Cicatrización de heridas corneales de pez cebra: de la abrasión al análisis de imágenes de cierre de heridas

Este protocolo se centra en dañar la superficie ocular del pez cebra a través de la abrasión para evaluar el posterior cierre de la herida a nivel celular. Este enfoque explota una rebaba ocular para eliminar parcialmente el epitelio corneal y utiliza microscopía electrónica de barrido para rastrear los cambios en la morfología celular durante el cierre de la herida.

La transparencia corneal es fundamental para despejar la vista. En un contexto patológico, esta transparencia puede ser un desafío. El estudio del mecanismo de patogénesis requiere modelos simples que tengan una alta similitud con los órganos humanos.

En estos aspectos, el pez cebra es un excelente modelo. Y esta es la primera descripción detallada de la abrasión corneal en el pez cebra. Esta técnica es una forma simple y rápida de inducir la entrada de superficie al ojo.

El cierre de la herida se puede seguir fácilmente después de la abrasión. Además, se pueden agregar productos químicos, o factores específicos, al agua del tanque para estudiar su impacto en el cierre de la herida. Como la herida se crea manualmente, el método requiere algo de práctica para obtener resultados consistentes.

Antes del experimento, prepare una solución de trabajo al 0,02% de tricaína. Descongelar 2 mL de solución de stock al 0,4%. Añadir a 40 ml de agua del sistema.

Y coloque la solución en un recipiente pequeño. Tenga la rebaba oftálmica lista verificando si la punta de la rebaba está limpia. Y si es necesario, retire los restos celulares con un hisopo de algodón húmedo.

Haga una incisión en el costado de una esponja suave. Y humedezca la esponja con agua del sistema. Coloque la esponja en el escenario de un microscopio de disección.

Asegúrese de tener suficiente espacio de trabajo para usar la rebaba. Y suficiente iluminación desde el lado y hacia arriba para ver la superficie del ojo correctamente. Coloque suavemente el pescado anestesiado con una cuchara en la incisión en la esponja con la cabeza sobresaliendo de la superficie de la esponja.

Acérquese cuidadosamente a la superficie del ojo con la punta de la rebaba. Y comience a mover la punta en la superficie del ojo con un movimiento circular. Cuando se realice la abrasión, coloque cuidadosamente el pescado en el agua dulce del sistema que contiene analgésico para su recuperación.

Limpie la rebaba inmediatamente después de su uso con un hisopo de algodón húmedo. Recoja el pescado en el punto de tiempo deseado y colóquelo en una solución de 0.02% de tricaína. Mantenga al animal en la solución hasta que el movimiento opercular haya cesado por completo y el pez no reaccione al tacto.

Coloque el pescado en una placa de Petri con una cuchara y sosténgalo con pinzas. Decapita a los peces con tijeras de disección. Evite hacer rasguños en la superficie del ojo.

Coloque el tejido en un tubo de muestra que contenga 0,1 M de fosfato de sodio. Y enjuáguelo con un tampón limpio para que no quede sangre en la solución. Fije el tejido en glutaraldehído al 2,5% en fosfato de sodio 0,1 M durante 24 horas a 4 C.Retire la solución fijadora y enjuague la muestra varias veces con fosfato de sodio 0,1 M.

Diseccionar la muestra colocándola sobre una gota de fosfato de sodio de 0,1 M en una placa de disección. Corte la muestra de cabeza en dos con tijeras de disección finas. Alternativamente, recoja los ojos colocando cuidadosamente las puntas de las pinzas finas en las cuencas de los ojos desde el lado del ojo.

Luego, saque el ojo de la cuenca y retire el tejido adicional. Transfiera la muestra disecada a un tubo que contenga 0,1 M de fosfato de sodio. Asegúrese de que no haya tejido adicional en el tubo de muestra, ya que puede adherirse a la parte superior del ojo durante el procesamiento de la muestra.

Coloque el soporte con la pestaña en un soporte. Y el soporte a la base de un microscopio de disección. Coloque suavemente la muestra de tejido en el soporte con pinzas finas, la córnea hacia arriba.

Cubra la muestra con platino utilizando el dispositivo apropiado. Y guarde las muestras a temperatura ambiente hasta la obtención de imágenes. Adquirir imágenes de la ampliación deseada.

Y use imágenes de 2000 a 2500x para el análisis. Ajuste el brillo y el contraste para ver claramente todos los bordes celulares y microneveras. Y evita las áreas sobreexpuestas en la imagen.

Abra la imagen TIFF con Fiji ImageJ 1.53. Y use una barra de escala para establecer la escala. Cree una línea igual a la barra de escala con la herramienta Línea.

Seleccione Analizar. A continuación, establezca la escala. Y escriba la distancia conocida.

Luego, abra el administrador de ROI usando el menú Analizar, Herramientas. Para el tamaño y la redondez de la celda, seleccione Analizar, Establecer medidas, Descriptores de forma. Y use la herramienta Lupa para ver las celdas bajo aumento.

Seleccione celdas con la herramienta Polígono y agregue cada selección al administrador de ROI. Finalmente, mida las celdas seleccionadas y guarde la medición. Para continuar con el análisis de microridge, asegúrese de que la imagen esté en formato de 8 bits haciendo clic en el menú Imagen, Tipo.

A continuación, seleccione la celda con la herramienta Polígono. Y borra el fondo haciendo clic en Editar y, a continuación, en Borrar fuera. Suaviza la imagen de una a tres veces seleccionando Procesar, Suavizar.

Y ajuste el brillo y el contraste de Imagen, Ajustar, Brillo / Contraste, para que las microneveras se destaquen lo más claramente posible. Convolve la imagen haciendo clic en Proceso, Filtros, Convolve. Y conviértalo en binario haciendo clic en Procesar, Binario, Hacer binario.

A continuación, esqueletice la imagen en blanco y negro seleccionando Procesar, Binario, Esqueletizar. Utilice la función Esqueleto analizado para medir los parámetros de microridge y guardar los valores. El área de la herida se cierra a las tres horas después de la herida.

Pero el sitio donde se unen los bordes de la herida sigue siendo visible. Los resultados mostraron que en el epitelio corneal desgastado se pueden observar microneveras en algunas células alargadas junto al sitio de la herida. En algunas regiones periféricas, las microneveras se pierden del centro de la célula.

Una comparación entre las dos regiones periféricas, mostró células alargadas con microneveras promedio más cortas, lo que indica reordenamientos celulares como reacción a la herida. Estos resultados sugieren que los cambios en la forma celular se correlacionan con la modificación de la micronega y enfatizan la heterogeneidad dentro del epitelio corneal en la respuesta de la herida. Recuerda que la operación requiere entrenamiento para realizar una herida homogénea y reproducible.

Además de la microscopía electrónica, el tejido se puede utilizar para histología, tinciones inmunológicas e hibridación in situ. Estos proporcionarán más información sobre los cambios celulares y moleculares durante la cicatrización de heridas. El uso del pez cebra amplía nuestro conocimiento sobre la biología corneal.

Además, este modelo es excelente para estudios farmacológicos y se puede utilizar para comprender más sobre la evolución ocular.