Análisis de la dinámica de la microbiota fecal en ratones propensos al lupus utilizando un método de aislamiento de ADN simple y rentable
2 de mayo de 2022
Este protocolo proporciona un método de aislamiento de ADN simple y rentable para el análisis de alteraciones de la microbiota intestinal murina durante el desarrollo de enfermedades autoinmunes.
El método de aislamiento de ADN propuesto puede servir para estudiar la dinámica de la microbiota intestinal en modelos de ratón con enfermedades autoinmunes. Se propone un método más versátil, rentable y eficiente para obtener ADN de muestras fecales que son comparables a los kits disponibles comercialmente. Para comenzar, saque cada ratón individualmente de su jaula, recoja un pellet fecal directamente del ano y guárdelo a menos 80 grados centígrados hasta que se procese.
Procese las muestras con pinzas, tubos y guantes estériles y limpios. Agregue un pellet congelado a un tubo de tapón de rosca de dos mililitros previamente pesado y registre el peso fecal en gramos, que debe estar entre 0.02 y 0.05 gramos por pellet fecal. Agregue al pellet una capa delgada de perlas de vidrio de 0.1 milímetros, 500 microlitros de tampón de lisis y 200 microlitros de dodecil sulfato de sodio al 20%.
Bead batió el tubo durante cuatro minutos en un homogeneizador, seguido de tres a cinco minutos de vórtice. Centrifugar los tubos durante un corto tiempo para eliminar las burbujas y la espuma. Para extraer ADN de las muestras de microbiota, transfiera 350 microlitros de sobrenadante de muestra a un nuevo tubo de tapa a presión de 1,5 mililitros, sin residuos.
Agregue 500 microlitros de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico, en una proporción de 25: 24: 1, y vórtice durante un minuto. Después de la centrifugación, transfiera 180 microlitros de la fase acuosa superior a un nuevo tubo de tapa a presión de 1,5 mililitros. Añadir 180 microlitros de cloroformo, invertir y mezclar.
A partir de esto, transfiera 180 microlitros de la fase acuosa a un nuevo tubo de tapa a presión. En un gabinete de bioseguridad, agregue 180 microlitros de isopropanol frío y 36 microlitros de acetato de amonio molar. Invierta varias veces para mezclar y coloque el tubo en hielo durante 20 minutos.
Deseche el sobrenadante, seguido de lavar los pellets varias veces con 500 microlitros de etanol frío al 70%. Deseche el sobrenadante y seque al aire el tubo boca abajo sobre papel de seda durante 20 minutos, hasta que el pellet se aclare. Suspenda el pellet en 50 microlitros de agua de grado molecular y caliente el líquido a 37 grados centígrados durante 10 minutos para disolver completamente los gránulos de ADN grandes.
Después de calentar, centrifugar estos tubos a 3, 400 veces G durante un minuto para recuperar las gotas de condensación de la tapa. Mida la concentración y obtenga la relación 260/280 utilizando un espectrofotómetro. Una proporción para el ADN de buena calidad es generalmente entre 1,8 y dos.
Centrifugar las muestras preparadas a 600 veces G durante un minuto a temperatura ambiente, antes de congelar a menos 80 grados centígrados durante 24 horas. Luego, envíe 20 microlitros de muestras con concentraciones que van de uno a 50 nanogramos por microlitro al Laboratorio Nacional de Argonne para su secuenciación. La cepa de ratón que carece del receptor CX3CR1 tiene una composición de microbiota intestinal diferente en comparación con los ratones LMR/lpr de tipo salvaje, ratones MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP, muestra diferencias significativas en ciertos géneros, relevantes para bacterias potencialmente patógenas como las del filo Proteobacteria.
Tenga cuidado con la contaminación de la muestra. Tiene que ser estéril. Además, es importante pipetear con precisión al transferir el sobrenadante en un tubo nuevo.
Este método es adecuado para análisis moleculares como PCR, digestión de enzimas de restricción o construcción de bibliotecas genómicas. En el lupus, probamos una fuerte relación entre la microbiota intestinal y la progresión del lupus.
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Descripción general
Este protocolo proporciona un método sencillo y rentable para el aislamiento de ADN, destinado al análisis de las alteraciones de la microbiota intestinal murina durante el desarrollo de enfermedades autoinmunes. El método está diseñado para estudiar la dinámica de la microbiota intestinal en modelos murinos de enfermedades autoinmunes.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Microbiología
- Autoinmunidad
Antecedentes
- Comprender la microbiota intestinal es fundamental en la investigación de enfermedades autoinmunitarias.
- Los métodos actuales para el aislamiento de ADN pueden ser costosos y complejos.
- Este estudio propone una alternativa más eficiente y rentable.
- Se utilizan muestras fecales para analizar los cambios en la microbiota.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un método confiable para la extracción de ADN a partir de muestras fecales.
- Facilitar el estudio de la microbiota intestinal en modelos de enfermedades autoinmunes.
- Comparar la eficiencia del nuevo método con los kits disponibles comercialmente.
Métodos Utilizados
- Recolección individual de pellets fecales de ratones.
- Almacenamiento de las muestras a -80 grados Celsius.
- Uso de herramientas estériles para el procesamiento de las muestras.
- Preparación de las muestras con tampón de lisis y perlas de vidrio.
Resultados principales
- El método propuesto produce una calidad de ADN comparable a la de los kits comerciales.
- Es rentable y eficiente para el análisis de microbiota.
- Facilita investigaciones adicionales sobre los mecanismos de las enfermedades autoinmunes.
Conclusiones
- Este método de aislamiento de ADN es una herramienta valiosa para los investigadores.
- Apoya la investigación de la microbiota intestinal en contextos de enfermedad.
- Fomenta una investigación más accesible en el campo de la autoinmunidad.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El análisis confiable de la dinámica del microbiota intestinal en modelos de enfermedades autoinmunes es fundamental para comprender las contribuciones ambientales y genéticas a la progresión de la enfermedad. Este protocolo rentable de aislamiento de ADN permite la extracción escalable y reproducible de ADN microbiano a partir de muestras fecales de ratones, apoyando estudios de microbioma de alto rendimiento en investigaciones preclínicas. El método aumenta la confianza predictiva al vincular los cambios en el microbiota con fenotipos autoinmunes, orientando estrategias de descubrimiento temprano y traslación.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar las interacciones entre la microbiota y el sistema inmunitario en modelos de ratón relevantes para enfermedades.
- Apoya la validación funcional de vías candidatas influenciadas por la composición microbiana intestinal.
- Facilita la desvinculación mecanicista al relacionar cambios microbianos con la progresión de enfermedades autoinmunes.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona muestras de ADN estandarizadas y reproducibles para secuenciación posterior y ensayos moleculares.
- Asegura ADN cuantitativo y de alta calidad adecuado para protocolos de PCR y secuenciación de nueva generación.
- Permite el procesamiento escalable de muestras para estudios comparativos de microbiomas entre cohortes experimentales.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Correlaciona el perfilado de microbiota preclínico con la progresión de la enfermedad y los esfuerzos de descubrimiento de biomarcadores.
- Apoya la continuidad desde hallazgos en etapa de descubrimiento hasta la validación traslacional en modelos de enfermedades autoinmunitarias.
- Reduce la ambigüedad biológica al vincular factores ambientales desencadenantes con fenotipos de enfermedad.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este protocolo de aislamiento de ADN se integra en la fase de descubrimiento temprano hasta la etapa preclínica, permitiendo un análisis robusto del microbioma en modelos de ratón predispuestos al lupus y apoyando la identificación de candidatos prometedores y estudios mecanicistas.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis sobre la modulación inmunitaria inducida por la microbiota en enfermedades autoinmunitarias.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos reproductibles de ADN para el perfilado del microbioma basado en secuenciación.
- Análisis: Ofrece una entrada de alta calidad para la comparación estadística de los cambios en las comunidades microbianas entre genotipos o tratamientos.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos preclínicos sobre el microbioma con el desarrollo potencial de biomarcadores en enfermedades autoinmunitarias.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un protocolo escalable y rentable, adaptable a diversos modelos murinos y diseños experimentales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en las asociaciones entre microbiota y enfermedades, así como en la validación de dianas.
- Valor operativo: Estandariza la extracción de ADN, mejorando la reproducibilidad y escalabilidad entre estudios.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones informadas de avance o interrupción al aclarar las contribuciones del microbioma a los mecanismos de la enfermedad.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de intervenciones que modulan el microbioma en las líneas de desarrollo para enfermedades autoinmunitarias.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia técnica en el manejo estéril de muestras y en procedimientos de biología molecular.
- Necesita acceso a homogeneizadores, centrífugas y espectrofotómetros para el control de calidad.
- Exige una estandarización rigurosa entre equipos para minimizar la contaminación y la variabilidad.
- Adaptable a diversos modelos murinos, aunque puede requerir optimización según el tipo de muestra.
- Depende de una pipetación precisa y de técnicas estériles para garantizar la integridad de los datos.
