Name: Cultivos celulares primarios para estudiar el potencial de regeneración de la glía murina de Müller después del tratamiento con microARN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprenda a cultivar glía de Müller murina para estudiar su conversión en células progenitoras retinianas mediante tratamiento con microARN. Este método permite evaluar candidatos antes de aplicaciones in vivo.

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Los autores agradecen a la Dra. Ann Beaton y a todos los miembros del laboratorio por su aporte sobre el manuscrito. Tom Reh, Julia Pollak y Russ Taylor por presentar los cultivos primarios de MG como una herramienta de detección a S.G.W. durante la capacitación postdoctoral en la Universidad de Washington en Seattle. El estudio fue financiado por la subvención del Programa de Innovación Empire (EIP) a S.G.W. y fondos de puesta en marcha de SUNY Optometry a S.G.W., así como el premio R01EY032532 del National Eye Institute (NEI) a S.G.W.

La Universidad de Washington ha solicitado una patente que incluye algunos de los hallazgos de este informe con los inventores Nikolas Jorstad, Stefanie G. Wohl y Thomas A. Reh. La patente se titula "Métodos y composiciones para estimular la regeneración de la retina.

Este protocolo describe cómo cultivar MG a partir de retinas de ratón disociadas para estudios de reprogramación utilizando miRNAs. Como se muestra y confirma en una variedad de estudios previos, la gran mayoría (80%-90%) de las células encontradas en estos cultivos son MG 20,23,24. Este método es una técnica muy robusta y fiable y los resultados se pueden reproducir fácilmente si se sigue correctamente el protocolo<sup class="x...

La glía de Müller (MG) es la glía predominante en la retina neural. Tienen funciones similares en comparación con otras glías en otras partes del sistema nervioso central, como mantener la homeostasis del agua y los iones, nutrir las neuronas y proteger el tejido. Las MG tienen otra característica fascinante: aunque son glía madura, todavía expresan muchos genes expresados en células progenitoras de la retina (RPC) durante el desarrollo tardío 1,2. Se supone que esta semejanza es la razón de la regeneración neuronal natural basada en MG en la retina de los peces después del daño retiniano 3,4. Durante este proceso, la MG vuelve a entrar en el ciclo celular y se desdiferencia en RPC que luego se diferencian en los seis tipos de neuronas retinianas. Aunque este fenómeno ocurre naturalmente en los peces, las MG de mamíferos no se convierten en neuronas 5,6. Sin embargo, pueden reprogramarse. Se ha demostrado que una variedad de factores reprograman la MG en RPC/neuronas; entre estos factores se encuentra el factor de transcripción básico hélice-bucle-hélice (bHLH) homólogo 1 (Ascl1) que interviene en la regeneración de peces 7,8. En ratones, Ascl1 solo se expresa en RPC durante la retinogénesis, pero está ausente en neuronas maduras mg o retinianas9.
La reprogramación de células directamente in vivo no solo es un desafío metodológico, sino que también requiere la aprobación de un comité institucional de cuidado y uso de animales. Para recibir la aprobación, se requieren datos preliminares sobre los factores utilizados o alterados, las concentraciones, los efectos fuera del objetivo, los mecanismos subyacentes, la toxicidad y la eficiencia. Los sistemas de cultivo celular permiten probar estos criterios antes de su uso en modelos in vivo. Además, dado que la MG solo comprende alrededor del 5% de toda la población de células retinianas10, los cultivos de MG permiten estudiar su función11 así como su comportamiento, incluyendo la migración 12,13, la proliferación14, la reacción al estrés ante una lesión/daño 15,16, su interacción con otros tipos celulares como la microglía17 o las células ganglionares de la retina (RGC)18, o su potencial neurogénico 19,20,21. Muchos investigadores utilizan líneas celulares inmortalizadas para sus estudios, ya que tienen un potencial proliferativo ilimitado y pueden mantenerse y transfectarse fácilmente. Las células primarias, sin embargo, son preferibles para ensayos biológicamente relevantes que las células inmortalizadas, ya que tienen verdaderas características celulares (expresión de genes y proteínas) y, lo que es más importante, representan una cierta etapa en el desarrollo y, por lo tanto, tienen una "edad". La edad de un animal (y en consecuencia de las células obtenidas de un animal) es un factor especialmente crucial en la reprogramación celular, ya que la plasticidad celular se reduce con la etapa avanzada de desarrollo22.
Este protocolo describe en detalle cómo reprogramar la MG primaria con miRNAs como un método in vitro actual para estudiar la regeneración. Este modelo de cultivo primario de MG se estableció en 2012 para evaluar las características de proliferación celular de MG en ratones knock-out P53 (ratones trp53-/-)23. Se demostró que la MG cultivada mantiene sus características gliales (es decir, la expresión de las proteínas S100β, Pax6 y Sox2 evaluadas mediante el etiquetado inmunofluorescente), y que se asemejan a la MG in vivo (microarray de MG purificada por FACS)23. Poco después, la expresión de ARNm glial y proteínas fue validada y confirmada en un enfoque diferente utilizando vectores virales20. Unos años más tarde, se confirmó que la gran mayoría de las células encontradas en estos cultivos son MG mediante el uso del Rlbp1 específico de MGCreERT:tdTomatoSTOPfl/fl reporter mouse24. Además, la cuantificación del conjunto de miRNAs tanto en MG purificada por FACS como en MG primaria cultivada mostró que los niveles de mg miRNAs (mGLiomiRs) no varían mucho en MG cultivada durante la fase de crecimiento. Los períodos de cultivo alargados, sin embargo, causan cambios en los niveles de miRNA y, en consecuencia, en los niveles de ARNm y la expresión de proteínas, ya que los miRNAs son reguladores traslacionales25.
En 2013, este modelo de cultivo de MG se utilizó para probar una variedad de factores de transcripción con respecto a su capacidad para reprogramar MG en neuronas retinianas20. Se encontró que Ascl1 era un factor de reprogramación muy robusto y confiable. La sobreexpresión de Ascl1 a través de vectores virales indujo cambios morfológicos, expresión de marcadores neuronales y la adquisición de propiedades electrofisiológicas neuronales. Más importante aún, los conocimientos y resultados obtenidos de estos primeros experimentos in vitro se transfirieron con éxito a aplicaciones in vivo 22,26 demostrando que los cultivos primarios de MG representan una herramienta sólida y confiable para el cribado factorial inicial y la evaluación de las características gliales antes de la implementación in vivo.
Hace unos años, se demostró que el miRNA miR-124 enriquecido con cerebro, que también está altamente expresado en las neuronas de la retina, puede inducir la expresión de Ascl1 en MG21 cultivado. La expresión de Ascl1 en células vivas se visualizó a través de un ratón reportero Ascl1 (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl). Un ratón reportero es un ratón genéticamente modificado que tiene un gen reportero insertado en su ADN. Este gen reportero codifica para una proteína reportera, que es en este estudio tdTomato, una proteína fluorescente roja. Esta proteína reportera informa de la expresión de un gen de interés, en este caso, Ascl1. En otras palabras, las células que expresan Ascl1 se volverán rojas. Dado que Ascl1 solo se expresa en RPC9, este ratón Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl permite el seguimiento de la conversión de MG en RPC que expresan Ascl1, lo que significa que las células convertidoras expresarán la proteína reportera tdTomato fluorescente roja. Este es un etiquetado irreversible ya que el ADN de estas células está alterado. En consecuencia, cualquier diferenciación neuronal posterior se visualizará porque la etiqueta tdTomato permanece en las células diferenciadoras. Si Ascl1 que expresa RPC derivados de MG (con etiqueta tdTomato) se diferencian en neuronas, estas neuronas aún tendrán su etiqueta roja. Este ratón, por lo tanto, permite no solo el etiquetado de RPC derivados de MG para imágenes de células vivas, sino que también permite el mapeo del destino y el rastreo de linaje de estos RPC derivados de MG (rojos). Más recientemente, se identificó el conjunto de miRNAs en RPC y se utilizaron cultivos MG de ratones Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-reporter para detectar y probar el efecto de estos miRNAs sobre la capacidad de reprogramación y la eficiencia27. Un candidato, el RPC-miRNA miR-25, se encontró capaz de reprogramar la MG cultivada en células que expresan Ascl1 (Ascl1-Tomate+). Estas células reprogramadas adoptan características neuronales a lo largo del tiempo, incluida la morfología neuronal (somatas pequeños y procesos finos cortos o largos), la expresión de transcripciones neuronales medidas a través de scRNA-Seq, así como la expresión de proteínas neuronales validadas mediante el etiquetado inmunofluorescente27.
Aquí, el protocolo detalla cómo cultivar y transfectar MG a partir de ratones P12 adaptados del trabajo anterior 21,24,27. Elegido para este protocolo es el mencionado miRNA miR-25, un miRNA altamente expresado en RPCs, con bajos niveles de expresión en MG o neuronas retinianas. Para sobreexpresar miR-25, se utilizan imitaciones murinas de miR-25, es decir, moléculas artificiales de miRNA. Como control, se eligen imitaciones de un miRNA de Caenorhabditis elegans, que no tienen función en células de mamíferos. La visualización de la conversión de MG en RPC se realizó a través del ratón reportero RPC (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), un ratón con fondo mixto (cepas C57BL/6, S129 e ICR). Sin embargo, este cultivo se puede realizar con todas las cepas de ratón, incluidas las cepas de tipo salvaje. En los últimos años, el protocolo original se ha modificado para reducir la duración de la fase de crecimiento y el período de cultivo general y garantizar un estado de células de la glía más robusto y minimizar el grado de degeneración celular, que ocurre en períodos de cultivo prolongados. La ventana de tiempo de transfección regular también se amplió de 3 h a 2 días. Como se mencionó anteriormente, aunque el protocolo actual describe los cultivos de MG como una herramienta para estudios de regeneración, el método no solo es útil para probar factores de reprogramación, sino que también se puede adaptar para otras aplicaciones, incluidos estudios sobre el comportamiento migratorio o proliferativo de MG, paradigmas relacionados con lesiones / daño celular y / o la identificación de mecanismos y vías subyacentes.

<table><tbody><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J</td><td>Jax laboratories</td><td>#012882</td><td>ratones Ascl1-CreERT se cruzaron con ratones tdTomato tdTomato-STOPfl</td></tr><tr><td>/fl mouse&nbsp; B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomate)Hze/J</td><td>Jax laboratories</td><td>#007914</td><td>Se requiere genotipado para identificar ratones positivos para Ascl1CreER</td></tr><tr><td><reactivos fuertes>reactivos</fuertes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Z)-4-hidroxitamoxifeno, &ge; Isómero Z al 98 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904-5MG</td><td>reconstituido en etanol, alícuotas congeladas</td></tr><tr><td>16 % Solución acuosa de paraformaldehído (PFA)</td><td>VWR</td><td>100504-782</td><td>PFA al 2% elaborado con solución salina tamponada con fosfato (PBS), alícuotas congeladas</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragmento de burro anti-conejo IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>711-546-152</td><td>dilución 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragmento de burro Anti-Cabra IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>705-606-147</td><td>dilución 1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo Otx2 antihumano, R& D Systems</td><td>Fisher Scientific</td><td>AF1979</td><td>dilución 1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-conejo MAP2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9942-200UL</td><td>dilución 1:250</td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-Proteína Fluorescente Roja (RFP)</td><td>Anticuerpos-Dilución en línea</td><td>ABIN334653</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72132</td><td>reconstituido en PBS, alícuotas congeladas</td></tr><tr><td>Suplemento B-27</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-504-044</td><td>alícuotas congeladas</td></tr><tr><td>Brain Phys Neuronal Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05790</td><td>utilizado como medio neuronal en la sección 1.2, almacenar en 4 & deg; C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit Fisher</td><td>Scientific</td><td>C10340</td><td>reconstituir el siguiente manual, 4&deg; C</td></tr><tr><td>Dibutiril-cAMP</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>73886</td><td>reconstituido en Dimetilsulfóxido (DMSO), alícuotas congeladas</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25950CQC</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35010CV</td><td>alícuotas congeladas</td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; Opti-MEM Sérum Reducido Medio, Suplemento GlutaMAX</td><td>Fisher Scientific</td><td>51-985-034</td><td>tienda a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; Enzima TrypLE Express (1X), rojo de fenol</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-605-028</td><td>utilizado como solución que contiene tripsina, almacenar a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-025-134</td><td>tienda en 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Proteína de ratón laminina, natural</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-017-015</td><td> alícuotas congeladas, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.164323 1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN suLirnQzunvMEuS9wA08uY- 26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) </td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-030-081</td><td>alícuotas congeladas</td></tr><tr><td>miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control</td><td>Horizon</td><td>CN-001000-01-50</td><td>reconstituidas en agua libre de RNasa (200 &micro; M), alícuotas congeladas</td></tr><tr><td>miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic</td><td>Horizon</td><td>C-310564-05-0050</td><td>reconstituidas en agua libre de RNasa (200 &micro; M), alícuotas congeladas</td></tr><tr><td>N-2 Suplemento</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-502-048</td><td>alícuotas congeladas</td></tr><tr><td>Medio Neurobasal Fisher</td><td>Scientific</td><td>21-103-049</td><td>utilizado para medio de crecimiento en la sección 1.1, almacenar a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Sistema de disociación de papaína</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003153</td><td>reconstituido en una solución salina equilibrada de Earle, alícuotas congeladas</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td>alícuotas congeladas</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>20-012-043</td><td></td></tr><tr><td>Hidrobromuro de poli-L-ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4538-50MG</td><td>reconstituido en agua estéril, alícuotas congeladas</td></tr><tr><td>Proteína BDNF humana recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>248-BDB-050/CF</td><td>reconstituido en PBS y FBS estériles, alícuotas congeladas</td></tr><tr><td>Proteína recombinante EGF de ratón</td><td>Fisher Scientific</td><td>2028EG200</td><td>reconstituida en PBS estéril, alícuotas congeladas</td></tr><tr><td>Proteína recombinante Rat GDNF Fisher</td><td>Scientific</td><td>512GF010</td><td>reconstituida en PBS estéril, alícuotas</td></tr> <tr><td>congeladasRojo Rodamina 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragmento de burro Anti-Rata IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>712-296-150</td><td>dilución 1:1.000</td></tr><tr><td>Medio de montaje de portaobjetos</td><td>Fisher Scientific</td><td>OB100-01</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de transfección (Lipofectamine 3000)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>L3000015 store at 4 &deg; C</td></tr><tr><td><fuerte>plásticos/suministros</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,6 mL tubo de microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-408-120</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL tubo de microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-408-129</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L CONSEJO&nbsp; filtro estéril&nbsp; Puntas de pipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-439</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; L CONSEJO&nbsp; filtro estéril Puntas de pipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-431</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L Filtro estéril TIP Puntas de pipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-404</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 2,0</td><td>mL Fisher Scientific</td><td>50-408-138</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; L CONSEJO&nbsp; filtro estéril Puntas de pipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-432</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de volumen ajustable (2.5, 10, 20, 100, 200 y 1000 & micro; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>2231300008</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia desechables</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-669-12</td><td></td></tr><tr><td>Placas de fondo plano multipocillo con tapa, n.º de pocillos=12</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>Placas de fondo plano multipocillo con tapa, n.º de pocillos=24</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>PIPET&nbsp; filtro estéril 10ML Desechable Serológico Pipetas</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>PIPET&nbsp; filtro estéril 50ML Pipetas Serológicas Desechables</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10Q</td><td></td></tr><tr><td>PIPET&nbsp; filtro estéril 5ML Pipetas Serológicas Desechables</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10H</td><td></td></tr><tr><td>Guantes de Examen de Nitrilo Sin Polvo</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-130-1597B</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos redondos (12 mm de diámetro, 0,17 - 0,25 mm de grosor)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22293232</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Filter, tamaño de poro = 0,22 y micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-106</td><td></td></tr><tr><td>equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1300 B2 Cabina de bioseguridad</td><td>Thermo Scientific</td><td>1310</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia todo en uno Keyence BZ-X 810</td><td>Keyence</td><td>9011800000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico con zoom binocular</td><td>Vision Scientific</td><td>VS-1EZ-IFR07</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri desechables (100 mm de diámetro)</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5 - Biologie/Titanium</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #55 - Biologie/Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas curvas Dumont #7 - Biologie/Titanium</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>2231000508</tr><tr><td>Tijeras finas afiladas</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras McPherson-Vannas, 8 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>14124</td><td></td></tr><tr><td>Baño de perlas metálicas</td><td>Lab Armor</td><td>74309-714</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador nutante, eléctrico=115V, 60Hz, velocidad=24 rpm</td><td>VWR</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de disección recubierta de silicona (90 mm diámetro)</td><td>Living Systems Instrumentación</td><td>DD-ECON-90-BLK-5PK</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas, economía #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>501979</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2 con camisa de agua</td><td>VWR</td><td>10810-744</td><td></td></tr></tbody></table>

cultivos celulares primarios para estudiar el potencial de regeneración de la glía murina de müller después del tratamiento con microarn

Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

La glía de Müller (MG) es la glía predominante en la retina neural y puede funcionar como una fuente regenerativa para las neuronas retinianas. En vertebrados inferiores como los peces, la regeneración impulsada por MG ocurre naturalmente; en los mamíferos, sin embargo, se requiere estimulación con ciertos factores o manipulación genética/epigenética. Dado que la MG comprende solo el 5% de la población de células de la retina, existe la necesidad de sistemas modelo que permitan el estudio de esta población celular exclusivamente. Uno de estos sistemas modelo son los cultivos primarios de MG que son reproducibles y se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones, incluida la detección e identificación de moléculas / factores, pruebas de compuestos o factores, monitoreo celular y / o pruebas funcionales. Este modelo se utiliza para estudiar el potencial de la MG murina para convertirse en neuronas de la retina después de la suplementación o inhibición de microARN (miARN) a través de la transfección de miARN artificiales o sus inhibidores. El uso de ratones reporteros específicos de MG en combinación con el marcado inmunofluorescente y la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) confirmó que el 80%-90% de las células encontradas en estos cultivos son MG. Usando este modelo, se descubrió que los miRNAs pueden reprogramar MG en células progenitoras de la retina (RPC), que posteriormente se diferencian en células similares a las neuronales. Las ventajas de esta técnica son que los candidatos a miRNA pueden ser probados por su eficiencia y resultado antes de su uso en aplicaciones in vivo .

Este protocolo describe cómo cultivar MG a partir de retinas de ratón P12 y cómo reprogramar estas células con miR-25 en neuronas retinianas utilizando el ratón reportero Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC. Este método fue utilizado en trabajos previos reportando en detalle otros miRNAs adecuados (imitadores o inhibidores, como moléculas individuales o en combinación) para reprogramar MG en RPC que luego adoptan características celulares neuronales27. Este método ha s...

Los cultivos primarios de Müller glia obtenidos a partir de retinas de ratón representan una herramienta muy robusta y fiable para estudiar la conversión glial en células progenitoras de la retina tras el tratamiento con microARN. Las moléculas individuales o combinaciones pueden ser probadas antes de su posterior aplicación de enfoques in vivo .

Cultivos celulares primarios para estudiar el potencial de regeneración de la glía murina de Müller después del tratamiento con microARN

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates ...

Este protocolo permite estudiar el potencial y la capacidad de la glía de Muller para convertirse en células progenitoras de la retina después del tratamiento con factores específicos como microRNAs. La ventaja de esta técnica es que los candidatos de microARN pueden ser probados por su eficiencia y resultado antes de su uso en aplicaciones in vivo. Ayudando a demostrar el procedimiento estará Seoyoung Kang, un estudiante de doctorado del laboratorio de Stefanie Wohl.Primero, sumerja brevemente el globo ocular extraído en un tubo con etanol para evitar el arrastre de bacterias del animal. Luego, lave el globo ocular brevemente en la placa de Petri de 10 centímetros antes de colocarlo en la placa de 24 pocillos sobre hielo. Una vez que se hayan retirado y limpiado los globos oculares, coloque un ojo en el plato de disección colocado bajo un microscopio de disección con una fuente de luz.Ahora fije un globo ocular agarrando el nervio óptico y el tejido conectivo circundante alrededor de la esclerótica con pinzas finas Dumont 5 y presiónelo cuidadosamente contra la placa de disección. Luego, haga un orificio en el centro de la córnea con una aguja de calibre 30 para permitir un acceso más fácil para las tijeras venosas. Luego, diseccione la córnea alrededor del cuerpo ciliar con tijeras venosas y retire cuidadosamente la córnea, el cristalino, el iris y el cuerpo vítreo con pinzas finas Dumont 5.Posteriormente diseccionar la esclerótica con tijeras venosas hasta alcanzar el nervio óptico y extraer cuidadosamente la retina utilizando pinzas finas Dumont 5. Ahora use un segundo pinzas finas Dumont 5 para empujar contra la retina y eliminar completamente el cuerpo vítreo. Transfiera las retinas cortadas aproximadamente 2,5 centímetros de la punta de una pipeta de transferencia estéril para agrandar el diámetro.Ahora, usando este consejo, recoja retinas enteras sin dañar el tejido y transfiera las retinas a una nueva placa de Petri estéril con HBSS frío y balancee el plato. A continuación, utilizando una nueva pipeta de transferencia estéril, empuje cuidadosamente las retinas para lavar las células epiteliales pigmentarias de la retina. Coloque inmediatamente la retina aislada en un nuevo pocillo limpio de la placa de 24 pocillos llena con un mililitro de HBSS mientras mantiene la placa de 24 pocillos en el hielo durante la disección.Prepare la mezcla de disociación de la DNasa I de la papaína como se describe en el manuscrito. Ahora, con una pipeta de transferencia de punta agrandada, levante las retinas. Espere hasta que las retinas se asienten en la parte inferior de la punta y libere las retinas sin HBSS excesivo en el tubo que contiene la mezcla de papaína DNasa I.A continuación, coloque el tubo en un nutator en la incubadora e incube durante 10 minutos a 37 grados centígrados y con 5% de dióxido de carbono. A continuación, disocie las células pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de un mililitro. Después de disociar las células, agregue 275 microlitros de inhibidor de la proteasa ovomucoide del kit de disociación de papaína para neutralizar la papaína y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo.Coloque los tubos en una centrífuga y gire a cuatro grados centígrados durante ocho minutos a una fuerza centrífuga relativa de 300. Agregue el factor de crecimiento epidérmico al volumen calculado del medio de crecimiento precalentado a 37 grados centígrados. Retire los tubos con cuidado de la centrífuga.Sin tocar el pellet en el fondo del tubo, retire el sobrenadante con cuidado y por completo. Ahora resuspender el pellet celular con 500 microlitros de factor de crecimiento epidérmico suplementado con medio de crecimiento. Luego, transfiera la suspensión celular a un pocillo de la placa de 12 pocillos etiquetada.Enjuague el tubo con otros 500 microlitros del medio de crecimiento suplementado con factor de crecimiento epidérmico y agréguelo al pozo. Balancee la placa del pozo con cuidado y luego coloque la placa en la incubadora a 37 grados centígrados con dióxido de carbono. Comience por verificar la confluencia celular del 90% al 100%.A continuación, retire el medio y agregue un mililitro de HBSS frío para lavar el pozo. Balancee suavemente la placa y retire HBSS sin dejar rastros. Más tarde, agregue 500 microlitros de una solución que contenga tripsina precalentada para separar las células del pozo.Rock suavemente e incubar durante dos minutos en una incubadora de 37 grados centígrados. Después de mover la placa de la incubadora al gabinete de bioseguridad, aspire la solución que contiene tripsina mientras se inclina. Dispersarlo cuidadosa y lentamente sobre el pozo varias veces hasta que las células se desprendan por completo.A continuación, transfiera esta suspensión celular a un tubo estéril de 1,5 mililitros y coloque los tubos en la centrífuga. Gire a 300 veces g durante ocho minutos a cuatro grados centígrados y vuelva a colocar los tubos en el gabinete de bioseguridad. Retire el sobrenadante sin tocar el pellet.Ahora resuspenda cuidadosamente el pellet celular agregando 600 microlitros de medio de crecimiento precalentado y pipeteando hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 30 a 40 veces. Finalmente, siembre 100 microlitros de la suspensión celular obtenida en el centro de seis cubreobjetos recubiertos de la placa de 24 pocillos. Coloque la placa en la incubadora y deje que las células se asienten para la transfección posterior utilizando micro imitadores de ARN.La figura muestra las condiciones de control cinco días después de la transfección con algunas células positivas para Ascl1-Tomato presentes. Sin embargo, después de un tratamiento con miR-25, se encuentran muchas más células positivas para Ascl1-Tomato. La cuantificación reveló un aumento de cuatro veces en el número de células positivas para Ascl1-Tomato en los pocillos tratados con miR-25 en comparación con los controles.Lo más importante es que la gran mayoría de las células positivas para Ascl1-Tomate encontradas en los pocillos tratados con riR-25 adoptaron una morfología neuronal. Las características de esta morfología neuronal incluían la reducción del tamaño del soma celular, el desarrollo de procesos finos y la formación de pequeñas redes. La cuantificación reveló que alrededor del 70% de todas las células positivas para Ascl1-Tomato tenían características neuronales.El marcado inmunofluorescente muestra que las células positivas para Ascl1-Tomato con morfología neuronal expresan los marcadores neuronales OTX2 y MAP2, confirmando la identidad neuronal. La cuantificación de estas células reveló que después de la sobreexpresión de miR-25, alrededor de 40 neuronas positivas para Ascl1-Tomato por campo están presentes en comparación con cinco células neuronales por campo en los controles. Las células neuronales identificadas constituyen aproximadamente el 70% de la población total de células positivas para Ascl1-Tomate de las muestras tratadas con miR-25.Además, la cuantificación del número absoluto de neuronas que coexpresan OTX2 y MAP2 mostró que después del tratamiento con miR-25, se encontraron alrededor de 60 neuronas por campo en comparación con 10 neuronas por campo en los controles. Es imperativo trabajar en un ambiente limpio y desinfectado con herramientas limpias y estériles y trabajar con cuidado evitando cualquier tratamiento severo. Las aplicaciones posteriores pueden ser, por ejemplo, cuantificación de proteínas, análisis de ADN o ARN, o estudios electrofisiológicos.Esta técnica nos ayudó a explorar preguntas iniciales sobre la reprogramación nuclear que pertenece al campo de la medicina regenerativa. Y hay una larga gama de factores y condiciones que se pueden probar para explorar nuevas preguntas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este video muestra el aislamiento y cultivo de células progenitoras neurales cerebelosas del cerebelo de un cachorro de ratón. Los progenitores de las neuronas granulosas cerebelosas se aíslan y purifican a través de la adhesión diferencial, eliminando eficazmente los astrocitos. Estos progenitores cultivados se diferencian posteriormente en neuronas granulosas cerebelosas.

Aislamiento y cultivo de progenitores granulares de neuronas cerebelosas murinas

Este video muestra el cultivo de células gliales de Müller (MG) aisladas de retinas de ratones. Las retinas se disocian en una suspensión unicelular utilizando enzimas digestivas. Luego, las células se cultivan en un medio con un factor de crecimiento que promueve la proliferación de células MG y la mortalidad de las células neuronales. Las células neuronales muertas se eliminan durante el paso, y las células MG se cultivan para su posterior análisis.

Establecimiento de un cultivo de células gliales de Müller obtenido de retinas de ratón

Este video muestra una técnica para aislar y cultivar células gliales mixtas primarias de tejido de la médula espinal de ratón adulto. El protocolo implica la digestión enzimática del tejido, seguida de la eliminación de las membranas celulares rotas y los restos de mielina para obtener una población de una sola célula. A continuación, las células se cultivan en medios optimizados para el crecimiento de células gliales mixtas.

Establecimiento de cultivos primarios de células gliales mixtas a partir de la médula espinal de un ratón

Nosotros describimos métodos para el aislamiento / cultura eficiente y rápida de la microglia viable desde la corteza cerebral neonatal y adulto de la médula espinal. La disección y placas de microglia cortical se puede lograr dentro de los 90 minutos, con la cosecha microglial posterior que tiene lugar ~ 10 días después de la disección inicial.

Microglia cultivo del Sistema Nervioso Central Neonatal y Adultos

Aquí se describe un protocolo detallado para la generación simultánea de cultivos de células precursoras neurales, ya sea como monocapas o neuroesferas adherentes, de la zona subventricular y giro dentado de ratones adultos individuales.

Un ratón, dos culturas: Aislamiento y cultivo de adultos Neural las células madre de las dos zonas neurogénicos de ratones individuales

Esfuerzos para comprender la función microglial en detalle han impedido por la falta de modelos de cultura microglial que recapitular las propiedades de microglia maduros en vivo . Este protocolo describe un acercamiento aislamiento y cultura diseñado para mantener la supervivencia robusta de microglia altamente ramificados de rata maduro medio definido en condiciones.

Aislamiento y cultivo de Microglia roedor para promover una dinámica ramifican morfología en medio libre de suero

Presentamos un modelo in vitro para evaluar la capacidad neurorregenerativa olfativa ensheathing glia (OEG), después de una lesión neuronal. Se basa en un cocultivo de neuronas ganglionas de retina adultas axotomizadas (RGN) en monocapas OEG y posterior estudio de regeneración axonal, mediante el análisis de marcadores axoales y somatodendriáticos RGN.

Cocultura de neuronas ganglionas retinal de rata axotomizada con glia olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta

Los cultivos primarios de microglía se utilizan comúnmente para evaluar nuevas moléculas antiinflamatorias. El presente protocolo describe un método reproducible y relevante para aislar magnéticamente la microglía de cachorros neonatos.

Aislamiento magnético de células microgliales de ratones neonatos para cultivos celulares primarios

Este protocolo presenta una forma única de generar cultivos celulares del sistema nervioso central a partir de cerebros embrionarios de ratón del día 17 para la investigación neuro(inmuno)lógica. Este modelo se puede analizar utilizando varias técnicas experimentales, incluyendo RT-qPCR, microscopía, ELISA y citometría de flujo.

Establecimiento de cultivos mixtos de células neuronales y gliales a partir de cerebros embrionarios de ratones para estudiar la infección y la inmunidad innata

Este manuscrito describe un protocolo detallado para aislar células de Müller gliales de la retina de ojos de ratón. El protocolo comienza con la enucleación y disección de los ojos de los ratones, seguida del aislamiento, la siembra y el cultivo de las células de Müller.

Aislamiento de células Müller gliales retinianas primarias de ratón

Aprenda a cultivar glía de Müller murina para estudiar su conversión en células progenitoras retinianas mediante tratamiento con microARN. Este método permite evaluar candidatos antes de aplicaciones in vivo.

Cultivos celulares primarios para estudiar el potencial de regeneración de la glía murina de Müller después del tratamiento con microARN (Video) | JoVE Journal

Cultivos celulares primarios para estudiar el potencial de regeneración de la glía murina de Müller después del tratamiento con microARN

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