Name: Construcción de mutantes homocigotos de langostas migratorias utilizando tecnología CRISPR/Cas9 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Aprende a construir mutantes homocigotos en langostas migratorias utilizando CRISPR/Cas9 con microinyección y criopreservación de embriones. Este protocolo optimizado facilita la investigación en ingeniería genética de insectos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32070502, 31601697, 32072419 y la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (2020M672205).

1. Selección del sitio objetivo y diseño de sgRNA
<ol><li>Recopilar tanta información de secuencia como sea posible para el gen de interés a través de la investigación bibliográfica y/o la búsqueda del ARNm o la secuencia de ADN codificante (CDS) del gen en la base de datos NCBI y langosta24.</li>
	<li>Compare la secuencia del gen interesado con su secuencia de ADN genómico para distinguir las regiones de exón e intronio.</li>
	<li>Seleccione una región candidata para el diseño del sitio de destino en función del propósito de la investigación. Diseñe pares de cebadores para amplificar el fragmento de la región candidata y verificar su secuencia de tipo salvaje mediante el análisis de secuenciación del producto de PCR. NOTA: Existen diferentes estrategias para la selección de la región objetivo candidata. Por ejemplo, en la mayoría de las investigaciones sobre la función de genes / proteínas, use el fragmento de exón cerca de su codón de inicio como la región candidata para asegurarse de que toda la función de proteína / ARN se pierda después de la edición del genoma (es decir, eliminación de genes). Mientras que para el análisis de funciones de un dominio específico, seleccione la región candidata al principio (o ambos extremos) del dominio.</li>
	<li>Utilice recursos en línea como E-CRISP Design25 para buscar posibles sitios objetivo en la región objetivo candidata.<ol><li>Seleccione "Drosophila melanogaster BDGP6" (o cualquier otro insecto) en la lista desplegable de genomas de referencia y elija "La entrada es la secuencia FASTA" seguido de pegar la secuencia de la región objetivo en el cuadro de texto (en formato FASTA).</li>
		<li>Inicie la aplicación presionando "Iniciar búsqueda de sgRNA" con "medio" y "diseño único" para obtener los posibles sitios de destino. Seleccione 1-3 objetivos potenciales de los resultados en función de sus puntuaciones previstas y diseñe los sgRNAs correspondientes en consecuencia. NOTA: Hay muchas más plataformas en línea para el diseño CRISPR, como CRISPOR, CHOPCHOP, CRISPRdirect, ZiFiT, etc. (consulte la Tabla de materiales). Algunos de ellos tienen la función de verificación de especificidad para las especies cuyos datos de secuencia genómica están en sus bases de datos. Sin embargo, la secuencia genómica de las langostas no se ha encontrado en ningún sitio web en línea. Es mejor usar más de una herramienta en línea para el diseño CRISPR en langostas. De manera exhaustiva, considere los resultados de diferentes sitios web y seleccione el sgRNA de los resultados según el principio de mayor especificidad, mayor eficiencia y menor tasa de desajuste (Figura 1A, B).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Síntesis y verificación del sgRNA in vitro
<ol><li>Sintetice el sgRNA utilizando kits de síntesis de sgRNA de acuerdo con el manual del fabricante (Tabla de materiales). Este procedimiento generalmente incluye tres pasos: amplificación de la plantilla de ADN, transcripción in vitro y purificación de sgRNA21. Diluir el sgRNA sintetizado con agua libre de nucleasas a una concentración de almacenamiento de 300 ng/μL para su uso posterior.</li>
	<li>Amplificar y purificar el fragmento del gen diana para que sirva como sustrato del ensayo de escisión in vitro del sistema CRISPR/Cas9. Realice estos pasos siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Diluir la proteína Cas9 comprada a 300 ng/μL con agua libre de nucleasas. Incubar 1 μL de sgRNA (300 ng/μL) y 1 μL de proteína Cas9 (300 ng/μL) con 200 ng de fragmento diana purificado en el tampón de escisión a 37 °C durante 1 h (10 μL de volumen total; ver Tabla 1). Estimar la eficiencia de la escisión de Cas9 inducida por sgRNA mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 1C). Seleccione los sgRNAs con alta actividad para la siguiente microinyección. NOTA: Los resultados de la electroforesis en gel de agarosa se pueden convertir en imágenes en escala de grises con software de procesamiento de imágenes y la eficiencia de la escisión se estima de acuerdo con la escala de grises de las bandas de tamaños especulados.</li>
</ol>3. Microinyección y cultivo de los huevos
<ol><li>Prepare las agujas de inyección tirando de los capilares de vidrio con un extractor de micropipetas (Tabla de materiales). Establezca los parámetros de la siguiente manera: Calor a 588, Tirar a 90, Velocidad a 60 y Tiempo a 40. Moler la punta de la aguja de inyección con un micro molinillo (Tabla de materiales). NOTA: Las puntas ideales de las agujas son abiertas y de bordes afilados (Figura 2A). Se recomienda encarecidamente preparar agujas adicionales para los experimentos porque las agujas a veces se bloquean o se rompen accidentalmente durante las inyecciones.</li>
	<li>Mezclar 1 μL de proteína Cas9 (300 ng/μL) con 1 μL del sgRNA verificado (300 ng/μL) para obtener los RNPs para inyección. Agregue 8 μL de agua estéril libre de RNasa para que el volumen final de la mezcla sea de 10 μL. Mezcle bien la solución y manténgala en hielo. NOTA: Las concentraciones finales de la proteína Cas9 y los sgRNAs se pueden optimizar de acuerdo con los resultados de edición. Evite la congelación y descongelación repetitiva de la solución de RNP preparada y se recomienda su uso inmediato.</li>
	<li>Criar las langostas adultas macho y hembra juntas a 30 °C con un fotoperiodo 16 (claro):8 (oscuro) y suministrarles suficientes plántulas de trigo fresco como alimento. Observe estas langostas diariamente y coloque una maceta de oviposición (una maceta de plástico o una taza llena de arena estéril húmeda) en la jaula de cría para la oviposición una vez que las langostas se aparearon. NOTA: Por lo general, 100 parejas de langostas adultas criadas en una jaula de cría (40 cm x 40 cm x 40 cm) son suficientes para generar huevos para eliminar un solo gen. Cultive pares adicionales de langostas si se necesitan más huevos.</li>
	<li>Recoja las vainas de huevo recién puestas de la olla de oviposición y espere unos 30 minutos para el bronceado del huevo. Aísle suavemente los huevos de las vainas de huevo en agua con un cepillo fino y lávelos con agua estéril tres veces. Mantenga los huevos en una placa de Petri y agregue agua estéril para mantenerlos húmedos. NOTA: El curtido de los huevos recién puestos puede mejorar significativamente la eficiencia mutante21.</li>
	<li>Llene una aguja de inyección con la solución de RNP preparada y cárguela en el micromanipulador (Tabla de materiales).<ol><li>Ajuste los parámetros de microinyección de la siguiente manera: 300 hPa de la presión de inyección (pi), 0,5 s del tiempo de inyección (ti) y 25 hPa de la presión de compensación (pc).</li>
		<li>Presione el pedal para evaluar el volumen de la solución inyectada. Ajuste la presión de inyección y el tiempo de inyección para asegurarse de que el volumen de inyección sea de aproximadamente 50-100 nL. NOTA: Expulse el aire residual en la aguja para que la solución de inyección sea continua y controlable tanto como sea posible. La conexión de la aguja y el micromanipulador debe ser estrecha.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque los huevos estériles regularmente en la almohadilla de inyección (Figura 2B, C) y coloque la almohadilla en la mesa de objetos del microscopio (Figura 3A). Ajuste el aumento del microscopio hasta que se observen los huevos. Ajuste la aguja de microinyección bajo el microscopio hasta que se pueda ver la punta de inyección y colóquela cerca del huevo que se inyectará.</li>
	<li>Comience la inyección a una altura adecuada y un ángulo de 30-45 grados. Inserte la punta en el huevo cuidadosamente cerca de los micropyles del huevo (Figura 3B) y presione el pedal para realizar la inyección. Retraiga la aguja rápidamente y mueva la almohadilla de inyección para inyectar el siguiente óvulo. NOTA: Se debe observar una ligera expansión del huevo durante la microinyección. Una pequeña cantidad de fuga citoplasmática en el agujero de alfiler es aceptable. Reemplace la aguja de inyección por una nueva o ajuste el ángulo de inyección si la salida de líquido es demasiado.</li>
	<li>Transfiera los huevos inyectados a una placa de cultivo (una placa de Petri con un trozo de papel de filtro húmedo) y colóquelos en una incubadora a 30 °C. NOTA: Pasarán unos 13-14 días hasta que las ninfas eclosionen de estos huevos inyectados (a condición de que la mutación del gen diana no afecte el desarrollo de los embriones) (Figura 3C). Inyecte al menos 100 huevos para asegurar una cantidad suficiente de eclosión y eclosión para eliminar un gen específico.</li>
</ol>4. Estimación de la tasa de mutación y cribado de mutantes
<ol><li>Verifique el desarrollo de los óvulos inyectados todos los días después de la inyección. Transfiera los huevos inyectados a una nueva placa de cultivo cada 24 h en los primeros 5 días.</li>
	<li>En el6º día (o más tarde) después de la inyección, recoja y transfiera al azar 10 huevos a un tubo y muele adecuadamente los huevos con dos bolas de acero a 60 Hz durante 6 minutos usando un molinillo (consulte la Tabla de materiales). Resuspender los desechos con 1 ml de PBS. Transfiera 5 μL de la mezcla a 45 μL de NaOH a 50 mM y lílea a 95 °C durante 5 min. Añadir 5 μL de 1 M Tris-HCl (pH=8,0) en el sistema de lisis para terminar la reacción de lisis alcalina. NOTA: Los huevos se pueden seleccionar para la lisis alcalina en cualquier día después de la última transferencia y se pueden usar múltiples óvulos como una muestra dependiendo de su situación de desarrollo (por ejemplo, cinco embriones de 6 días se pueden usar como una muestra, y dos embriones de 10 días se pueden usar como una muestra). A veces, no es factible obtener el ADN genómico de los huevos utilizando el método de lisis alcalina. Los kits comerciales de extracción de ADN genómico se pueden utilizar como un método alternativo para aislar el ADN genómico de los óvulos.</li>
	<li>Tome 1 μL del producto de lisis como plantilla de PCR para amplificar el fragmento del gen diana (Tabla 2 y Tabla 3) y envíe los productos de PCR para su secuenciación. Compare los resultados de la secuenciación con la secuencia de tipo salvaje para evaluar preliminarmente si el sistema CRISPR/Cas9 escindió el gen diana in vivo (Figura 4A). Permitir el resto de los óvulos para su posterior desarrollo a condición de que los indeles se detecten en la etapa embrionaria. NOTA: De esta manera, la tasa de mutación se puede estimar preliminarmente en la etapa embrionaria. Si no se encuentran indeles en este paso, prepare algunos nuevos sgRNAs para el gen diana y repita el protocolo knock-out del paso 2.1.</li>
	<li>Transfiera las ninfas eclosionadas a una jaula de cría y críelas como se describe en el paso 3.3. Cuando las ninfas se desarrollaron a la quinta etapa de estadio, sepárelas con vasos de cultivo de plástico (1 ninfa / taza). NOTA: Por lo general, las ninfas tardan entre 25 y 35 días en desarrollarse hasta su quinto estadio y el fenotipo más obvio es que las yemas de las alas se extienden hasta el cuarto o quinto segmento abdominal. Además, se recomienda registrar los fenotipos de ninfas muertas para predecir la relación entre el gen objetivo y los fenotipos en futuras investigaciones.</li>
	<li>Cortar aproximadamente 2 mm de longitud de las antenas con tijeras de disección y lisarlo utilizando el método de lisis alcalina (paso 4.2). Analice la secuencia del fragmento del gen objetivo de estas ninfas como se describió anteriormente (paso 4.3) para identificar los mutantes G0 (Figura 4B). NOTA: Las antenas cortadas para la lisis pueden ser un poco más largas y moler o picar las antenas es útil para la lisis, aunque las antenas se pueden digerir directamente. Los individuos con múltiples picos cerca del sitio objetivo en el resultado de la secuenciación se identifican como mutantes positivos y se les permite el desarrollo y el apareamiento posteriores.</li>
</ol>5. Establecimiento y paso de líneas mutantes
<ol><li>Realizar cruzamientos utilizando los mutantes G0 y langostas de tipo salvaje (Figura 4B). Recoger los ooquistes e incubar estos ooquistes por separado a 30 °C. Use 3-6 óvulos desarrollados en cada ooquiste para detectar mutaciones como se describe en los pasos 4.2 y 4.3. Mantener los ooquistes con mutación positiva para el desarrollo posterior y abandonar los ooquistes con mutación negativa. NOTA: La estimación de la tasa de mutación en la etapa embrionaria puede acelerar en gran medida la detección de mutantes G1 . Por lo general, 3-6 óvulos desarrollados se pueden mezclar como una muestra para el genotipado mediado por PCR como se describió anteriormente.</li>
	<li>Criar las ninfas G1 como se describe en el paso 4.4. Corte aproximadamente 2 mm de longitud de las antenas para realizar el genotipado basado en PCR como se describe en el paso 4.5 para detectar heterocigotos G1 . Realice la clonación de TA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales) para identificar sus mutaciones. Realizar in-cross utilizando heterocigotosG1 con las mismas mutaciones para obtener ninfasG2 . NOTA: La secuenciación de Sanger de los productos de PCR solo puede proporcionar información para descubrir los heterocigotos, pero no suficiente información para identificar las mutaciones exactas. Por lo tanto, la clonación de TA utilizando los productos de PCR es necesaria para identificar claramente las mutaciones y puede promover el establecimiento de líneas mutantes estables.</li>
	<li>Cría a las ninfas G2 hasta su quinto estadio. Utilice el genotipado basado en PCR descrito en el paso 5.2 para identificar los homocigotos y/o heterocigotos que son adecuados para futuras investigaciones y pases estables (Figura 4B). NOTA: Preste atención para evitar la mezcla de homocigotos y heterocigotos. Se recomienda realizar genotipado basado en PCR en cada generación para confirmar la homocigosidad y/o heterocigosidad de cada población. El número de langostas utilizadas para este control depende del tamaño de la población. Además, la población de langostas puede ampliarse mediante la estrategia de cruce.</li>
</ol>6. Criopreservación y reanimación de óvulos
<ol><li>Lave los huevos a criopreservar con agua estéril e incubarlos en una placa de cultivo como se describe anteriormente (paso 3.8) durante 5-6 días. Reúna estos huevos en la placa de cultivo y cúbralos con fragmentos de papel de filtro. Envuelva todo el plato de cultivo con una película de parafina.</li>
	<li>Mantener el plato a 25 °C durante 2 días seguidos de otros 2 días a una temperatura relativamente más baja (13-16 °C). A continuación, transfiera el plato a una nevera a 6 °C. Agregue agua cada 2 semanas para proporcionar un ambiente húmedo para los huevos (Figura 5A). NOTA: Se especula que los embriones están en la etapa de katatrepsis después de haber sido desarrollados durante 5-6 días a 30 ° C26. El enfriamiento por gradiente es útil para la criopreservación de óvulos (Tabla 5).</li>
	<li>Para resucitar los huevos criopreservados, saque la placa de Petri del refrigerador y manténgala a 25 °C durante 2 días. Coloque estos huevos en una incubadora a 30 °C hasta que las ninfas eclosionen (Figura 5B). NOTA: Es necesario poner los huevos criopreservados a 25 °C antes de transferirlos a una incubadora a 30 °C. Los embriones pueden ser criopreservados durante al menos cinco meses, aunque la tasa de eclosión y la tasa de eclosión pueden disminuir debido a la criopreservación (Tabla 5).</li>
</ol>

<ol><li>Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+and+challenge+of+therapeutic+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise and challenge of therapeutic genome editing.</a> Nature. 578 (7794), 229-236 (2020).</li>
<li>van Haasteren, J., Li, J., Scheideler, O. J., Murthy, N., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+delivery+challenge%3A+fulfilling+the+promise+of+therapeutic+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 845-855 (2020).</li>
<li>McCarty, N. S., Graham, A. E., Studena, L., Ledesma-Amaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+CRISPR+technologies+for+gene+editing+and+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiplexed CRISPR technologies for gene editing and transcriptional regulation.</a> Nature Communications. 11 (1), 1281(2020).</li>
<li>Manghwar, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas+systems+in+genome+editing%3A+Methodologies+and+tools+for+sgRNA+design%2C+off-target+evaluation%2C+and+strategies+to+mitigate+off-target+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas systems in genome editing: Methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation, and strategies to mitigate off-target effects.</a> Advanced Science. 7 (6), 1902312(2020).</li>
<li>Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+CRISPR-Cas+nucleases%2C+base+editors%2C+transposases+and+prime+editors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).</li>
<li>Rees, H. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base+editing%3A+precision+chemistry+on+the+genome+and+transcriptome+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).</li>
<li>Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., Nakata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+iap+gene%2C+responsible+for+alkaline+phosphatase+isozyme+conversion+in+Escherichia+coli%2C+and+identification+of+the+gene+product%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product.</a> Journal of Bacteriology. 169 (12), 5429-5433 (1987).</li>
<li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> eLife. 2, 00471(2013).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).</li>
<li>Ai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+microinjection+and+knockout+mutant+identification+of+CRISPR%2FCas9+genome-edited+Helicoverpa+Armigera+%28Hubner%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE1%22%5BJournal%5D)">Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa Armigera (Hubner).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE1. (173), e62068(2021).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mediated+knockout+of+the+abdominal-A+homeotic+gene+in+the+global+pest%2C+diamondback+moth+%28Plutella+xylostella%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mediated knockout of the abdominal-A homeotic gene in the global pest, diamondback moth (Plutella xylostella).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 75, 98-106 (2016).</li>
<li>Gratz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+and+efficient+CRISPR%2FCas9-catalyzed+homology-directed+repair+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila.</a> Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).</li>
<li>Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+with+CRISPR-Cas9+in+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti.</a> Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+locusts%3A+Successful+establishment+of+an+olfactory+deficiency+line+by+targeting+the+mutagenesis+of+an+odorant+receptor+co-receptor+%28Orco%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BmHpo+mutation+induces+smaller+body+size+and+late+stage+larval+lethality+in+the+silkworm%2C+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">BmHpo mutation induces smaller body size and late stage larval lethality in the silkworm, Bombyx mori.</a> Insect Science. 25 (6), 1006-1016 (2018).</li>
<li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+induces+exon+skipping+by+complete+or+stochastic+altering+splicing+in+the+migratory+locust%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), 60(2018).</li>
<li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+tanning+improves+the+efficiency+of+CRISPR%2FCas9-mediated+mutant+locust+production+by+enhancing+defense+ability+after+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Egg tanning improves the efficiency of CRISPR/Cas9-mediated mutant locust production by enhancing defense ability after microinjection.</a> Journal of Integrative Agriculture. 20 (10), 2716-2726 (2021).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Vinylanisole+is+an+aggregation+pheromone+in+locusts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">4-Vinylanisole is an aggregation pheromone in locusts.</a> Nature. 584 (7822), 584-588 (2020).</li>
<li>Zhang, L., Lecoq, M., Latchininsky, A., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locust+and+grasshopper+management%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Locust and grasshopper management.</a> Annual Review of Entomology. 64, 15-34 (2019).</li>
<li>Yang, P., Hou, L., Wang, X., Kang, L. Core transcriptional signatures of phase change in the migratory locust. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.locustmine.org:8080/locustmine">http://www.locustmine.org:8080/locustmine</a> (2019).</li>
<li>Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.e-crisp.org/E-CRISP/">http://www.e-crisp.org/E-CRISP/</a> (2014).</li>
<li>Pétavy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+development+of+the+vitellophags+during+embryogenesis+of+the+migratory+locust%2C+Locusta+migratoria+L.+%28Orthoptera+%3A+Acrididae%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Insect+Morphology+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">Origin and development of the vitellophags during embryogenesis of the migratory locust, Locusta migratoria L. (Orthoptera : Acrididae).</a> International Journal of Insect Morphology and Embryology. 14 (6), 361-379 (1985).</li>
<li>Barry, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injecting+Gryllus+bimaculatus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Injecting Gryllus bimaculatus eggs.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59726(2019).</li>
<li>Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+the+cricket%2C+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome editing in the cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Methods in Molecular Biology. 1630, 219-233 (2017).</li>
<li>Du, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Laccase+2+severely+impairs+cuticle+tanning+and+pathogen+resistance+during+the+pupal+metamorphosis+of+Anopheles+sinensis+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Suppression of Laccase 2 severely impairs cuticle tanning and pathogen resistance during the pupal metamorphosis of Anopheles sinensis (Diptera: Culicidae).</a> Parasites & Vectors. 10 (1), 171(2017).</li>
<li>Eisner, T., Shepherd, J., Happ, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tanning+of+grasshopper+eggs+by+an+exocrine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tanning of grasshopper eggs by an exocrine secretion.</a> Science. 152 (3718), 95-97 (1966).</li>
<li>Ho, K., Dunin-Borkowski, O. M., Akam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellularization+in+locust+embryos+occurs+before+blastoderm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellularization in locust embryos occurs before blastoderm formation.</a> Development. 124 (14), 2761-2768 (1997).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactive+effect+of+photoperiod+and+temperature+on+the+induction+and+termination+of+embryonic+diapause+in+the+migratory+locust%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Managment+Science%22%5BJournal%5D)">Interactive effect of photoperiod and temperature on the induction and termination of embryonic diapause in the migratory locust.</a> Pest Managment Science. 77 (6), 2854-2862 (2021).</li>
<li>Jarwar, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transcriptomic+analysis+reveals+molecular+profiles+of+central+nervous+system+in+maternal+diapause+induction+of+Locusta+migratoria%5BTitle%5D)+AND+%22G3-Genes+Genomes+Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative transcriptomic analysis reveals molecular profiles of central nervous system in maternal diapause induction of Locusta migratoria.</a> G3-Genes Genomes Genetics. 9 (10), 3287-3296 (2019).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Las langostas han sido una de las plagas más devastadoras para la agricultura desde la civilización de los seres humanos23. La tecnología de edición del genoma basada en CRISPR/Cas9 es una herramienta poderosa para proporcionar un mejor conocimiento de los mecanismos biológicos en las langostas, así como una estrategia prometedora de control de plagas. Por lo tanto, es de gran beneficio desarrollar un método eficiente y fácil de usar para la construcción mediada por CRISPR / Cas9 de mutantes de la...

Las tecnologías de edición de genes podrían utilizarse para introducir inserciones o deleciones en un locus específico del genoma para modificar artificialmente el gen objetivo a propósito1. En los últimos años, la tecnología CRISPR/Cas9 se ha desarrollado rápidamente y tiene un alcance creciente de aplicaciones en diversos campos de las ciencias de la vida 2,3,4,5,6. El sistema CRISPR/Cas9 fue descubierto en 19877, y se encuentra ampliamente en bacterias y arqueas. Investigaciones posteriores indicaron que se trataba de un sistema inmune adaptativo procariota que depende de la nucleasa Cas9 guiada por ARN para luchar contra los fagos8. El sistema CRISPR/Cas9 modificado artificialmente consta principalmente de dos componentes, un único ARN guía (sgRNA) y la proteína Cas9. El sgRNA está formado por un ARN CRISPR (crRNA) complementario a la secuencia diana y un crRNA transactivador auxiliar (tracrRNA), que está relativamente conservado. Cuando se activa el sistema CRISPR/Cas9, el sgRNA forma una ribonucleoproteína (RNP) con la proteína Cas9 y guía a Cas9 a su sitio objetivo a través del emparejamiento de bases de las interacciones ARN-ADN. Luego, el ADN de doble cadena puede ser escindido por la proteína Cas9 y, como resultado, la ruptura de doble cadena (DSB) emerge cerca del motivo adyacente al protoespaciador (PAM) del sitio objetivo 9,10,11,12. Para mitigar el daño causado por los DSB, las células activarían respuestas integrales al daño del ADN para detectar eficientemente los daños genómicos e iniciar el procedimiento de reparación. Hay dos mecanismos de reparación distintos en la célula: unión de extremos no homólogos (NHEJ) y reparación dirigida por homología (HDR). NHEJ es la vía de reparación más común que puede reparar las roturas de doble cadena del ADN rápidamente y previene la apoptosis celular. Sin embargo, es propenso a errores debido a dejar pequeños fragmentos de inserciones y deleciones (indeles) cerca de los DSB, lo que generalmente resulta en un cambio de marco de lectura abierto y, por lo tanto, puede conducir a la eliminación de genes. En contraste, la reparación homóloga es un evento bastante raro. Con la condición de que haya una plantilla de reparación con secuencias homólogas al contexto del DSB, las células ocasionalmente repararían la ruptura genómica de acuerdo con la plantilla cercana. El resultado de HDR es que el DSB se repara con precisión. Especialmente, si hay una secuencia adicional entre las secuencias homólogas en la plantilla, se integrarían en el genoma a través de HDR, y de esta manera, las inserciones genéticas específicas podrían realizarse13.
Con la optimización y el desarrollo de las estructuras sgRNA y las variantes de la proteína Cas9, el sistema de edición genética basado en CRISPR / Cas9 también se ha aplicado con éxito en la investigación de insectos, incluidos, entre otros, Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, Bombyx mori, Helicoverpa Armigera, Plutella xylostella y Locusta migratoria 14,15,16,17,18 ,19. Hasta donde saben los autores, aunque las RNP que consisten en la proteína Cas9 y el sgRNA transcrito in vitro se han utilizado para la edición del genoma de la langosta20,21,22, todavía falta un protocolo sistemático y detallado para la construcción mediada por ribonucleasa CRISPR / Cas9 de mutantes homocigotos de la langosta migratoria.
La langosta migratoria es una plaga agrícola importante que tiene una distribución mundial y representa amenazas sustanciales para la producción de alimentos, siendo especialmente dañina para las plantas gramíneas, como el trigo, el maíz, el arroz y el mijo23. El análisis de la función génica basado en tecnologías de edición del genoma puede proporcionar nuevos objetivos y nuevas estrategias para el control de las langostas migratorias. Este estudio propone un método detallado para eliminar genes de langostas migratorias a través del sistema CRISPR / Cas9, incluida la selección de sitios objetivo y el diseño de sgRNAs, síntesis in vitro y verificación de los sgRNAs, microinyección y cultivo de óvulos, estimación de la tasa de mutación en la etapa embrionaria, detección de mutantes, así como paso y preservación de los mutantes. Este protocolo podría usarse como referencia basal para la manipulación de la gran mayoría de los genes de langostas y puede proporcionar referencias valiosas para la edición del genoma de otros insectos.

<table><tbody><tr><td>10 veces; NEBuffer r3.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7030S</td><td>El búfer de &nbsp; in vitro Ensayos de escisión Cas9</td></tr><tr><td>2xEs Taq MasterMix (Dye)</td><td>Cwbio</td><td>CW0690</td><td>Para la amplificación de genes</td></tr><tr><td>2xPfu MasterMix (Dye)</td><td>Cwbio</td><td>CW0686</td><td>Para la amplificación de genes</td></tr><tr><td>CHOPCHOP</td><td></td><td></td><td>Sitio web en línea para el diseño de sgRNAs, http://chopchop.cbu.uib.no/.</td></tr><tr><td>Sitio web de CRISPOR</td><td></td><td></td><td>Online para el diseño de sgRNAs, http://crispor.org.</td></tr><tr><td>CRISPRdirect</td><td></td><td></td><td>Sitio web en línea para el diseño de sgRNAs, http://crispr.dbcls.jp/.</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación para electroforesis</td><td>LIUYI BIOLOGY</td><td>DYY-6D</td><td>Separación de moléculas de ácido nucleico de diferentes tamaños</td></tr><tr><td>Tubo Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>30125177</td><td>Para la recogida de muestras, etc.</td></tr><tr><td>Cepillos finos</td><td>Annigoni</td><td>1235</td><td>Para limpiar y aislar huevos. Comprado en línea.</td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas aplanado/marrón</td><td>Sutter Instrument</td><td>P97</td><td>Para la fabricación de las agujas de microinyección</td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel</td><td>Cwbio</td><td>CW2302</td><td>Recuperación y purificación de ADN</td></tr><tr><td>Sistema de análisis de imágenes en gel</td><td>OLYMPUS</td><td>Gel Doc XR</td><td>Observe los resultados de la electroforesis</td></tr><tr><td>GeneTouch Plus</td><td>Bioer</td><td>B-48DA</td><td>Para la amplificación de genes</td></tr><tr><td>Vidrio electrodo capilar</td><td>Gairdner</td><td>GD-102</td><td>Para la fabricación &nbsp; agujas de inyección con &nbsp; a&nbsp; Extractor de micropipetas</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>MEMMERT</td><td>INplus55</td><td>Para el cultivo de embriones de langostas migratorias</td></tr><tr><td>Baño metálico</td><td>TIANGEN</td><td>AJ-800</td><td>Para calentar la muestra</td></tr><tr><td>Micro autoinyector</td><td>Eppendorf</td><td>5253000068</td><td>Microinyección de embriones en las primeras etapas del desarrollo</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Allsheng</td><td>MTV-1</td><td>Se utiliza para mezclar reactivos</td></tr><tr><td>Micromolinillo</td><td>NARISHIGE</td><td>EG-401</td><td>Para rectificar la punta de la aguja de inyección</td></tr><tr><td>Microloader</td><td>Eppendorf 5242956003</td><td></td><td>Para cargar soluciones en las agujas de inyección.</td></tr><tr><td>Sistema de micromanipulación</td><td>Eppendorf</td><td>TransferMan 4r</td><td>Un sistema alternativo de manipulación para microinyección</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>cnoptec</td><td>SZ780</td><td>Para microinyección</td></tr><tr><td>Manipulador de accionamiento por motor</td><td>NARISHIGE</td><td>MM-94</td><td>Para controlar la posición de la micropipeta durante la microinyección Trituradora</td></tr><tr><td>de tejidos multimuestra</td><td>jingxin</td><td>Tissuelyser-64</td><td>Moler y homogeneizar los huevos olla</td></tr><tr><td>de ovipisición</td><td>ChangShengYuanYi</td><td>CS-11</td><td>Llena de arena estéril húmeda para ovipositar langostas en ella. Los ooquistes se recogen de este recipiente. Comprado en línea.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>ParafilmM</td><td>PM996</td><td>Para envolver las placas de Petri.</td></tr><tr><td>pEASY-T3 Kit de clonación</td><td>TransGen Biotech</td><td>CT301-01</td><td>Para clonación de TA</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>NEST</td><td>752001</td><td>Para el cultivo y la conservación de los óvulos.</td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>Research plus</td><td>Para la carga de muestras</td></tr>, <tr><td>vaso</td><td></td><td></td> de cultivo de plástico <td>Para la cría de langostas por separado, y cualquier vaso de plástico lo suficientemente grande (no menos de 1000 mL de volumen) servirá. Comprado en línea.</td></tr><tr><td>Kit de síntesis de ARNg de precisión</td><td>Thermo</td><td>A29377</td><td>Para la síntesis de ARNs</td></tr><tr><td>Primer Premier</td><td>PREMIER Biosoft</td><td>Primer Premier 5.00</td><td>Para el diseño de cebadores</td></tr><tr><td>SnapGene</td><td>Insightful Science</td><td>SnapGene&reg; 4.2.4</td><td>Para el análisis de secuencias</td></tr><tr><td>Bolas de acero</td><td>HuaXinGangQiu</td><td>HXGQ60</td><td>Para la molienda de muestras. Comprado en línea.</td></tr><tr><td>Consejos</td><td>bioleaf</td><td>D781349</td><td>Para la carga de muestras</td></tr> Trans <tr><td>DNA Marker II</td><td>TransGen Biotech</td><td>BM411-01</td><td>Se utiliza para determinar el tamaño del gen</td></tr><tr><td>TrueCut Cas9 Protein v2</td><td>Thermo</td><td>A36496</td><td>Cas9</td></tr><tr><td>protein UniversalGen DNA Kit</td><td>Cwbio</td><td>CWY004</td><td>Para la extracción de ADN genómico</td></tr><tr><td>VANNAS Tijeras</td><td>Microscopía Electrónica Ciencias 72932-01</td><td></td><td>Para cortar las antenas</td></tr><tr><td>Trigo</td><td></td><td></td><td>Para generar plántulas de trigo como alimento para las langostas. Comprado a agricultores locales.</td></tr><tr><td>ZiFiT</td><td></td><td></td><td>Sitio web en línea para el diseño de sgRNAs, http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx.</td></tr></tbody></table>

construcción de mutantes homocigotos de langostas migratorias utilizando tecnología crispr/cas9

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

La langosta migratoria, Locusta migratoria, no solo es una de las langostas de peste mundial que causó enormes pérdidas económicas a los seres humanos, sino también un importante modelo de investigación para la metamorfosis de insectos. El sistema CRISPR / Cas9 puede localizar con precisión un locus de ADN específico y escindirlo dentro del sitio objetivo, introduciendo eficientemente roturas de doble cadena para inducir la eliminación del gen objetivo o integrar nuevos fragmentos de genes en el locus específico. La edición del genoma mediada por CRISPR/Cas9 es una herramienta poderosa para abordar las preguntas encontradas en la investigación de la langosta, así como una tecnología prometedora para el control de la langosta. Este estudio proporciona un protocolo sistemático para la eliminación de genes mediados por CRISPR / Cas9 con el complejo de proteína Cas9 y ARN guía única (sgRNA) en langostas migratorias. La selección de los sitios diana y el diseño del sgRNA se describen en detalle, seguidos de la síntesis in vitro y la verificación de los sgRNAs. Los procedimientos posteriores incluyen la recolección de balsas de huevos y la separación de huevos curtidos para lograr una microinyección exitosa con baja tasa de mortalidad, cultivo de huevos, estimación preliminar de la tasa de mutación, reproducción de langostas, así como detección, preservación y paso de los mutantes para garantizar la estabilidad de la población de las langostas editadas. Este método se puede utilizar como referencia para aplicaciones de edición de genes basadas en CRISPR / Cas9 en langostas migratorias, así como en otros insectos.

Este protocolo contiene los pasos detallados para generar mutantes homocigotos de las langostas migratorias con el RNP constituido por la proteína Cas9 y sgRNA sintetizado in vitro . Los siguientes son algunos resultados representativos de la eliminación del gen diana mediado por CRISPR/Cas9 en langostas, incluida la selección de dianas, la síntesis y verificación de sgRNA (Figura 1A), la recolección e inyección de óvulos, la detección y el paso de mutantes, la criopreservación y la...

Este estudio proporciona un procedimiento sistemáticamente optimizado de la construcción basada en ribonucleasa CRISPR / Cas9 de mutantes de langosta homocigota, así como un método detallado para la criopreservación y reanimación de los huevos de langosta.

Construcción de mutantes homocigotos de langostas migratorias utilizando tecnología CRISPR/Cas9

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...

La langosta migratoria es una prueba agrícola importante. Este método proporciona un protocolo eficiente y fácil de producir para los métodos de presión génica de la Es un método sistemático y detallado de una construcción CRISPR / CAS9 de mutantes de langosta homocigota, incluida la recolección de huevos, la detección de mutantes y el mantenimiento homocigótico. Para comenzar, prepare las agujas de inyección tirando de los capilares de vidrio con un extractor de micropipetas.Establezca los parámetros como se describe en el manuscrito de texto, luego muele la punta de la aguja de inyección con un micro molinillo. Preparar la proteína ribonucleo para la inyección mezclando un microlitro de proteína Cas9 con un microlitro del ARN guía único verificado. Luego agregue ocho microlitros de agua estéril libre de ARN para hacer el volumen final de la mezcla, 10 microlitros.Mezcle bien la solución y colóquela en hielo. A continuación, recoja las vainas de huevo recién puestas de la vaina de posición de los óvulos y espere el bronceado del huevo. Después de 30 minutos, use un cepillo fino para aislar los huevos de las vainas de huevo en agua y lave los huevos tres veces con agua estéril.Luego coloque los huevos en una placa de Petri y agregue agua estéril para mantenerlos húmedos. Llene la aguja de inyección con la solución de proteína ribonucleo preparada y cargue la inyección en el micromanipulador. Establezca los parámetros de microinyección como 300 Hectopascales de presión de inyección, 0,5 segundos de tiempo de inyección y 25 Hectopascales de presión de compensación.Cuando se ajusten los parámetros, presione el pedal para evaluar el volumen de la solución inyectada. Ajuste la presión de inyección y el tiempo de inyección para asegurarse de que el volumen de inyección sea de aproximadamente 50 a 100 nanolitros. Después de colocar los huevos estériles regularmente en la almohadilla de inyección, coloque la almohadilla en la mesa de objetos del microscopio y ajuste el aumento del microscopio hasta que se observen los huevos.Luego ajuste la aguja de microinyección bajo el microscopio hasta que se pueda ver la punta de inyección y coloque la punta cerca del huevo que se inyectará. Comience la inyección a una altura adecuada y en un ángulo de 30 a 45 grados. Inserte la punta en el huevo cerca de las micro pilas del huevo y presione el pedal para realizar la inyección.A continuación, retraiga la aguja rápidamente y mueva la almohadilla de inyección para inyectar el siguiente óvulo. Transfiera los huevos inyectados a una placa de cultivo con un trozo de papel de filtro húmedo. Colóquelos en una incubadora a 30 grados centígrados.Después de la inyección, verifique el desarrollo de los óvulos inyectados todos los días. Transfiera los huevos inyectados a una nueva placa de cultivo cada 24 horas en los primeros cinco días. En el sexto día después de la inyección, recoja y transfiera al azar 10 huevos a un tubo y muele adecuadamente los huevos con dos bolas de acero a 60 hercios durante seis minutos con un molinillo.Después de moler, vuelva a suspender los residuos en un mililitro PBS. Luego transfiera cinco microlitros de la mezcla resuspendida a 45 microlitros de hidróxido de sodio 50 milimolar para lisarse a 95 grados centígrados durante cinco minutos. Para terminar la reacción de lisis alcalina, agregue cinco microlitros de una solución molar de clorhidrato de Tris en el sistema de lisis.Tome un microlitro del producto de lisis como plantilla de PCR para amplificar el fragmento del gen diana. Después de la PCR y la secuenciación, compare los resultados de la secuenciación con la secuencia de tipo salvaje para evaluar si el sistema CRISPR / Cas9 escindió el gen objetivo in vivo. Permitir el resto de los huevos para su posterior desarrollo ya que los indeles se detectan en la etapa embrionaria.Después del desarrollo, la transferencia y el cultivo de las ninfas eclosionadas en una jaula de cría como se describe en el manuscrito. Cuando las ninfas se desarrollen hasta la quinta etapa de estadio, sepárelas con vasos de cultivo de plástico. Realizar cruzamientos utilizando los mutantes G0 y langostas de tipo salvaje.Después de recolectar oassists, use de tres a seis óvulos desarrollados en cada oassist para detectar mutaciones como se describió anteriormente. Mantener los oassists de mutación positiva para el desarrollo posterior y abandonar los oassists negativos para mutación. Para la criopreservación, lave los huevos con agua estéril e incubarlos en un plato de cultivo como se explicó anteriormente.Después de cinco a seis días, reúna los huevos en la placa de cultivo y cúbralos con fragmentos de papel de filtro. Luego envuelva todo el plato de cultivo con una película de parafina. Coloque el plato a 25 grados centígrados durante dos días, seguido de otros dos días a una temperatura más baja de 13 a 16 grados centígrados.Luego transfiera el plato a un refrigerador de seis grados centígrados. Agregue agua al plato cada dos semanas para proporcionar un ambiente húmedo para los huevos. Finalmente, para resucitar los huevos criopreservados, coloque la placa de Petri a 25 grados centígrados durante dos días.Más tarde, coloque los huevos en una incubadora de 30 grados centígrados hasta que las ninfas eclosionen. En este estudio, el sitio objetivo para el sistema CRISPR / Cas9 se localizó en el primer exón. En el ensayo de escisión Cas9, la proteína ribonucleo CRISPR/Cas9 pudo digerir el fragmento de PCR que contiene el sitio objetivo con una tasa de escisión de aproximadamente el 55%Los resultados de la secuenciación para la estimación de la tasa de mutación en estadio embrionario sugirieron una edición eficiente del genoma en el sitio objetivo.La eficiencia de edición resultó en una tasa de eclosión de ninfas del 52,73% y el 66,67% de los adultos G0 eran mutantes en mosaico. La estrategia de paso de las líneas mutantes se muestra aquí. El exceso de huevos homocigotos fue criopreservado para mejorar la tasa de utilización de los homocigotos.Aunque la tasa de eclosión de los huevos criopreservados se redujo con la extensión del tiempo de criopreservación, las acciones correctivas, como la aplicación de fragmentos de papel de filtro y la recuperación de estos huevos preservados con un gradiente de aumento de la temperatura, fueron útiles para la reanimación. Lo más importante es tratar de limitar el daño mecánico causado por la microinyección. Este procedimiento se puede utilizar como referencia para la obtención de otros insectos.Parte de algunos detalles como los métodos de recolección de huevos, inyección y el cultivo deben modificarse. Esta técnica también puede ser útil para estudiar la metamorfosis y la adaptación ambiental de los insectos y la construcción de mutantes de langosta homocigota aceleró la investigación en este campo.

construction-homozygous-mutants-migratory-locust-using-crisprcas9

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Genes esenciales para la supervivencia de plantean obstáculos técnicos para la creación de líneas mutantes. Leapfrogging evita mortalidad combinando genoma corrige con el trasplante de células de germen primordiales para crear tipo de salvaje animales portadores de mutaciones del germline. Evitamos también permite la generación eficiente de homocigotos mutantes nulos en la generación de1 F. Aquí, se demuestra el paso del trasplante.

Trasplante de células de germen primordiales para basada en CRISPR/Cas9 Leapfrogging en Xenopus

Aquí, presentamos un método para diseñar el genoma de C. elegans utilizando ribonucleoproteínas Cas9 CRISPR y plantillas de reparación dependiente de homología.

Un rápido y fácil tubería para generar genómica punto mutantes de C. elegans utilizando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

CRISPR/Cas9 se utiliza cada vez más para caracterizar la función génica en organismos no modelo. Este protocolo describe cómo generar líneas eliminatorias de Culex pipiens,desde la preparación de mezclas de inyección, hasta la obtención e inyección de embriones de mosquitos, así como la forma de criar, cruzar y detectar mosquitos inyectados y su progenie para detectar mutaciones deseadas.

Preparación e inyección de embriones de mosquitos Culex para generar mutaciones nulas utilizando CRISPR/Cas9

Proporcionamos un protocolo detallado para la cría, microinjección de huevos y para el apareamiento eficiente del firebrat Thermobia domestica para generar y mantener cepas mutantes después de la edición del genoma.

Microinyección de óvulos y apareamiento eficiente para la edición del genoma en la thermobia doméstica de firebrat

Aquí, se describen los métodos para las inyecciones pupales y adultos eficientes en Nasonia vitripennis como alternativas accesibles a la microinyección embrionaria, lo que permite el análisis funcional de los genes de interés utilizando ya sea arn-silenciamiento a través de la interferencia de ARN (RNAi) o knockout gen a través de CRISPR / Cas9 edición del genoma.

Inyecciones pupales y para adultos para RNAi y edición de genes CRISPR en Nasonia vitripennis

Este protocolo detalla los pasos de crispr/cas9 mutagénesis dirigida en moscas de arena: recolección de embriones, inyección, cría de insectos e identificación, así como selección de mutaciones de interés.

Mosca de arena (Phlebotomus papatasi) Microinjeción embrionaria para CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Muchas características de la eusocialidad de los insectos se basan en la comunicación dentro de la colonia y la división del trabajo. La manipulación genética de genes reguladores clave en embriones de hormigas a través de microinyección y mutagénesis mediada por CRISPR proporciona información sobre la naturaleza del comportamiento altruista en insectos eusociales.

Inyecciones de embriones para la mutagénesis mediada por CRISPR en el saltador de la hormiga Harpegnathos

Aquí se presenta un protocolo de microinyección embrionaria de Helicoverpa armigera (Hübner) e identificación de mutantes knockout creado por la edición del genoma CRISPR / Cas9. Los insectos mutantes permiten una mayor investigación de la función génica y la interacción entre diferentes genes in vivo.

Microinyección embrionaria e identificación de mutantes knockout de Helicoverpa armigera editada por el genoma CRISPR/Cas9 (Hübner)

Aquí hay protocolos para recolectar y microinyectar embriones precelulares de saltamontes de maíz con el fin de modificar su genoma a través de la edición del genoma basada en CRISPR / Cas9 o para la adición de elementos transponibles marcados a través de la transformación de la línea germinal.

Microinyección de saltamontes de maíz, Peregrinus maidis, embriones para la edición del genoma CRISPR/Cas9

Este artículo presenta los protocolos paso a paso para la mutagénesis CRISPR/Cas9 de la mosca oriental de la fruta Bactrocera dorsalis. Los pasos detallados proporcionados por este protocolo estandarizado servirán como una guía útil para generar moscas mutantes para estudios de genes funcionales en B. dorsalis.

Protocolos para la mutagénesis CRISPR/Cas9 de la mosca oriental de la fruta Bactrocera dorsalis

Aprende a construir mutantes homocigotos en langostas migratorias utilizando CRISPR/Cas9 con microinyección y criopreservación de embriones. Este protocolo optimizado facilita la investigación en ingeniería genética de insectos.

Construcción de mutantes homocigotos de langostas migratorias utilizando tecnología CRISPR/Cas9

Explorar más videos