un ratón adulto, el extremo cortado quede completamente sumergido en la solución de la mezcla maestra, y puede agitarla suavemente con el dedo; luego incubarla a temperatura ambiente durante 10 minutos. Durante la incubación de 10 minutos, prepararé mi mezcla maestra verde favorita, que incluye la mezcla maestra verde cider que viene en el kit, agua milli Q o de grado PCR, y nuestros cebadores, algo de agua de grado PCR, y los cebadores directo e inverso. Eso es todo.

Ahora que ha finalizado la incubación de 10 minutos, debemos calentar y activar la reacción a 95 grados durante tres minutos. Ha finalizado la inactivación de tres minutos y ahora vamos a añadir la solución de neutralización proporcionada en el kit, agregando cien microlitros por reacción, y debes mezclar mediante vortex. Después de añadir el tampón de neutralización, tus muestras de ADN pueden almacenarse a cuatro grados Celsius hasta que estés listo para usarlas.

En realidad, queremos nuestro genotipo de inmediato. Por lo tanto, pasamos directamente a la QPCR; mis colas están neutralizadas y listas. Mi mezcla maestra de PCR con colorante cianogénico está preparada y tengo mis tubos de PCR dispuestos sobre un bloque frío.

Todo lo que voy a hacer ahora es agregar 16 microlitros de mi mezcla maestra a cada pocillo y luego añadir 4 microlitros del extracto mutualizado o 4 microlitros del control positivo o negativo a cada uno. Bueno, todo lo que estoy haciendo es añadir 16 microlitros de una mezcla maestra a cada uno de los pocillos. Luego, agregaré 4 microlitros del extracto neutralizado a los 60 microlitros de la mezcla maestra en el pocillo, para un volumen total de reacción de 20 microlitros.

Y haré lo mismo para el control positivo y negativo. Añadiendo cuatro microlitros a 16 microlitros con una mezcla maestra PPR. Una vez que todos se han añadido, puede taparlos con una tira de ocho tapas ópticamente transparentes.

Debe tener cuidado de no tocar la parte ópticamente clara de las tapas que están sobre sus muestras. Por eso estoy usando una toalla Kim para presionar las tapas y asegurarme de que estén bien selladas. He mezclado suavemente mediante vortex la mezcla de PCR y ADN y luego las he centrifugado, y ahora estamos listos para colocarlas en la máquina de QPCR.

Lo que vamos a hacer es primero cargar nuestras muestras en la máquina de PCR Opticon y voy a configurar una nueva placa, en la cual nuestro primer pocillo será nuestra muestra. Nuestro segundo pocillo será nuestro control positivo, y nuestro tercer pocillo será nuestro control negativo. Especificamos que nuestro volumen de reacción es de 20 microlitros en total. A continuación, voy a cargar un protocolo que fue diseñado para la genotipificación rápida de personas.

Este protocolo incluye un paso de desnaturalización de tres minutos, un ciclo de 15 segundos de desnaturalización, 15 segundos de hibridación primaria y luego 20 segundos de extensión primaria. Ahora bien, el tiempo de extensión primaria puede reducirse incluso a unos 10 segundos, lo que dará un total de solo 40 segundos por ciclo. Para cada ciclo, estos tres pasos se repiten aproximadamente 40 veces, como en una PCR normal, y al final se realiza una curva de desnaturalización.

Entonces, tenemos nuestra placa preparada y nuestro protocolo cargado. Todo lo que tenemos que hacer ahora es ejecutar nuestra QPCR y está comenzando con los tres minutos de desnaturalización. Según mi experiencia, utilizando los cebadores que estoy usando y las muestras de cola, y buscando los genes que estoy analizando, sé que mis resultados positivos comenzarán a aparecer alrededor del ciclo 25, cruzando un umbral de significancia de ciclo.

Ahora, el momento en que se produce este cruce depende en gran medida de la muestra de tejido, de lo que esté buscando y de la cantidad inicial de ADN presente. Así que ya podemos observar que nuestro control positivo ya ha dado resultado positivo y parece que nuestra muestra también es positiva. Como puede ver, comienza a aumentar un poco justo después de nuestro control positivo.

Todavía tendremos que esperar porque solo va en 27 ciclos, pero esperemos que en un par de ciclos más, podamos asegurarnos de que nuestra muestra es positiva y así pueda continuar con mi experimento. En este momento, pueden ver que el control negativo apenas comienza a aparecer, y eso se debe a que tomé un exceso de cola. Eso les ayuda a asegurarse de que cualquier resultado que aparezca antes que esta cola negativa excesiva será positivo.

Entonces, en este punto, cualquier cosa que aparezca antes del negativo, la consideraría positiva y continuaría con mi experimento. Una vez que la PCR finaliza los ciclos, la máquina realiza un análisis de curva de desnaturalización. Esto le ayudará a determinar la composición y pureza de su producto.

Con esto, puede determinar si eligió correctamente las muestras positivas y negativas. Por ejemplo, la muestra positiva tendrá un pico específico y definido de temperatura de fusión, que corresponde a un producto específico de PCR amplificado. Cualquier muestra negativa tendrá un pico amplio e inespecífico de temperatura de fusión, correspondiente al ADN inespecífico que se amplificó durante la PCR.

Así que acabo de mostrarles cómo utilizamos el kit Cyber Green de Sigma para genotipar rápidamente colas de ratones adultos. Sin embargo, este kit puede usarse con diversos tejidos animales, cabello, saliva, y yo lo utilizo para genotipar colas de embriones de ratón. Nos gusta usar este kit porque es rápido.

Puedo obtener mi genotipo en una hora, y es muy conveniente y sencillo. Así que gracias por vernos y buena suerte.