Preparación y caracterización de biotinta de hidrogel biohíbrida 3D basada en grafeno para neuroingeniería periférica

El sistema de células madre está bajo la influencia de sus componentes importantes. La preservación y diferenciación de las células madre es impensable sin la presencia de su microambiente. Este microambiente, llamado nicho de células madre, consiste en células y andamios.

La neuropatía periférica puede ser y, ocasionalmente, pueden ser como lesiones en el plexo braquial, diversos traumatismos, tumores, anomalías autonómicas, definición inmune y enfermedad metabólica. Se han desarrollado varios métodos de cultivo 3D para proporcionar un nicho mejor y más natural para las células madre. La formación de esferoides y la bioimpresión 3D son métodos relativamente nuevos y prometedores para los cultivos 3D.

La bioimpresión 3D también se puede utilizar en estudios de neuroingeniería. En consecuencia, dentro de este estudio, se desarrollaron y estudiaron biotintas a base de grafeno y alginato / gelatina por sus características regenerativas. Para comenzar, cultive células madre mesenquimales gelatinosas de Wharton o WJMSCs en medio DMEM F12 que contenga 10% de suero fetal de ternera o FBS, 1% de pluma/estreptococo y 1% de L-glutamina bajo un flujo laminar estéril a temperatura ambiente.

Cuando las células cultivadas estén 80% confluentes en el matraz, vierta el medio y lave las células con cinco mililitros de PBS. Luego agregue cinco mililitros de 0.25% de tripsina y 2.21 milimolar de sodio EDTA e incube a 37 grados centígrados. Después de cinco minutos, agregue 10 mililitros de medio DMEM F12 que contiene 10% FBS a las células.

Suspenda las células, recoja el medio y transfiéralo a un tubo centrífugo. A continuación, centrifugar las células y desechar el sobrenadante antes de volver a sembrar las células en un nuevo matraz con un medio nutriente fresco que contenga 10% de FBS. Para preparar la biotinta del grupo de control sin grafeno, pese 4,5 miligramos de alginato y 1,5 miligramos de gelatina y transfiéralos a un tubo de centrífuga.

Luego agregue 50 mililitros de DMEM F12 medio que contiene 10% FBS al tubo. Una vez más, pesar 4,5 miligramos de alginato y 1,5 miligramos de gelatina y transferirlos a un tubo de centrífuga. Luego agregue 50 microlitros de 0.1% de grafeno al tubo y haga el volumen de 50 mililitros con DMEM F12 medio que contiene 10% FBS.

Mezcle las biotintas pipeteando y vórtice antes de esterilizarlas en autoclave a 121 grados centígrados por debajo de 1,5. presión atmosférica durante 20 minutos. Después del autoclave, centrifugar la solución para eliminar las burbujas formadas y colocar las biotintas a 37 grados centígrados hasta que las células estén preparadas.

Para la interacción de biotinta celular, cree los grupos de biotinta. El grupo uno incluye 3D-B y 3D-G impreso con biotinta para bioimpresión. El grupo dos incluye biotintas 3D-BS y 3D-GS en las que se formaron esferoides después de la bioimpresión.

Para el grupo uno, cuente las células de una por 10 a la séptima celda en 0,5 mililitros de medio. Luego agregue 4.5 mililitros de biotinta. Transfiera la mezcla a los cartuchos en el gabinete estéril usando jeringas.

Instale los cartuchos en la sección del extrusor correspondiente de la bioimpresora. Para el segundo grupo, tome cinco mililitros de biotinta de cada uno de los grupos de biotinta y transfiéralos a cartuchos estériles con la ayuda de un inyector. Utilice la bioimpresora con dos cabezales de impresión coaxiales y la tecnología de extrusión neumática.

Establezca la resolución XYZ por micro paso en 1,25 micrómetros, el ancho de extrusión en 400 micrómetros y la altura de extrusión en 200 micrómetros. Utilice una cuadrícula de 20 por 20 por 5 milímetros para crear modelos 3D. Cree modelos 3D utilizando programas CAD basados en web de código abierto.

Para el proceso de bioimpresión 3D, ajuste la presión promedio de la impresora a 7.5 psi. A continuación, ajuste la temperatura del cartucho y de la cama a 37 grados centígrados y la velocidad al 60%. Coloque el sistema en la posición inicial durante la fase de escritura. Coloque los ejes automáticamente y seleccione y configure el extrusor antes de iniciar el proceso de bioimpresión.

Después de la impresión, retire la muestra y colóquela debajo de un gabinete de flujo laminar. A continuación, rocíe las biotintas con 0,1 solución normal de cloruro de calcio o agregue una solución de mililitro con una pipeta a temperatura ambiente y espere de 10 a 20 segundos. Luego lave los patrones impresos dos veces con PBS que contenga calcio y magnesio.

Agregue dos mililitros de DMEM F12 medio con 10% FBS encima de cada celda que contenga grupo de biotinta e incube las placas a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos. A continuación, agregue dos mililitros de medio de suspensión que contenga una por 10 a la sexta celda a cada grupo e incube las placas. Después de 24 horas, observe y fotografíe todos los lotes de biotinta para la formación de esferoides bajo un microscopio invertido para la diferenciación de WJMSCs a células similares a neuronas, excepto para el grupo de control.

Añadir dos mililitros de medio de diferenciación neurogénica por pocillo y refrescar cada dos días. Siga durante siete días para observar la diferenciación neuronal. A continuación, utilizando imágenes de lapso de tiempo, examine los efectos del grafeno en las células madre y monitoree las interacciones celulares dentro de la biotinta.

El efecto de la concentración de grafeno en la proliferación celular se demuestra aquí. En comparación con el control, se observó una disminución significativa para la concentración de grafeno al 0,001%. No hubo diferencias significativas entre los otros grupos y el control.

Las interacciones del grafeno celular mostraron que el grafeno fue tolerado en el sistema 2D y fue tomado por las células a través de endocitosis. Las imágenes de lapso de tiempo mostraron que las células que sobrevivieron en el medio de grafeno 3D mantuvieron sus vitalidades a través del brillo GFP hasta el final de la incubación. Aquí se muestran imágenes SEM y análisis FIIR de los grupos de biotinta 3D-B y 3D-G.

Las interacciones de las células de biotinta se demostraron tanto en la superficie como internamente. Las células eran morfológicamente redondas y unidas al material. En la diferenciación neuronal 3D, se consideró que los bordes de las células esferoides en ambos grupos eran transparentes y vivos, y los esferoides en el grupo de grafeno eran relativamente más grandes y atrapaban el grafeno dentro de la célula.

Aquí se muestra la inmunotinción de células 2D y 3D. Las imágenes verdes representan estructuras similares a neuronas. La muestra de control positivo 2D expresó menos marcadores de estructura similares a neuronas que las muestras 3D.

Descubrimos que las biotintas basadas en grafeno tenían más éxito en términos de diferenciación de células madre en células similares a las neuronas. Proponemos que las biotintas basadas en grafeno serían excelentes herramientas para el tratamiento de trastornos de los nervios periféricos en estudios adicionales. Hoy en día, el sistema de células madre puede ser creado por ingeniería de tejidos con biomateriales naturales y sintéticos La creación de tejidos artificiales que pueden reemplazar los tejidos vivos que se pueden utilizar en la regeneración de estos tejidos, la eliminación del daño y la función es proporcionada por la ingeniería de tejidos.