Name: Purificación de proteínas p53 ubiquitinadas a partir de células de mamíferos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Aprende a purificar proteínas p53 ubiquitinadas de células de mamíferos mediante transfección con liposomas y purificación con resina de níquel. Este método permite estudiar la regulación de la función proteica por ubiquitinación.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81972624) a D.L.

NOTA: Las células H1299 fueron amablemente proporcionadas por el Banco de Células Madre de la Academia China de Ciencias y se demostró que eran negativas para la contaminación por micoplasma.
1. Cultivo celular
<ol><li>Para el cultivo inicial, colocar 1 x 106 células de la línea celular de adenocarcinoma de pulmón humano, H1299 en una placa de Petri de 10 cm con 10-12 ml de RPMI 1640 medio suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% de aditivo de glutamina, 1% de piruvato de sodio y antibióticos (100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina). Mantener las células a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% deCO2. Divida las células cada 2-3 días dependiendo de cuándo alcancen el 80% -90% de confluencia.</li>
	<li>Un día antes de la transfección, preparar 6-9 x 10 6 células para tres placas de Petri y placa 2-3 x 106 células en una sola placa de Petri de 10 cm que contenga 10-12 ml de medio para lograr una confluencia de 70% -90% durante la transfección. NOTA: Las células HEK293T también se pueden utilizar para purificar proteínas ubiquitinadas debido a su alta eficiencia de transfección y nivel de expresión de proteínas.</li>
</ol>2. Transfección de plásmidos
<ol><li>Agregue 1.5 ml de medio sérico reducido en tres tubos centrífugos de 15 ml.</li>
	<li>Agregue ADN plásmido listo para la transfección a cada tubo para hacer diluciones de la siguiente manera. Tubo 1: 1 μg de plásmido Flag-p53, 12 μg de vector vacío; Tubo 2: 1 μg de plásmido Flag-p53, 3 μg de plásmido His-HA-Ub (HH-Ub) y 9 μg de vector vacío; Tubo 3: 1 μg de plásmido Flag-p53, 3 μg de plásmido HH-Ub y 9 μg de plásmido Mdm2. Agregue un total de 0,2 μg de plásmido de proteína fluorescente verde (GFP) a cada tubo para controlar la eficiencia de la transfección. NOTA: Se debe realizar un experimento piloto para determinar las cantidades óptimas de plásmidos necesarios para lograr una expresión eficiente de proteínas diana en las células.</li>
	<li>Agregue 78 μL de reactivo de transfección de liposomas a 4.5 ml de medio sérico reducido en otro tubo de centrífuga para diluir los liposomas. Mezclar bien moviendo el tubo y dejar reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Añadir 1,5 ml de la solución liposomal diluida en cada tubo del paso 2.2 que contiene 1,5 ml de la solución de ADN diluida. Mezclar bien y entrelazar los plásmidos con los liposomas durante al menos 20 minutos en RT. Utilice una relación ADN plásmido: liposomas de 1:2 (μg:μL) para cada transfección.</li>
	<li>Deseche el medio original de las placas de Petri y agregue 9 ml de medio sérico reducido en cada plato. Agregue 3 ml de la mezcla de liposomas y ADN a cada plato y mezcle la solución agitando suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás 3x, y luego izquierda y derecha 3x para una distribución uniforme de la mezcla en la placa.</li>
	<li>Cultivar las células en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% deCO2. Reemplace el medio después de 4-6 h y continúe cultivando las células durante 24-36 h.</li>
</ol>3. Recolección de células
<ol><li>Después de 24-36 h, tratar las células con MG132 a una concentración final de 10 μM durante 4-6 h. NOTA: MG132 es un aldehído peptídico que bloquea eficientemente la actividad proteolítica del complejo proteasómico 26S. Las cantidades de proteínas ubiquitinadas con cadenas de poliubiquitina ligadas a lisina-48 (K48) pueden aumentarse después de que las células se tratan con MG132 u otros inhibidores del proteasoma.</li>
	<li>Deseche el medio, lave las células 2 veces (teniendo cuidado de no eliminar las células) con solución salina tamponada con fosfato helado (PBS) y aspire las células con pipetas serológicas.</li>
	<li>Agregue 1 ml de PBS al plato, retire las células raspando con un raspador limpio y transfiera la suspensión celular a tubos de microcentrífuga. Centrifugar a 700 x g durante 5 min para recoger los gránulos celulares.</li>
</ol>4. Purificación de proteínas ubiquitinadas en condiciones no desnaturalizantes
<ol><li>Prepare el tampón de lisis Flag (50 mM Tris-HCl (pH 7.9), 137 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), 1% Triton X-100, 0.2% sarkosyl y 10% glycerol) recién suplementado con cóctel inhibidor de proteasa antes de su uso.</li>
	<li>Añadir 800 μL de tampón de lisis Flag helado a las celdas de cada tubo, mezclar las células con un oscilador de vórtice o una pipeta y, a continuación, incubar la mezcla en un rotador a 4 °C durante 30 min.</li>
	<li>Someta la mezcla a 5-10 pulsos breves de ultrasonido. Realice la ultrasonicación en el hielo a una frecuencia de sonicación de 20 kHZ y 80% de amplitud con cada pulso que dura 1 s. Incubar la mezcla en un rotador a 40 revoluciones por minuto (rpm) a 4 °C durante 30 min.</li>
	<li>Centrifugar las muestras ultrasónicas a 8.000 x g durante 20-30 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Alícuota 80 μL (1/10) del extracto celular y mezclar con 20 μL de 5x tampón de carga de dodecil sulfato de sodio (SDS). Hervir las muestras a 98 °C durante 5 minutos, enfriar en hielo durante 2 minutos y almacenar a -20 °C hasta su uso. Utilice estas muestras como grupo de entrada para controlar la expresión de proteínas.</li>
	<li>Añadir 30 μL de perlas conjugadas con anticuerpos anti-Flag M2 (Flag/M2) a los extractos celulares restantes e incubar en un rotador a 4 °C durante al menos 4 h o durante la noche.</li>
	<li>Centrifugar a 1.500 x g durante 2 min a 4 °C para recoger las perlas. Agregue 1 ml de tampón de lisis Flag helado a las perlas y mezcle invirtiendo el tubo varias veces.</li>
	<li>Centrifugar a 1.500 x g durante 2 min a 4 °C para recoger las perlas. Repita el paso 4.7 de 4 a 6 veces.</li>
	<li>Añadir 40 μL de péptidos Flag a una concentración final de 200 ng/μL a las perlas e incubar en un rotador a 4 °C durante 2 h para eluyir las proteínas unidas.</li>
	<li>Centrifugar a 1.500 x g durante 5 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Añadir 10 μL de tampón de carga 5x SDS, hervir la mezcla a 98 °C durante 5 min, enfriar en hielo durante 2 min, y almacenar a -20 °C para la Western blotting. Alternativamente, almacenar el eluido del paso 4.10 directamente a -80 °C para otros experimentos posteriores. NOTA: La cantidad de proteínas ubiquitinadas purificadas se puede ampliar aumentando el número de células y las cantidades de plásmidos transfectados. Se puede adaptar una estrategia de marcado de epítopos para purificar complejos celulares que se unen específicamente a p53 ubiquitinado en condiciones de purificación nativas. Al coexpresar Flag-p53, mdm2 y HA-ubiquitina, el complejo proteico p53 ubiquitinado puede ser inmunoprecipitado por agarosa secuencial conjugada con anticuerpos Flag y HA de células de mamíferos. Para mantener a los socios de unión de las proteínas p53 ubiquitinadas, se debe usar el tampón de lisis BC100 menos estricto (20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 100 mM NaCl, 10% de glicerol, 0.2 mM EDTA, 0.2% Triton X-100 y 1x inhibidor de proteasa) durante el proceso de purificación. El eluido del péptido HA se somete a espectrometría de masas para identificar todos los socios que se unen específicamente a p53 ubiquitinado.</li>
</ol>5. Purificación de proteínas ubiquitinadas en condiciones de desnaturalización
<ol><li>Añadir 1 ml de PBS helado a los gránulos celulares obtenidos en el paso 3.3 y mezclar uniformemente. Alícuota 100 μL (1/10 volumen) de la suspensión celular en un tubo de microcentrífuga como muestra de entrada.</li>
	<li>Centrifugar a 700 x g durante 5 min a 4 °C para recoger los gránulos celulares. Añadir 80 μL de tampón de lisis Flag a la muestra de entrada, mezclar las células con un oscilador de vórtice o una pipeta, y lisar las células en hielo durante 1 h.</li>
	<li>Centrifugar a 8.000 x g durante 20-30 min a 4 °C. Alícuota 80 μL del sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Añadir 20 μL de tampón de carga 5x SDS al sobrenadante, hervir a 98 °C durante 5-10 min, enfriar en hielo durante 2 min y almacenar a -20 °C hasta su uso.</li>
	<li>Centrifugar los 900 μL restantes de la suspensión celular a 700 x g durante 5 min a 4 °C para recoger el pellet celular. Agregue 1 ml de tampón de ubiquitina 1 (tampón UB 1; 6 M guanidina-HCI, 0.1 M Na 2 HPO 4, 6.8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8.0) y0.2% Triton X-100, recién suplementado con 10 mM β-mercaptoetanol y 5 mM de imidazol) a los gránulos celulares y mezcle varias veces pipeteando hacia arriba y hacia abajo para distribuir uniformemente las células. NOTA: La concentración de imidazol puede variar de 5 mM a 20 mM para disminuir la unión de proteínas no específicas en la resina cargada de níquel. El tampón de ubiquitina contiene clorhidrato de guanidina, que inactiva tanto las ligasas como los DUB. β-mercaptoetanol es un líquido transparente e incoloro con un olor fuerte y desagradable similar a los huevos podridos. Una solución de alta concentración causará daños graves a la membrana mucosa, el tracto respiratorio superior, la piel y los ojos. Use guantes y gafas y opere en la campana extractora.</li>
	<li>Someter los lisados celulares a 10-20 rondas de ultrasonidos hasta que la solución ya no sea viscosa. Realice la ultrasonicación en el hielo a una frecuencia de sonicación de 20 kHZ y 80% de amplitud con cada pulso que dura 1 s. Centrifugar a 8.000 x g durante 20-30 min a RT y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Añadir 30 μL de resina cargada de níquel al sobrenadante e incubar en un rotador ajustado a 15 rpm durante 4 h o durante la noche a RT. Centrifugar a 1.500 x g durante 2 min en RT para recoger las perlas.</li>
	<li>Añadir 1 ml de tampón UB 1, incubar con rotación en un agitador durante 10 min a RT, y centrifugar a 1.500 x g durante 2 min a RT para recoger las perlas.</li>
	<li>Añadir 1 ml de tampón de ubiquitina 2 (tampón UB 2; 8 M urea, 0,1 M Na 2 HPO 4, 6,8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) y 0,2% Triton X-100) a las perlas, incubar con rotación en un agitador durante 10 min a RT, y centrifugar a 1.500 x g durante2min para recoger las perlas. Repita esto una vez más.</li>
	<li>A las perlas, agregue 1 ml de PBS, incubar con rotación en un agitador durante 10 minutos en RT y centrifugar a 1,500 x g durante 2 minutos en RT para recolectar las perlas. Repita esto una vez más.</li>
	<li>Eluyente unido a proteínas incubando las perlas con 40 μL de imidazol a una concentración final de 0,5 M durante 1 h a RT. Centrifugar a 1.500 x g durante 2 min a RT.</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio, agregue 10 μL de tampón de carga SDS 5x, hierva a 98 °C durante 5 minutos, enfríe en hielo durante 2 minutos y guárdelo a -20 °C para la Western blotting. Alternativamente, almacenar el eluido sin procesar a -80 °C para otros experimentos posteriores.</li>
</ol>6. Detección de proteínas ubiquitinadas purificadas por Western blot
<ol><li>Resolver las muestras de los pasos 4.11 y 5.12 mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), y luego transferirlas a una membrana de nitrocelulosa mediante Western blotting para detectar proteínas diana utilizando los anticuerpos correspondientes como se describe18.</li>
	<li>En resumen, incubar la membrana sumergiendo en 20 ml de solución de bloqueo que contenga 5% de leche en polvo en tampón TBST (15 mM Tris-HCI; pH = 7.6, 4.6 mM Tris-base, 150 mM NaCI, recién suplementado con 0.1% Tween-20 antes de su uso) en RT durante 1 h. A continuación, incubar la membrana con anticuerpos primarios a RT durante 2 h o durante la noche a 4 °C. Use los siguientes anticuerpos para cada conjunto. Todos los anticuerpos primarios se utilizaron en una dilución de 1:1000.<ol><li>Detectar la proteína p53 total, incluida la p53 ubiquitinada, con un anticuerpo monoclonal anti-p53 después de la inmunoprecipitación con perlas de agarosa Flag/M2.</li>
		<li>Detectar proteínas p53 ubiquitinadas con un anticuerpo anti-HA o anticuerpo antiubiquitina después de la inmunoprecipitación con perlas de agarosa Flag/M2.</li>
		<li>Detecte proteínas p53 ubiquitinadas con un anticuerpo monoclonal anti-p53 después de la extracción de resina cargada de níquel.</li>
		<li>Detectar proteína ubiquitinada total con un anticuerpo anti-HA o anticuerpo antiubiquitina después de la extracción de resina cargada de níquel.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubar la membrana con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) a RT durante 1 h después de lavar 3x con tampón TBST durante 5 min cada uno. Todos los anticuerpos secundarios se utilizaron en una dilución de 1:3000. Luego, lave la membrana con tampón TBST 3x durante 5 minutos cada uno con una agitación suave.</li>
	<li>Inicie el sistema de imágenes de quimioluminiscencia para detectar señales de Western blotting. Preparar la solución de sustrato para HRP mezclando las soluciones A y B en una proporción de 1:1.</li>
	<li>Coloque la membrana de nitrocelulosa en la cámara oscura boca arriba y cubra la solución de sustrato uniformemente sobre la membrana con una pistola de pipeteo. Seleccione el procedimiento de exposición automática para capturar señales quimioluminiscentes y ajuste manualmente el tiempo de exposición hasta que se adquiera una señal ideal.</li>
</ol>

<ol><li>Kwon, Y. T., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+code+in+the+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).</li>
<li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li>
<li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+ligases%3A+Structure%2C+function%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li>
<li>Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-binding+domains+-+from+structures+to+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-binding domains - from structures to functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).</li>
<li>Oh, E., Akopian, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+ubiquitin-dependent+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles of ubiquitin-dependent signaling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).</li>
<li>Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+chains%3A+deubiquitylating+enzyme+specificity+begets+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).</li>
<li>Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deubiquitylating+enzymes+and+drug+discovery%3A+emerging+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).</li>
<li>Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfing+the+p53+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Surfing the p53 network.</a> Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).</li>
<li>Boutelle, A. M., Attardi, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+and+Tumor+suppression%3A+It+takes+a+network%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p53 and Tumor suppression: It takes a network.</a> Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).</li>
<li>Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53%3A+800+million+years+of+evolution+and+40+years+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).</li>
<li>Vousden, K. H., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blinded+by+the+light%3A+The+growing+complexity+of+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Blinded by the light: The growing complexity of p53.</a> Cell. 137 (3), 413-431 (2009).</li>
<li>Brooks, C. L., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+ubiquitination%3A+Mdm2+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond.</a> Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).</li>
<li>Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+modifications%3A+exquisite+decorations+of+the+powerful+guardian%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian.</a> Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).</li>
<li>Dobbelstein, M., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2%3A+Open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Mdm2: Open questions.</a> Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).</li>
<li>Kulikov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2+facilitates+the+association+of+p53+with+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mono-+versus+polyubiquitination%3A+differential+control+of+p53+fate+by+Mdm2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2.</a> Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).</li>
<li>Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+purification+of+ubiquitinated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for the purification of ubiquitinated proteins.</a> Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).</li>
<li>Green, M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+M+%22Molecular+Cloning+A+Laboratory+Manual.+%28Fourth+Edition%29%22">Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition)</a>. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. 28(2012).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

La ubiquitinación juega un papel crítico en casi todos los procesos celulares fisiológicos y patológicos2. En los últimos años, se ha avanzado mucho en la comprensión del papel molecular de la ubiquitina en las vías de señalización y cómo los cambios en el sistema de ubiquitina conducen a diferentes enfermedades humanas2. La purificación de proteínas ubiquitinadas contribuye a proporcionar información sobre los roles exactos de ubiquitinación en estos procesos. Las mezclas ...

La ubiquitina es una proteína evolutivamente conservada de 76 aminoácidos 1,2,3. La ubiquitina se une covalentemente a los residuos de lisina en las proteínas diana a través de cascadas que involucran enzimas activadoras (E1), conjugadas (E2) y ligasas (E3). La ubiquitina es activada primero por la enzima E1 y luego se transfiere a las enzimas conjugadoras E2. Posteriormente, las ligasas de ubiquitina E3 interactúan tanto con las enzimas E2 cargadas de ubiquitina como con las proteínas de sustrato y median la formación de un enlace isopeptídico entre el C-terminal de ubiquitina y un residuo de lisina en el sustrato 1,2,3,4,5. La ubiquitinación implica la unión de restos de ubiquitina a residuos de lisina en proteínas de sustrato o a sí misma, lo que lleva a la monoubiquitinación de proteínas o poliubiquitinación. Este proceso de ubiquitinación ocurre intracelularmente en eucariotas y regula una gran variedad de procesos biológicos. La ubiquitinación resulta en la degradación de proteínas sustrato a través del sistema ubiquitina-proteasoma 1,2,3,4,5. Además, la ubiquitinación modula la localización subcelular de proteínas, la formación de complejos proteicos y el tráfico de proteínas en las células 3,5. Las fracciones de ubiquitina ligadas a proteínas sustrato pueden ser eliminadas por enzimas desubiquitinantes (DUB)6,7. En particular, las diferentes formas en que se ensamblan las cadenas de ubiquitina proporcionan una miríada de medios para regular diversos procesos biológicos 1,5. Los roles exactos de la ubiquitinación en la regulación de la función de la proteína sustrato siguen sin entenderse completamente hasta ahora. La purificación de proteínas ubiquitinadas contribuye a la elucidación de los efectos de la ubiquitinación de proteínas en una variedad de procesos celulares.
La proteína p53 es una de las proteínas supresoras de tumores más importantes y exhibe mutaciones genéticas o inactivación en casi todos los cánceres humanos 8,9,10,11. La estabilidad y la actividad de p53 están delicadamente reguladas in vivo mediante modificaciones postraduccionales, incluyendo ubiquitinación, fosforilación, acetilación y metilación12,13. La proteína p53 tiene una vida media corta que varía de 6 min a 40 min en varias células, lo que resulta principalmente de su poliubiquitinación y posterior degradación proteasómica10,12. El ratón doble minuto 2 (Mdm2) es una ubiquitina ligasa E3 de p53 que se une al N-terminal de p53 para inhibir su actividad transcripcional12,14,15. Mdm2 promueve la poliubiquitinación y degradación proteasómica de p53 para controlar su estabilidad e induce la monoubiquitinación de p53 para facilitar su exportación nuclear12,14,15,16. Aquí, la ubiquitinación de p53 mediada por Mdm2 se utiliza como ejemplo para introducir un método para la purificación de proteínas ubiquitinadas de células de mamíferos en detalle. Los reguladores que influyen en el estado de ubiquitinación de las proteínas diana se pueden identificar utilizando este ensayo de ubiquitinación in vivo cuando se sobreexpresan o se derriban / eliminan en células de mamíferos. Además, las proteínas ubiquitinadas se pueden utilizar como sustratos para el ensayo de desubiquitinación in vitro. Se puede realizar un cribado de alto rendimiento para identificar DUB específicos para proteínas diana mediante la incubación de sustratos ubiquitinados con DUB individuales. Las proteínas ubiquitinadas pueden actuar como un andamio para reclutar proteínas de señalización aguas abajo en las células. Un complejo de proteína diana ubiquitinado puede purificarse mediante inmunoprecipitación secuencial en condiciones de purificación nativas e identificarse mediante espectrometría de masas. El protocolo actual se puede utilizar ampliamente para investigar las proteínas celulares reguladas por ubiquitinación.
Se han establecido varios métodos para purificar proteínas ubiquitinadas, que incluyen el uso de ubiquitina marcada por afinidad, anticuerpos de ubiquitina, proteínas de unión a ubiquitina y dominios aislados de unión a ubiquitina (UBD)17. Aquí, proporcionamos un protocolo que utiliza ubiquitina marcada con afinidad como mediador para purificar proteínas ubiquitinadas en células de mamíferos. El uso de ubiquitina poli-marcada con His ofrece ventajas sobre los otros métodos. Las proteínas ubiquitinadas se purifican en presencia de desnaturalizantes fuertes, lo que reduce la unión no específica a la resina cargada de níquel mediante la linealización de proteínas celulares y la interrupción de las interacciones proteína-proteína. Por el contrario, el uso de anticuerpos contra la ubiquitina, proteínas de unión a ubiquitina y UBD aisladas como mediadores no puede excluir eficazmente a los socios de unión de la proteína diana porque la purificación debe realizarse en condiciones menos estrictas. Además, la purificación también puede conducir a una mayor unión de proteínas no relacionadas utilizando estos mediadores. Además, existe una propensión a la unión a varios tipos de enlaces de ubiquitina, así como a la mono y poliubiquitinación por proteínas de unión a ubiquitina o UBD aisladas17. El uso de ubiquitina poli-marcada con His contribuye a derribar todas las proteínas ubiquitinizadas celulares. Alternativamente, el uso de agarosa conjugada con anticuerpos anti-Flag o anti-HA disponibles comercialmente facilita la inmunoprecipitación de proteínas diana marcadas con Flag o HA a gran escala en condiciones no desnaturalizantes. Un segundo paso de purificación, por ejemplo, mediante resina cargada de níquel dirigida a ubiquitina poli-marcada con His, se puede utilizar para adquirir proteínas diana ubiquitinadas con una alta pureza para experimentos posteriores. En particular, una estrategia de purificación de marcado de epítopos se puede adaptar cuando no se puede adquirir un anticuerpo específico para inmunoprecipitar proteínas diana de manera efectiva. Finalmente, la purificación de proteínas ubiquitinadas en células de mamíferos, en comparación con la purificación in vitro, conserva el modo de enlace de ubiquitina de las proteínas diana en condiciones más fisiológicas.

<table><tbody><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sangon Biotech</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL IgG de ratón, Ab entero ligado a HRP (de ovejas)</td><td>GE healthcare</td><td>NA931</td><td>Antibdoy secundario</td></tr><tr><td>Amersham ECL Rata IgG, Ab entero ligado a HRP (de burro)</td><td>GE healthcare</td><td>NA935</td><td>Antibdoy secundario Anti-Flag</td></tr><tr><td>M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td>FLAG/M2 perlas</td></tr><tr><td>Anticuerpo monocolonal anti-GFP</td><td>Santa cruz</td><td>sc-9996</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Anti-HA de alta afinidad</td><td>11867423001 Roche</td><td></td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Anticuerpo monocolonal anti-Mdm2 (SMP14)</td><td>Santa cruz</td><td>sc-965</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>primario Anticuerpo monocolonal anti-p53 (DO-1)</td><td>Santa cruz</td><td>sc-126</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Alddich</td><td>E5134</td><td>solvente</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>VivaCell</td><td>C04001-500</td><td>FBS</td></tr><tr><td>FLAG Péptido</td><td>Sigma-Alddich</td><td>F3290</td><td>Preparar tampón de elución</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>suplemento Guanidina-HCI</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100287-0500</td><td>solvente</td></tr><tr><td>H1299</td><td>Banco de células madre, Academia China de Ciencias Laboratorio de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imagen</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>software</td></tr><tr><td>Immidazol</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500529-0100</td><td>disolvente</td></tr><tr><td>Immobilon Western Chemiluminiscent HRP Substrate</td><td>Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 reactivos</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Reactivo de transfección</td></tr><tr><td>MG132</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-13259</td><td>Inhibidor del proteasoma</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Disolvente Sangon Biotech</td><td>A501727-0500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610476-0005</td><td>disolvente</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Alddich</td><td>201154</td><td>disolvente</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501726-0500</td><td>Agarosa</td></tr><tr><td>Ni-NTA Resina</td> cargada con níquel <td>QIAGEN</td><td>30230</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de transferencia de nitrocelulosa</td><td>GE healthcare</td><td>10600002</td><td>0,45 y micro; m tamaño de poro</td></tr><tr><td>Opti-MEM medio sérico reducido</td><td>Gibco</td><td>31985-070 Medio de</td><td>transfección</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-cv</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607011-0100</td><td>antibiótico</td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de la proteasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Industrias</td><td>Biológicas 01-100-1ACS</td><td>medio</td></tr><tr><td>Sarkosyl</td><td>Sigma-Alddich</td><td>L5777</td><td>disolvente</td></tr><tr><td>SDS Tampón de carga</td><td>Beyotime</td><td>P0015L</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>suplemento</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501492-0005</td><td>disolvente</td></tr><tr><td>Tris-HCI</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610103-0250</td><td>disolvente</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech</td><td>A110694-0500</td><td>reactivo</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100777-0500</td><td></td></tr><tr><td>suplemento Sistema de imagen de quimioluminiscencia de ultra alta sensibilidad</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>ChemiDoc XRS+</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sangon Biotech</td><td>A510907-0500</td><td>solvente</td></tr></tbody></table>

purificación de proteínas p53 ubiquitinadas a partir de células de mamíferos

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

La ubiquitinación es un tipo de modificación postraduccional que regula no solo la estabilidad sino también la localización y función de una proteína sustrato. El proceso de ubiquitinación ocurre intracelularmente en eucariotas y regula casi todos los procesos biológicos celulares básicos. La purificación de proteínas ubiquitinadas ayuda a la investigación del papel de la ubiquitinación en el control de la función de las proteínas de sustrato. Aquí, se describe un procedimiento paso a paso para purificar proteínas ubiquitinadas en células de mamíferos con la proteína supresora de tumores p53 como ejemplo. Las proteínas p53 ubiquitinadas se purificaron bajo estrictas condiciones no desnaturalizantes y desnaturalizantes. La proteína p53 marcada con Flag celular total se purificó con agarosa conjugada con anticuerpos anti-Flag en condiciones no desnaturalizantes. Alternativamente, la proteína ubiquitinada marcada con His celular total se purificó utilizando resina cargada de níquel en condiciones de desnaturalización. Las proteínas p53 ubiquitinadas en los eluidos se detectaron con éxito con anticuerpos específicos. Usando este procedimiento, las formas ubiquitinadas de una proteína dada pueden purificarse eficientemente a partir de células de mamíferos, facilitando estudios sobre el papel de la ubiquitinación en la regulación de la función de las proteínas.

El diagrama esquemático muestra las proteínas p53 (Flag-p53) y ubiquitina doble marcada con His/HA (HH-Ub) (Figura 1A). Los procedimientos utilizados para purificar las proteínas ubiquitinadas se resumen en la Figura 1B. La ubiquitina marcada con Poly-His se puede ligar a proteínas diana en células de mamíferos. Las proteínas ubiquitinadas pueden purificarse con perlas Flag/M2 en condiciones no desnaturalizantes o mediante cromatografía de afinidad iónica metáli...

El protocolo describe un método paso a paso para purificar proteínas ubiquitinadas de células de mamíferos utilizando la proteína supresora de tumores p53 como ejemplo. Las proteínas p53 ubiquitinadas se purificaron de células bajo estrictas condiciones no desnaturalizantes y desnaturalizantes.

Purificación de proteínas p53 ubiquitinadas a partir de células de mamíferos

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Usando este protocolo, las formas ubiquitinadas de una proteína dada pueden purificarse eficientemente a partir de células de mamíferos, facilitando estudios sobre el papel de la ubiquitinación en la regulación de la función de las proteínas. La purificación de proteínas ubiquitinadas en células de mamíferos en comparación con la purificación in vitro mantiene el modo de enlace de ubiquitina de las proteínas diana en condiciones más radiológicas. Comience agregando 1.5 mililitros de medio sérico reducido en tres tubos de centrífuga de 15 mililitros.Agregue ADN plásmido listo para la transfección a cada tubo y agregue 0.2 microgramos de plásmido de proteína fluorescente verde para monitorear la eficiencia de la transfección. Agregue 78 microlitros de reactivo de transfección de liposomas a 4,5 mililitros de medio sérico reducido en otro tubo de centrífuga para diluir los liposomas. Mezcle bien moviendo el tubo y luego déjelo reposar durante cinco minutos a temperatura ambiente.Agregue 1,5 mililitros de la solución liposomal diluida en cada tubo que contenga 1,5 mililitros de la solución de ADN diluida. Mezcle bien y entregue los plásmidos con los liposomas durante al menos 20 minuto

purification-of-ubiquitinated-p53-proteins-from-mammalian-cells

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Ubiquitinación es una modificación postraduccional clave llevadas a cabo por un conjunto de tres enzimas. Las mutaciones de los genes implicados en esta modificación se asocian con muchas enfermedades humanas diferentes. Aquí se describen los protocolos para detectar la ubiquitinación de proteínas en las células...

La detección de ubiquitinación de proteínas

Este video describe un método para extraer y purificar péptidos ubiquitinilados que contienen péptidos di-glicina remanentes de una mezcla compleja de péptidos. El método presentado puede ayudar a identificar los sitios originales de ubiquitinación en la proteína.

Extracción basada en inmunoafinidad de péptidos ubiquitinilados: una técnica para extraer selectivamente péptidos marcados con ubiquitina a partir de fracciones de péptidos purificados

El método descrito aquí es un nuevo protocolo de aislamiento de la vesícula, que permite la purificación de los compartimentos celulares donde se procesan los antígenos exógenos por degradación retículo endoplasmático asociado en presentación cruzada.

Purificación del compartimento de la membrana de retículo endoplasmático asociado degradación de antígenos exógenos en presentación cruzada

A diferencia de ligasas de ubiquitina ligasas E3 SUMO algunos han sido identificados. Este modificado en vitro protocolo de sumoilación es capaz de identificar nuevos SUMO E3 ligasas por un ensayo de reconstitución en vitro .

In Vitro Ensayo de la sumoilación estudiar SUMO E3 ligasa actividad

Presentamos un método para la purificación, detección e identificación de péptidos digliquenados que se originan a partir de proteínas ubiquitinadas a partir de muestras biológicas complejas. El método presentado es reproducible, robusto y supera a los métodos publicados con respecto al nivel de profundidad del análisis ubiquitinome.

Detección de sitios de ubiquitinación de proteínas por enriquecimiento de péptidos y espectrometría de masas

La ubiquitinación es una modificación post-traduccional que desempeña un papel importante en los procesos celulares y está estrechamente coordinada por la desubiquitinación. Los defectos en ambas reacciones subyacen a patologías humanas. Proporcionamos protocolos para la realización de la ubiquitinación y la reacción de desubiquitinación in vitro utilizando componentes purificados.

Ensayos in Vitro Ubiquitination y Deubiquitination de histonas nucleosomales

Este protocolo tiene como objetivo establecer proteomes específicos de ubiquitina (Ub) y ubiquitinas (Ubls) con el fin de identificar alteraciones de este tipo de modificaciones post-traduccionales (PtM), asociadas a una condición específica como un tratamiento o un fenotipo.

Perfilado de Ubiquitina y Ubiquitina-como Modificaciones Post-traduccionales dependientes e Identificación de Alteraciones Significativas

Este método describe la evaluación de los cambios globales en la topología de la cadena de ubiquitina. La evaluación se realiza mediante la aplicación de un enfoque proteómico específico basado en espectrometría de masas.

Análisis de la cadena de ubiquitina por monitoreo paralelo de reacciones

Proporcionamos un protocolo detallado para un ensayo de ubiquitilación de un sustrato específico y una ubiquitina ligasa E3 en células de mamíferos. Se utilizaron líneas celulares HEK293T para la sobreexpresión de proteínas, el sustrato poliubiquitilado se purificó a partir de lisados celulares por inmunoprecipitación y se resolvió en SDS-PAGE. Se utilizó immunoblotting para visualizar esta modificación post-traduccional.

Evaluación de la ubiquitilación del sustrato por E3 Ubiquitina-ligasa en lisados de células de mamíferos

La ubiquitinación es un regulador crítico de las funciones intracelulares de las proteínas. Aquí describimos dos métodos de lisis celular para detectar los niveles de ubiquitinación de proteínas del sustrato en células de mamíferos y comparamos su eficacia para analizar los niveles de ubiquitinación. La sobreexpresión de proteínas en HEK293T células fue inducida por transfección transitoria, y proteínas ubiquitinadas fueron detectadas mediante análisis de western blot.

Estrategias comparativas para la detección de ubiquitinación en lisados celulares de mamíferos utilizando SMAD2/SMURF2 como modelo

Este protocolo describe un método para ubiquitinar Streptococcus pneumoniae utilizando lisado celular de mamífero o complejo enzimático puro de ubiquitina puro, seguido de un tratamiento con complejo proteico purificado VCP/p97-UFD1-NPLOC4 para evaluar su actividad bacteriolítica, permitiendo el estudio de efectores inmunitarios dependientes de ubiquitina.

In vitro Reconstitución de la ubiquitinación bacteriana y eliminación mediada por VCP/p97

Aprende a purificar proteínas p53 ubiquitinadas de células de mamíferos mediante transfección con liposomas y purificación con resina de níquel. Este método permite estudiar la regulación de la función proteica por ubiquitinación.

Purificación de proteínas p53 ubiquitinadas a partir de células de mamíferos

Explorar más videos