Name: Cromatografía de exclusión de tamaño para separar vesículas extracelulares de medios de cultivo celular condicionados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Aprende a separar vesículas extracelulares de medios de cultivo condicionados mediante cromatografía de exclusión de tamaño. Este protocolo permite caracterizar la carga vesicular y estudiar mecanismos de comunicación intercelular de forma sencilla.

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Los autores desean agradecer a Penn State Behrend y a la Fundación de Salud Hamot por la financiación, así como a la Instalación de Microscopía de Penn State en University Park, PA.

<ol><li>Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+evidence+for+externalization+of+the+transferrin+receptor+in+vesicular+form+in+sheep+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).</li>
<li>Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+endocytosis+of+transferrin+and+recycling+of+the+transferrin+receptor+in+rat+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).</li>
<li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Rontogianni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+extracellular+vesicles+allows+for+human+breast+cancer+subtyping%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping.</a> Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).</li>
<li>Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+circulating+cancer+biomarkers%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges.</a> Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14(2018).</li>
<li>Thompson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+neurodegenerative+disease-pathogenesis+to+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).</li>
<li>O'Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake%2C+functionality%2C+and+re-release+of+extracellular+vesicle-encapsulated+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo.</a> Cell Reports. 39 (2), 110651(2022).</li>
<li>Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+extracellular+vesicles+and+release+of+their+cargo+from+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes.</a> ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).</li>
<li>Willms, E., Cabañas, C., Mäger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+heterogeneity%3A+Subpopulations%2C+isolation+techniques%2C+and+diverse+functions+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression.</a> Frontiers in Immunology. 9, 738(2018).</li>
<li>Tzaridis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+separation+techniques+impact+results+from+human+blood+samples%3A+Considerations+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211(2021).</li>
<li>Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+isolation+and+separation+techniques+for+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles.</a> Journal of Chromatography A. 1636, 461773(2021).</li>
<li>Gámez-Valero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-exclusion+chromatography-based+isolation+minimally+alters+extracellular+vesicles%27+characteristics+compared+to+precipitating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li>
<li>Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+functionality+of+extracellular+vesicles+isolated+using+size-exclusion+chromatography+compared+to+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).</li>
<li>Campos-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+detection+of+extracellular+vesicles+immune-captured+from+urine+by+conventional+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2042(2019).</li>
<li>Norman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1CAM+is+not+associated+with+extracellular+vesicles+in+human+cerebrospinal+fluid+or+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma.</a> Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Mathieu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificities+of+exosome+versus+small+ectosome+secretion+revealed+by+live+intracellular+tracking+of+CD63+and+CD9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+simplified+dichotomic+size-exclusion+chromatography+for+isolating+extracellular+vesicles+toward+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145(2021).</li>
<li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359(2010).</li>
<li>Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+macromolecular+complexes+for+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3239(2007).</li>
<li>Williams, R. L., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+shape+of+the+ESCRT+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The emerging shape of the ESCRT machinery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).</li>
<li>Willms, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+release+subpopulations+of+exosomes+with+distinct+molecular+and+biological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foetal+bovine+serum+influence+on+in+vitro+extracellular+vesicle+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061(2021).</li>
<li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).</li>
<li>Böing, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+isolation+of+extracellular+vesicles+by+size-exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li>
<li>Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three+step+protocol+to+isolate+extracellular+vesicles+from+plasma+or+cell+culture+medium+with+both+high+yield+and+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450(2020).</li>
<li>Guerreiro, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+extracellular+vesicle+isolation+by+combining+cell+media+modifications%2C+ultrafiltration%2C+and+size-exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography.</a> PLoS ONE. 13 (9), 02024276(2018).</li>
<li>Onódi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-purity+extracellular+vesicles+by+the+combination+of+iodixanol+density+gradient+ultracentrifugation+and+bind-elute+chromatography+from+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1479(2018).</li>
<li>Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-isolation+of+extracellular+vesicles+and+high-density+lipoproteins+using+density+gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

SEC es un método fácil de usar para separar adecuadamente los vehículos eléctricos de los CCM acondicionados. Para aislar específicamente las EV derivadas de células, se debe tener en cuenta cuidadosamente el tipo de MCP y sus suplementos. Muchos medios de cultivo celular deben complementarse con FBS, que contiene EV derivados del animal en el que se recolectó el suero. Estos EV séricos pueden saturar y enmascarar cualquier señal producida por EVs derivada de células en cultivo26. Por lo tanto, al...

La explosión de interés en el estudio de vesículas extracelulares (EV) ha ido acompañada de importantes avances en las tecnologías y técnicas utilizadas para separar y estudiar estas partículas heterogéneas de tamaño nanométrico. En el tiempo transcurrido desde su descubrimiento hace casi cuatro décadas1,2, se ha encontrado que estas pequeñas estructuras membranosas contienen lípidos bioactivos, ácidos nucleicos y proteínas, y desempeñan un papel importante en la comunicación intercelular 3,4. Los EV se liberan de todos los tipos de células y, por lo tanto, están presentes en todos los fluidos biológicos, incluidos el plasma sanguíneo y el suero, la saliva y la orina. Los EV dentro de estos fluidos son muy prometedores para servir como biomarcadores no invasivos para diversas enfermedades, incluidas enfermedades neuroinflamatorias y neurodegenerativas, cánceres y trastornos autoinmunes 5,6,7. Además, se pueden realizar estudios mecanicistas in vitro mediante técnicas de cultivo celular separando las EV liberadas en el medio de cultivo 3,8,9.
Para comprender el papel de las EV en la fisiopatología de la enfermedad, es primordial una separación adecuada del líquido en el que se encuentran. El estándar de oro para la separación de EV ha sido durante mucho tiempo la ultracentrifugación diferencial (dUC)10, sin embargo, han surgido técnicas más sofisticadas para lograr una mejor separación de los EV de otros componentes extracelulares. Algunas de estas técnicas incluyen gradientes de densidad, fracción de flujo de campo asimétrico (A4F), citometría de flujo, inmunocaptura, precipitación de polietilenglicol y cromatografía de exclusión de tamaño (SEC)11,12,13. Cada técnica tiene su propio conjunto de ventajas y desventajas; sin embargo, se ha demostrado que la SEC en particular separa los EV de los fluidos biológicos y los sobrenadantes de cultivo celular de manera bastante efectiva 8,14,15. SEC también tiene la ventaja adicional de ser relativamente sencillo y fácil de usar.
SEC es un método que separa los componentes de un fluido en función del tamaño. Con esta técnica, se utiliza una columna de resina (ya sea hecha internamente o comprada comercialmente) para fraccionar una muestra. Las partículas pequeñas en la muestra quedan atrapadas entre las perlas dentro de la resina, mientras que las partículas más grandes pueden pasar a través de la resina más libremente y, por lo tanto, eluir antes en el proceso. Debido a que los EV son más grandes en tamaño que muchas proteínas extracelulares y agregados de proteínas, los EV pasan a través de la columna más rápido y eluyen en fracciones más tempranas que las proteínas extracelulares14.
En este documento de métodos, se describe el uso de SEC para la separación de EV de medios de cultivo celular (CCM) de oligodendrocitos humanos bajo condiciones de estrés de retículo endoplásmico (RE) y control. Usando este protocolo, se muestra que los EV separados con esta técnica se encuentran dentro de fracciones específicas que pueden agruparse y concentrarse para la caracterización posterior, y que los EV separados se derivan de células y no de una fuente exógena como el suero bovino fetal (FBS) utilizado para complementar el CCM. La presencia de los marcadores canónicos de EV, CD63, CD81 y CD916,17,18,19 en las fracciones EV, y su ausencia en las fracciones proteicas se demuestra con western blotting. Usando microscopía electrónica de transmisión (TEM), los EV se visualizan y muestran la morfología esperada y solo se observan en la fracción EV. Las partículas también se cuentan en las fracciones EV y proteica de las condiciones de estrés de control y ER, y se observa un gran número de partículas dentro del rango de tamaño esperado de 50-200 nm de diámetro en las muestras EV. Juntos, estos datos apoyan la noción de que SEC es un método eficiente y efectivo para separar los EV de los medios de cultivo celular.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>VWR</td><td>97064-588</td><td></td></tr><tr><td>4X Tampón de muestras Laemmli</td><td>BioRad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-15, Ultracel, 3 KDa, 15 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC900308</td> Corte de <td>3 kDa</td></tr><tr><td>Unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-2 con membrana Ultracel-3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC200324</td><td>corte de 3 kDa</td></tr><tr><td>Amonio Persulfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-100G</td><td></td></tr><tr><td>Anti conejo IgG, anticuerpo ligado a HRP</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>7074V</td><td>1:1000 Dilución Anticuerpo</td></tr><tr><td>anti-Calnexina</td><td>Abcam</td><td>&nbsp; ab22595</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>monoclonal de ratón anti-CD9 de dilución</td> 1:500 <td>BioLegend</td><td>312102</td><td>1:500 Anticuerpo</td></tr><tr><td>anti-GM130 de dilución [EP892Y] - cis-Golgi Marker</td><td>Abcam</td><td>ab52649</td><td>Dilución 1:500</td></tr><tr><td>Anti-IgG de ratón, tecnología de señalización celular de anticuerpos ligados a HRP</td><td></td><td>7076V</td><td>1:1000 Dilución</td></tr><tr><td>Colector automático de fracciones</td><td>Izon Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo BCA</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara CCD</td><td>Gatan Orius SC200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cd63 Ratón anti BD humano</td><td></td><td>556019</td> 1<td>:1000 Dilución 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD81</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-23962</td><td>Dilución 1:1000</td></tr><tr><td>Cellstar Tapa de filtro Matraces de cultivo celular</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP Generador de imágenes</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Sustrato</td><td>BioRad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>desoxicolato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-10G</td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitol</td><td>Sigma</td><td>3483-12-3</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Glucosa alta con L-glutamina; sin sodio</td><td>Cytiva</td><td>SH300022. FS</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino de primera calidad</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, sin exosoma</td><td>Thermo Scientific</td><td>A2720801</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>BioRad</td><td>1610718</td><td></td></tr><tr><td>Leche en polvo descremada de gran valor</td><td>Amazon</td><td>B076NRD2TZ</td><td></td></tr><tr><td>HOG Línea celular de oligodendroglioma humano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCC163</td><td></td></tr><tr><td>Izon Science Usa Ltd qev Columnas de exclusión de tamaño 5pk</td><td>Izon Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol >99.8% ACS</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Placas de vidrio</td><td>BioRad</td><td></td><td>1653310 con espaciadores de 0,75 mm</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Placas cortas</td><td>BioRad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina,Solución</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP66150</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Kits de ensayo y reactivos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Membranas de transferencia de PVDF</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Western Blotting Papel de filtro</td><td>Thermo Scientific</td><td>84783</td><td></td></tr><tr><td>Polioxietileno-20 (TWEEN 20), 500 ml</td><td>Bio Basic</td><td>TB0560</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa/fosfatasa (100X)</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>5872S</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo recombinante anti-TSG101 [EPR7130(B)]</td><td>ABCam</td><td>ab125011</td><td>dilución 1:1000</td></tr><tr><td>Hidróxido de slodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SX0603</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP922I-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-500G</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio,&ge; 99.0% (GC), pellets libres de polvo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75746-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>TGX Kit de acrilamida FastCast sin manchas, 10%</td><td>BioRad</td><td>Microscopio</td> electrónico de transmisión 1610183 <td></td></tr><tr><td></td><td>FEI Tecnai 12 Biotwin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>BioRad</td><td>1610716</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 0,25% proteasa con tripsina porcina, HBSS, EDTA; sin calcio, magnesio</td><td>Cytiva</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>Tunicamycin</td><td>Tocris</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Zeta Ver software</td><td>Analytik</td><td></td><td>NTA software</td></tr></tbody></table>

cromatografía de exclusión de tamaño para separar vesículas extracelulares de medios de cultivo celular condicionados

Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media

Las vesículas extracelulares (EV) son estructuras unidas a la membrana lipídica de tamaño nanométrico que se liberan de todas las células, están presentes en todos los biofluidos y contienen proteínas, ácidos nucleicos y lípidos que reflejan la célula madre de la que se derivan. La separación adecuada de los EV de otros componentes en una muestra permite la caracterización de su carga asociada y brinda información sobre su potencial como comunicadores intercelulares y biomarcadores no invasivos para numerosas enfermedades. En el estudio actual, los EV derivados de oligodendrocitos se aislaron de medios de cultivo celular utilizando una combinación de técnicas de vanguardia, incluida la ultrafiltración y la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) para separar los EV de otras proteínas extracelulares y complejos de proteínas. Utilizando columnas SEC disponibles comercialmente, los EV se separaron de las proteínas extracelulares liberadas de las células de oligodendroglioma humano bajo condiciones de estrés de retículo endoplásmico (RE) y de control. Los marcadores canónicos de EV CD9, CD63 y CD81 se observaron en las fracciones 1-4, pero no en las fracciones 5-8. GM130, una proteína del aparato de Golgi, y calnexina, una proteína integral del RE, se utilizaron como marcadores EV negativos, y no se observaron en ninguna fracción. Además, al agrupar y concentrar las fracciones 1-4 como la fracción EV, y las fracciones 5-8 como la fracción de proteína, se observó la expresión de CD63, CD81 y CD9 en la fracción EV. La expresión de GM130 o calnexina no se observó en ninguno de los tipos de fracción. Las fracciones agrupadas de las condiciones de estrés de control y ER se visualizaron con microscopía electrónica de transmisión y se observaron vesículas en las fracciones EV, pero no en las fracciones de proteínas. Las partículas en el EV y las fracciones de proteínas de ambas condiciones también se cuantificaron con análisis de seguimiento de nanopartículas. Juntos, estos datos demuestran que SEC es un método eficaz para separar los EV de los medios de cultivo celular condicionados.

Western blot revela una separación adecuada de los vehículos eléctricos de CCM Para evaluar la efectividad de SEC para separar EVs de medios de cultivo celular, se ejecutó un western blot utilizando cada fracción individual de las muestras de control para sondear la expresión de los tres marcadores canónicos de EV, CD9, CD63 y CD81, así como GM130 y calnexina18, que se utilizaron como controles negativos (Figura 3). La expresión de albúmina<sup cla...

El protocolo aquí demuestra que las vesículas extracelulares pueden separarse adecuadamente de los medios de cultivo celular condicionados utilizando cromatografía de exclusión de tamaño.

Cromatografía de exclusión de tamaño para separar vesículas extracelulares de medios de cultivo celular condicionados

Extracellular vesicles (EVs) are nano-sized lipid-membrane bound structures that are released from all cells, are present in all biofluids, and contain ...

La separación de vesículas extracelulares de fluidos como los medios de cultivo celular de condición puede permitir a los investigadores caracterizar la carga vesticular y explorar sus mecanismos de comunicación intracelular. Esta técnica permite una separación suficiente de EV y proteínas extracelulares de medios de cultivo celular condicionados que es sencilla y fácil de usar. Para comenzar, coloque PBS en un baño de agua de 37 grados centígrados.Observar los matraces de cultivo celular de control y tratados con tunicamicina bajo un microscopio compuesto con una lente objetivo de 10 x y 100 x. Tome nota de cualquier diferencia entre los frascos. Retirar el medio del matraz y colocarlo en un tubo de 50 mililitros.Luego centrifugar el tubo a 500 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y transferir el súper nadante a un nuevo tubo. Centrifugar el tubo a 2000 G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el súper nadante a un tubo nuevo y colóquelo en hielo.Tome cuatro unidades de ultrafiltración de corte de 15 mililitros y tres kilodaltons y agregue cinco mililitros de PBS a cada tubo. Prepare los filtros centrifugando las unidades a 4, 000 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de eliminar el PBS de las unidades, divida el sobrenadante de las condiciones de control y tratadas en dos unidades de ultrafiltración, cada una con aproximadamente 12.5 mililitros de medios en cada una.Centrifugar los tubos a 4, 000 G durante una hora y 45 minutos a cuatro grados centígrados o hasta que el medio concentrado o retentado en cada unidad se concentre a 250 microlitros o menos. Transfiera el retención de ambas unidades de control a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros etiquetado y de las unidades tratadas a otro tubo. Mida el volumen total del retenente en cada tubo de microcentrífuga.Si el volumen es inferior a 500 microlitros, agregue 0,22 micras de PBS filtrado hasta que el volumen final sea de 500 microlitros. Coloque los tubos en un congelador de menos 80 grados centígrados. Encienda el colector automático de fracciones o AFC.Retire la columna de cuatro grados centígrados y permita que la columna se caliente a temperatura ambiente. Retire las muestras retenidas del congelador de menos 80 grados centígrados y colóquelas en hielo para descongelar, mientras espera, coloque ocho tubos etiquetados de 1.5 mililitros en el carrusel AFC con tapas hacia adentro. Inserte la columna en el AFC con el código de barras frente al lector y ajuste la configuración para recolectar ocho fracciones de 500 microlitros cada una y almacenar el volumen de búfer por defecto.A continuación, compruebe las instrucciones en pantalla para iniciar la recopilación. Después de que el búfer de almacenamiento se absorbe completamente en la parte superior de la matriz de columna. Comience a enjuagar la columna agregando 15 mililitros de PBS a la columna.No agregue PBS demasiado pronto, ya que diluirá el tampón de almacenamiento y evitará el lavado adecuado. Justo antes de que los 15 mililitros de PBS sean absorbidos por la matriz, haga clic en OK para detener el lavado y eliminar cualquier PBS residual de la parte superior de la matriz de la columna con una micropipeta. No toque la matriz.Agregue 500 microlitros de muestra al centro de la columna y haga clic en Aceptar para comenzar la ejecución. Después de que la muestra se absorba completamente en la matriz, agregue inmediatamente ocho mililitros de PBS a la columna. AFC disipa automáticamente el volumen vacío en el centro del carrusel antes de recolectar las ocho fracciones de 500 microlitros cada una.Después de la carrera, retire las fracciones del carrusel y colóquelas en hielo. A continuación, retire el volumen vacío del centro del carrusel. A continuación, agregue 10 mililitros de PBS a la columna para lavar cualquier muestra residual de la columna.Y una vez que la muestra arrepentida se haya enjuagado por completo, agregue 15 mililitros de PBS a la columna. A medida que el PBS final está siendo absorbido por la matriz, agregue 500 microlitros de hidróxido de sodio molar 0.5 al centro de la matriz de la columna. Luego, a medida que se absorbe el hidróxido de sodio, agregue 30 mililitros de PBS a la columna y déjelo enjuagar.Una vez hecho con todas las muestras, conserve la columna para su uso posterior agregando 15 mililitros de azida de sodio al 0,05% a la columna. Deje aproximadamente cinco mililitros de azida de sodio en la parte superior de la matriz de la columna. Retire la columna del AFC y coloque las tapas superior e inferior antes de colocar la columna a cuatro grados centígrados para su almacenamiento.Construir la unidad de ultra filtración. Obtenga dos mililitros, tres unidades de ultrafiltración de corte kilodalton por muestra. Cada unidad se compone de tres partes, cono, filtro y flujo a través del cilindro.Etiquete cada parte correctamente. Agregue un mililitro de PBS a la porción del filtro y cubra con la pieza del cono. Centrifugar el lado del cono de la unidad de ultrafiltración hacia arriba a 3, 500 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y retirar el PBS filtrado del cilindro de flujo a través.Voltee la unidad de ultrafiltración boca abajo y centrifugar durante dos minutos a 1000 G a cuatro grados centígrados para eliminar cualquier PBS restante. Combine cuatro 500 microlitros de cada fracción y agréguelos a la unidad de ultrafiltración. Luego, las columnas de centrífuga coinciden durante una hora, 45 minutos a 3, 500 G a cuatro grados centígrados o hasta que el nivel de retentación es de 100 microlitros.Retire el flujo a través del cilindro y deseche el flujo a través. Voltee la unidad de ultrafiltración boca abajo y centrifugar durante dos minutos a 1000 XG a cuatro grados centígrados. Transfiera el retentado en el cono a un tubo de 1.5 mililitros y haga el volumen de muestra a 150 microlitros con PBS filtrado de 0.22 micrones antes de colocar los tubos en un congelador de menos 80 grados centígrados.Un bloque occidental representativo de fracciones individuales mostró una fuerte expresión de CD9, CD63 y CD81. Infracciones de uno a cuatro con poca o ninguna expresión infracciones de cinco a ocho. No se observó expresión de GM130 o calnexina en ninguna fracción.La albúmina sólo estaba presente en las fracciones seis a ocho. También se evaluó la efectividad de concentrar las fracciones EV y proteica. Se observó expresión de CD9 y CD63 en los lisados celulares.Las tres proteínas CD estaban presentes en las fracciones EV de las muestras tratadas con tunicamicina y control, pero no en las fracciones de proteínas. El gen de susceptibilidad tumoral 101 estaba presente en los lisados celulares, pero no en las fracciones EV o proteicas. El GM130 y la calnexina sólo se observaron en los lisados celulares.En el western blot de los medios de cultivo celular agotados con exosomas, los marcadores EV estaban presentes en los lisados celulares, pero no en las muestras de medios. Se observó expresión de albúmina en las fracciones proteicas y mínima expresión en los lisados celulares. Las observaciones de TEM demostraron estructuras esféricas en las fracciones EV de las muestras de control y tratadas con tunicamicina.Estas estructuras no se observaron en ninguna de las fracciones proteicas del tipo muestral. El análisis de seguimiento de nanopartículas revela diferencias en las concentraciones de partículas de control y fracciones tratadas en fracciones EV en comparación con el control, ligeramente más partículas estaban presentes en el tratamiento con tunicamicina. Sin embargo, en las fracciones de proteínas, se detectaron menos partículas en relación con los EV.Es importante tener el mismo volumen de muestra para las condiciones de control y tratadas, lo que permite una fácil comparación de los EV de los diferentes tratamientos. Después de separar los EVs de los medios de cultivo celular de la condición, podemos caracterizar el contenido de proteínas, ARN y lípidos de las vesículas con secuenciación de ARN proteómica y lipidómica.

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Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Fuente: Watson, D. C., et al. Aislamiento y purificación escalables de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias. J. Vis. Exp. (2021)Este video demuestra el uso de la cromatografía de exclusión por tamaño con perlas de resina porosa para aislar vesículas extracelulares (EV) bacterianas de un filtrado de cultivo bacteriano. Los EV más grandes eluyen temprano al evitar los poros de la resina, mientras que las proteínas más pequeñas ingresan a los poros y se eluyen más tarde.

Aislamiento de vesículas extracelulares bacterianas mediante cromatografía de exclusión por tamaño 

Este video describe un método basado en cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para aislar vesículas extracelulares o EV derivadas de las células inmunitarias del cerebro: la microglía. Los VE actúan como carga molecular para administrar mediadores, que regulan una respuesta inmunitaria. Por lo tanto, los EV aislados se pueden utilizar como modelo in vitro para estudiar la diafonía entre la microglía y las neuronas durante una respuesta inmunitaria neuronal.

Aislamiento basado en SEC de vesículas extracelulares derivadas de la microglía: una técnica para aislar vesículas extracelulares de medios de cultivo condicionados por la microglía

Este video demuestra el método de purificación basado en ultracentrifugación en gradiente de densidad para aislar subpoblaciones de vesículas extracelulares adecuadas para estudios de caracterización.

Purificación de subpoblaciones de vesículas extracelulares: una técnica para purificar subpoblaciones de vesículas extracelulares mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad

En este video, demostramos una técnica, la cromatografía de exclusión por tamaño, para separar una población heterogénea de vesículas de membrana externa o OMV derivadas de bacterias. Estas vesículas son estructuras esféricas de tamaño nanométrico y se separan en subpoblaciones grandes y pequeñas en función de su tamaño mediante cromatografía de exclusión por tamaño.

Separación de vesículas extracelulares bacterianas basadas en cromatografía de exclusión por tamaño: una técnica para separar poblaciones heterogéneas de vesículas de membrana externa bacterianas gramnegativas en función de su tamaño

Este video muestra la técnica de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para purificar vesículas extracelulares (EV) bacterianas del filtrado de cultivo de Mycobacterium tuberculosis (Mtb). La técnica utiliza una columna porosa empaquetada de resina para obtener fracciones purificadas de EV. Las partículas porosas permiten selectivamente que las proteínas más pequeñas entren en los poros, lo que resulta en una elución más lenta. Al mismo tiempo, los EV están excluidos de entrar en los...

Una técnica de cromatografía de exclusión por tamaño para purificar vesículas extracelulares micobacterianas

Este artículo presenta métodos para generar, purificar y cuantificar vesículas extracelulares de Caenorhabditis elegans.

Purificación y análisis de las vesículas extracelulares de Caenorhabditis elegans

Las vesículas bacterianas desempeñan un papel importante en la patogénesis y tienen aplicaciones biotecnológicas prometedoras. La heterogeneidad de las vesículas complica el análisis y el uso; por lo tanto, es necesario un método simple y reproducible para separar los diferentes tamaños de vesículas. Aquí, demostramos el uso de la cromatografía de exclusión de tamaño para separar vesículas heterogéneas producidas por Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Cromatografía de exclusión de tamaño para analizar la heterogeneidad de las vesículas de la membrana externa bacteriana

Las bacterias secretan vesículas extracelulares (EV) de tamaño nanométrico que transportan moléculas biológicas bioactivas. La investigación EV se centra en comprender su biogénesis, su papel en las interacciones y enfermedades microbio-microbio y huésped-microbio, así como sus posibles aplicaciones terapéuticas. Se presenta un flujo de trabajo para el aislamiento escalable de vehículos eléctricos de varias bacterias para facilitar la estandarización de la investigación de vehículos eléctricos.

Aislamiento escalable y purificación de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias

Las vesículas extracelulares son muy prometedoras para las aplicaciones biomédicas, pero los métodos de aislamiento actuales requieren mucho tiempo y no son prácticos para el uso clínico. En este estudio, presentamos un dispositivo microfluídico que permite el aislamiento directo de vesículas extracelulares de grandes volúmenes de biofluidos de forma continua y con pasos mínimos.

Aislamiento en un solo paso de vesículas extracelulares a partir de muestras de gran volumen con un dispositivo microfluídico A4F bifurcado

Este protocolo proporciona una descripción detallada de la clasificación de las vesículas extracelulares (VE) liberadas por las células estromales mesenquimales. En particular, se centra en el ajuste del instrumento y la optimización de las condiciones de clasificación. El objetivo es clasificar las vesículas extracelulares preservando sus características.

Establecer una clasificación exitosa para el aislamiento de vesículas extracelulares

Este protocolo describe el aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y la médula ósea mediante digestión enzimática y cromatografía de exclusión de tamaño, permitiendo la recuperación reproducible de fracciones enriquecidas con vesículas de tejidos estructuralmente complejos y de bajo rendimiento para análisis molecular posteriores.

Aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y médula ósea mediante cromatografía de exclusión de tamaño

Aprende a separar vesículas extracelulares de medios de cultivo condicionados mediante cromatografía de exclusión de tamaño. Este protocolo permite caracterizar la carga vesicular y estudiar mecanismos de comunicación intercelular de forma sencilla.

Cromatografía de exclusión de tamaño para separar vesículas extracelulares de medios de cultivo celular condicionados

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