Name: Detección de Wolbachia Strain wAlbB en líneas celulares de Aedes albopictus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprende a detectar Wolbachia en líneas celulares de Aedes albopictus usando cuatro métodos complementarios. Este protocolo mejora la precisión en la identificación de infecciones intracelulares para estudiar interacciones huésped-bacteria.

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Agradecemos al Dr. Xin-Ru Wang de la Universidad de Minnesota por sus perspicaces sugerencias y orientación. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.81760374).

1. Materiales y reactivos
<ol><li>Utilice soluciones y medios libres de pirógenos para el cultivo celular (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Use agua ultrapura para preparar todas las soluciones.</li>
	<li>Tenga cuidado al seleccionar el suero fetal bovino (FBS) para el cultivo celular, después de un proceso de verificación de lotes. NOTA: Como los lotes fbs están sujetos a cambios regulares, es imposible indicar el catálogo y los números de lote relevantes en este protocolo.</li>
	<li>Seleccionar cepas celulares de Aa23 derivadas de huevos de A. albopictus , correspondientes a Aa23-T libre de Wolbachia.</li>
</ol>2. Cultivo celular
<ol><li>Preparar matraces de cultivo celularde 25 cm 2 con 4 mL de medio de Schneider con 10% de FBS.</li>
	<li>Incubar los matraces a 28 °C bajo una atmósfera de 5% de CO2 durante 5 a 7 días 7,24.</li>
	<li>Observe células Aa23 y Aa23-T no teñidas en los matraces utilizando microscopía de luz con un aumento de 100x (Figura 1).</li>
</ol>3. Extracción de ADN
<ol><li>Cultive las células durante 5-7 días hasta una confluencia del 70-80% por matraz (paso 2). Cosechar las células con pipeteo manual de 1 mL de medio de cultivo resuspendido por centrifugación durante 5 min a 100 × g en una microcentrífuga.</li>
	<li>Retire el sobrenadante por aspiración y almacene el pellet celular resultante a -20 °C.</li>
	<li>Resuspender los gránulos en 0,40 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), colocar 50 μL de la solución en un tubo de microcentrífuga, añadir 5 μL de proteinasa K (20 mg/ml) e incubar a 55 °C durante 1 h. Finalmente, caliente estos tubos a 99 °C durante 15 min para obtener el ADN crudo y almacenarlo a -20 °C.</li>
</ol>4. Detección del ácido nucleico Wolbachia
<ol><li>Análisis PCR<ol>
<li>Realizar PCR en un volumen total de reacción de 20 μL, que contiene 8 μL de ddH2O, 10 μL de Taq polimerasa (ver la Tabla de Materiales), 1 μL de plantilla de ADN (del paso 3), 0,5 μL de cebadores hacia adelante y hacia atrás (10 μM): wsp81F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') y wsp691R (5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')25, respectivamente.</li>
		<li>Utilice las siguientes condiciones de PCR: desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 min, seguida de 35 ciclos de desnaturalización a 94 °C, recocido a 55 °C y extensión a 72 °C; luego, una extensión final a 72 °C durante 7 min.</li>
		<li>Detecte el ADN en un gel de agarosa al 1% (1% p/v de agarosa en PBS) utilizando un generador de imágenes de gel.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis qPCR<ol>
<li>Analizar la copia del genoma de Wolbachia para tres réplicas biológicas (n = 6) del ADN extraído (paso 3) utilizando cebadores wsp 183 F (5' AAGGAACCGAAGTTCATG 3') y QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAGTCCC 3')22, normalizados con cebadores de proteína ribosómica S6 (RPS6) hacia adelante y hacia atrás (5' GAAGTTGAACGTATCGTTTC 3' y 5' GAGATGGTCAGCGGTGATTT 3', respectivamente)3.</li>
		<li>Genere una curva estándar para wAlbB y RPS6.<ol>
<li>Extraer ADN de PMD-18T (un vector especial para la clonación eficiente de productos de PCR (clonación de TA)) plásmido recombinante que contiene fragmentos de genes wsp y rps6 (Archivo suplementario) y medir la concentración de ADN plásmido (ver la Tabla de Materiales).</li>
			<li>Convierta la concentración de ADN plásmido a la concentración de número de copia usando Eq (1). Número de copias del plásmido = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63662/63662eq01v3.jpg"> (1)</li>
			<li>Diluya el número de copia del plásmido de 101 a 108 con agua ultrapura y establezca 3 réplicas para cada gradiente de concentración.</li>
			<li>Realice la amplificación de qPCR utilizando TB Green y un sistema de PCR en tiempo real (consulte la Tabla de materiales), y registre los resultados de cada reacción. Utilice el valor Ct para desarrollar una curva estándar. Analizar el ADN en un volumen total de reacción de 20 μL, que comprende 7 μL de ddH2O, 10,4 μL de TB Green (consulte la Tabla de Materiales), 1 μL de plantilla de ADN (proporcionada por el Paso 3) y 0,8 μL de cebadores hacia adelante y hacia atrás (10 μM). Utilice las siguientes condiciones de reacción: desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 min, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 10 s y recocido a 60 °C durante 35 s.</li>
			<li>Calcular los números de copia de los genes WSP y RPS6 en las células de acuerdo con la curva estándar establecida y la densidad relativa de Wolbachia por el número de copia de wsp/RPS6. Analice los datos utilizando una prueba t de muestras independiente.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de Western blot de la proteína Wolbachia<ol>
<li>Extracción de proteínas<ol>
<li>Recolecte 2 × 107 células Aa23 y Aa23-T de la placa de seis pocillos (a partir del paso 2) en un tubo de microcentrífuga, lávelas tres veces con PBS y centrífuguelas a 100 × g durante 5 min a 4 °C.</li>
			<li>Preparar 1 ml de lisados con tampón de lisis RIPA (50 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1%Triton X-100, 1% desoxicolato de sodio, 0.1% dodecil sulfato de sodio [SDS], 2 mM de pirofosfato de sodio, 25 mM de β-glicerofosfato, 1 mM de EDTA, 1 mM de Na3VO4, 0.5 μg/mL de leupeptina) y PMSF (concentración final de 1 mM).</li>
			<li>Agregue 200 μL de tampón de lisis al pellet celular y manténgalo durante 30 minutos en hielo. Centrifugar los lisados a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C y retirar el sobrenadante.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Evalúe la concentración wsp del sobrenadante utilizando un kit de ensayo de proteína de ácido bicinconínico (BCA) (consulte la Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Cargue cantidades iguales de proteína en un gel SDS-PAGE al 15% [10% agua destilada; 50% (30% Acr-Bis (29:1), 38% 1 M Tris, pH 8.8; 1% (10% SDS), 1% (10% persulfato de amonio), 0.04% TEMED].</li>
		<li>Transfiera la proteína a las membranas de nitrocelulosa, bloquee las membranas con leche desnatada al 5% durante 2 h 26,27 a temperatura ambiente, y luego lave las membranas tres veces con TBST (1 ml de Tween 20 en 1 L de TBS) (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Incubar las membranas durante la noche a 4 °C con 100 μL de anticuerpo policlonal anti-wsp (preparado internamente, ver Archivo Suplementario)), preparado diluyendo el anticuerpo primario con leche desnatada al 5% (1:12.000).</li>
		<li>Lave el anticuerpo primario tres veces con TBST.</li>
		<li>Incubar las membranas en 100 μL de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) en un agitador durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave las membranas tres veces con TBST y mezcle 20 μL de solución A (HRP Substrate Luminol Reagent) y 20 μL de solución B (HRP Substrate Peroxide Reagent) en el kit de detección de quimioluminiscencia en una proporción de 1:1. Sumerja toda la membrana en la solución de luminiscencia al mismo tiempo y observe las señales utilizando un sistema de imágenes multifuncional.</li>
	</ol></li>
	<li>Localización por inmunofluorescencia de la proteína Wolbachia<ol>
<li>Incubar 5 × 105 células Aa23 y Aa23-T a 28 °C en una placa de Petri confocal láser con un espesor de 0,17 mm en la parte inferior, bajo una atmósfera de CO2 al 5% durante 3 a 4 días 7,24. Espere hasta que la celda tenga una confluencia del 60% al 70% y lave las celdas tres veces con PBS.</li>
		<li>Fije las células durante 20 min a 4 °C en 1 ml de paraformaldehído al 4% (p/v) en PBS.</li>
		<li>Lave las celdas fijas usando PBST (0.2% v/v Triton X-100 en PBS) durante 5 min y lave las células nuevamente dos veces con PBS.</li>
		<li>Incubar los portaobjetos durante 1 h a 37 °C en 1 mL de albúmina sérica bovina al 3% (p/v) en PBS.</li>
		<li>Incubar los portaobjetos durante la noche en 100 μL de anticuerpo policlonal anti-wsp de ratón (preparado internamente) y suero de ratón (dilución de 1:1.000 en PBS) en una caja húmeda (puede mantener la humedad y evitar que la humedad se evapore) a 4 °C.</li>
		<li>Retire las diapositivas de la caja húmeda y devuélvalas a temperatura ambiente; lávelos tres veces con PBS y retire el PBS. NOTA: A partir del paso 4.4.7, todas las operaciones deben estar protegidas de la luz.</li>
		<li>Incubar los portaobjetos con 100 μL de un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado alexa Fluor 488 (dilución 1:2.000 en PBS) a 37 °C durante 30 min.</li>
		<li>Incubar los portaobjetos de muestra con 50 μL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI diluido en PBS a 10 μg/mL, se une fuertemente al ADN) a 37 °C durante 5 min y luego lavarlos tres veces con PBS.</li>
		<li>Observe la inmunotinción bajo un microscopio confocal.<ol>
<li>Encienda la alimentación y el láser.</li>
			<li>Encienda las lámparas normales y de mercurio del microscopio.</li>
			<li>Inicie el sistema y ejecute el software de operación. Coloque una gota de aceite de cedro en los portaobjetos de muestra, coloque los portaobjetos de muestra en el escenario del microscopio y mueva el escenario a la posición adecuada.</li>
			<li>Haga clic en el botón de observación de la lámpara de mercurio en el software, abra el obturador de la lámpara de mercurio y observe la muestra bajo un microscopio invertido para enfocar.</li>
			<li>Utilice el panel de control manual para seleccionar la fluorescencia verde y azul para tomar fotos de fluorescencia con un aumento de 100x.</li>
			<li>Apague el botón de observación de la lámpara de mercurio y comience a adquirir imágenes.</li>
			<li>Para garantizar una buena calidad de imagen, realice un escaneo previo por tamaño de escaneo (512 píxeles x 512 píxeles). Ajuste el tamaño del escaneo para obtener imágenes claras (1.024 píxeles x 1.024 píxeles).</li>
			<li>Realice la reducción de ruido si el ruido de fondo es demasiado alto.</li>
			<li>Deje de escanear y guarde las imágenes.</li>
			<li>Apague la lámpara de mercurio y los láseres.</li>
			<li>Limpie el objetivo con un 75% de alcohol y baje el objetivo a la posición más baja.</li>
			<li>Apague el obturador y la alimentación del microscopio.</li>
			<li>Después de que el instrumento se haya enfriado, cúbralo con la cubierta antipolvo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409(2017).</li>
<li>Kosea, H., Karr, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+Wolbachia+pipientis+in+the+Drosophila+fertilized+egg+and+embryo+revealed+by+an+anti-Wolbachia+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody.</a> Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).</li>
<li>Ye, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+reduces+the+transmission+potential+of+dengue-infected+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).</li>
<li>Jensenius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+immunofluorescence%2C+Western+blotting%2C+and+cross-adsorption+assays+for+diagnosis+of+African+tick+bite+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

La detección de la infección intracelular por Wolbachia es esencial para el estudio de las interacciones Wolbachia-huésped y la confirmación de la transfección exitosa de células con nuevas cepas. En este protocolo, se utilizaron cuatro métodos para detectar con éxito la infección intracelular por Wolbachia a nivel de ácido nucleico y proteína. Estos cuatro métodos experimentales corroboraron y mejoraron la precisión de detección de la infección por Wolbachia de las células. 
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El mosquito tigre asiático Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), que es un vector clave del virus del dengue (DENV) en Asia y otras partes del mundo1, es un huésped natural de dos tipos de bacterias intracelulares, Wolbachia (wAlbA y wAlbB), que se distribuyen por toda la línea germinal y el tejido somático 2,3. La línea celular Aa23 derivada de embriones de A. albopictus consta de al menos dos tipos de células morfológicas, las cuales apoyan la infección4 y pueden curarse de la infección nativa por Wolbachia utilizando antibióticos (Aa23-T). Dado que Aa23 conserva sólo wAlbB, es un modelo útil para el estudio de las interacciones huésped-endosimbionte 4,5,6.
Wolbachia es de transmisión materna e infecta aproximadamente el 65% de las especies de insectos 8,9 y el 28% de las especies de mosquitos10. Infecta una variedad de tejidos y forma una relación simbiótica íntima con el huésped, generalmente induciendo incompatibilidad citoplasmática (IC)11 y reemplazo poblacional mediante la manipulación del sistema reproductivo huésped12,13. Estas respuestas del huésped se han observado en poblaciones naturales de Drosophila simulans14 y en A. aegypti en una jaula de laboratorio y ensayo de campo15. Una importante manipulación no reproductiva provocada por Wolbachia es la resistencia inducida del huésped a una variedad de patógenos, incluidos el DENV, el virus Chikungunya (CHIKV) y el virus del Nilo Occidental (WNV)16,17, que puede estar mediado por un sistema inmune innato mejorado del simbionte18,19, la competencia entre Wolbachia y los virus por los recursos esenciales del huésped20 y la manipulación de las vías de defensa viral del huésped21 .
Este protocolo ha sido desarrollado para estudiar estos mecanismos subyacentes de las respuestas antivirales del huésped inducidas por Wolbachia. Utiliza cuatro métodos de detección de la infección intracelular por Wolbachia de células Aa23. Estos métodos proporcionan una sólida base teórica para los estudios de la infección intracelular por Wolbachia de otras especies huésped. El primer método, la PCR, una técnica poderosa que permite la amplificación enzimática de regiones específicas de ADN sin utilizar procedimientos de clonación convencionales, se utilizó para detectar adn de Wolbachia y determinar la presencia/ausencia de infección por Wolbachia 22. El segundo método mide la densidad de copia de ADN de Wolbachia utilizando PCR cuantitativa (qPCR) para una detección y medición confiables de los productos generados durante cada ciclo de PCR que es directamente proporcional a la cantidad de plantilla antes de la PCR23. El tercer método detecta la presencia de proteínas Wolbachia intracelulares, utilizando Western Blot, una de las herramientas más poderosas para detectar proteínas específicas en mezclas complejas mediante la combinación del alto poder de separación de la electroforesis, la especificidad de los anticuerpos y la sensibilidad de las reacciones enzimáticas cromogénicas. El método final es un ensayo de inmunofluorescencia (IFA) que combina inmunología, bioquímica y microscopía para detectar la proteína de superficie wolbachia (wsp) a través de una reacción antígeno-anticuerpo para confirmar la absorción celular de Wolbachia y determinar su localización celular.
Este artículo describe los cuatro métodos enumerados anteriormente para verificar la existencia de Wolbachia en las células, que se pueden utilizar para detectar si la Wolbachia exógena se transfectó con éxito y la Wolbachia en la célula se eliminó. Después de determinar si Wolbachia está presente en las células o no, se puede realizar una variedad de análisis diferentes, incluyendo genómica, proteómica o metabolómica. Este protocolo demuestra la detección de Wolbachia a través de células Aa23, pero también se puede utilizar en otras células.

<table><tbody><tr><td>Microscopio</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SteREO Discovery V8</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Fisher Scietific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Pipetman</td><td>F167380</td><td>P10</td></tr><tr><td>inSituX platform</td>Software de análisis Granate de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> aluminio y itrio dopado con cerio <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>MSE Supplies</td><td></td><td>Ce: Y3Al5O12, YAG sustratos monocristalinos</td></tr><tr><td>Soporte</td><td>de chip Software de control desarrollado</td><td></td><td></td>internamente</tr><tr><td>Aceite de inmersión</td> desarrollado <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>internamente</td></tr> Cargille Laboratories 16482 Tipo A de baja viscosidad 150 cSt <tr><td>plataforma inSituX</td><td>Fuente de</td> luz IR desarrollada <td></td><td></td></tr><tr><td>internamente&nbsp;</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LED1085L</td><td>LED con lente de vidrio, 1085 nm, 5 mW, anillo exterior TO-18</td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Láseres <td>de bomba desarrollados</td><td></td><td></td></tr><tr><td>internamente&nbsp;</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LD785-SE400</td><td>785 nm, 400 mW, &Oslash; 9 mm, código Pin E, diodo láser</td></tr><tr><td>Raspberry Pi</td><td>Raspberry Pi Fundation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anillo de retención</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>SM1RR</td><td>SM1 anillo de retención para &Oslash; Tubos y monturas de lentes de 1"</td></tr><tr><td>Cristal de cuarzo sin semillas</td><td>University Wafers, Inc.</td><td>U01-W2-L-190514</td><td>25,4 mm de diámetro Corte en Z 0,05 mm de espesor pulido de doble cara 8 mm en -X</td></tr><tr><td>Calce</td><td>Desarrollado</td><td></td><td></td>internamente</tr> Tope <tr><td>de haz de rayos X</td><td>Desarrollado</td><td></td><td></td> internamente</tr></tbody></table>

detección de wolbachia strain walbb en líneas celulares de aedes albopictus

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Como endosimbionte albergado maternalmente, Wolbachia infecta grandes proporciones de poblaciones de insectos. Los estudios han informado recientemente de la regulación exitosa de la transmisión del virus del ARN utilizando mosquitos transfectados por Wolbachia. Las estrategias clave para controlar los virus incluyen la manipulación de la reproducción del huésped a través de la incompatibilidad citoplasmática y la inhibición de las transcripciones virales a través del cebado inmune y la competencia por los recursos derivados del huésped. Sin embargo, los mecanismos subyacentes de las respuestas de los mosquitos transfectados por Wolbachia a la infección viral son poco conocidos. Este artículo presenta un protocolo para la identificación in vitro de la infección por Wolbachia a nivel de ácido nucleico y proteína en las células Aa23 de Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) para mejorar la comprensión de las interacciones entre Wolbachia y sus insectos vectores. A través del uso combinado de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la PCR cuantitativa, el western blot y los métodos analíticos inmunológicos, se ha descrito un protocolo morfológico estándar para la detección de células infectadas por Wolbachia que es más preciso que el uso de un solo método. Este enfoque también se puede aplicar a la detección de la infección por Wolbachia en otros taxones de insectos.

Antes de que se detectara Wolbachia , se observaron células Aa23 y Aa23-T bajo un microscopio de luz para determinar cualquier diferencia morfológica entre las dos líneas celulares. Las células Aa23 y Aa23-T tienen al menos dos morfologías celulares, pero no hay una diferencia morfológica obvia entre los dos tipos de células (Figura 1). Aquí, las células Aa23 se utilizaron como un sistema modelo para detectar la infección por Wolbachia utilizando cuatro mét...

Se utilizaron cuatro métodos para detectar Wolbachia intracelular, que se complementaron entre sí y mejoraron la precisión de detección de la infección por Wolbachia de Aa23 derivada de Aedes albopictus y Aa23-T curada de la infección nativa por Wolbachia utilizando antibióticos.

Detección de Wolbachia Strain wAlbB en líneas celulares de Aedes albopictus

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

Este protocolo ayuda a verificar la existencia de Wolbachia en las células, que es la base para comprender la interacción entre Wolbachia y su huésped. En este protocolo, se utilizaron cuatro métodos para detectar con éxito la infección intracelular por Wolbachia, lo que corroboró y mejoró la precisión de detección de la infección por Wolbachia de las células. La demostración del procedimiento será Qiuqiu Xiao, un postgrado del Laboratorio Clave de Biología y Características de Patógenos Modernos.Comience observando células Aa23 y Aa23-T no teñidas a un aumento de 100x utilizando microscopía de luz. Cultive las células durante cinco a siete días para alcanzar una confluencia del 70 al 80% por matraz. Usando una pipeta, transfiera 1 ml del medio de cultivo a un tubo de microcentrífuga.Centrifugar a 100 RCF durante cinco minutos para cosechar las células. Retire el sobrenadante y almacene el pellet celular resultante a menos 20 grados centígrados. Cultive las células durante cinco a siete días para alcanzar una confluencia del 90 al 100% por matraz.Resuspender los pellets en 0,40 ml de PBS y transferir 50 microlitros de esta solución a un tubo de microcentrífuga. Agregue cinco microlitros de 20 mg / ml de proteinasa K e incube a 55 grados Celsius durante una hora. Luego incuba los tubos a 99 grados Celsius durante 15 minutos para obtener el ADN crudo y almacenarlo a menos 20 grados Celsius.Para realizar la PCR, prepare una mezcla de reacción total de 20 microlitros y establezca las condiciones de PCR como se describe en el manuscrito de texto. Detecte el ADN en un gel de agarosa al 1% utilizando un generador de imágenes de gel. Realice la amplificación cuantitativa por PCR utilizando TB Green en un sistema de PCR en tiempo real y registre los resultados de cada reacción.Analizar el ADN en un volumen total de reacción de 20 microlitros y establecer las condiciones cuantitativas de PCR como se describe en el manuscrito de texto. Calcule los números de copia de los genes WSP y RPS6 en las células de acuerdo con la curva estándar establecida. A continuación, calcule la densidad relativa de Wolbachia por el número de copia de wsp/RPS6.Analice los datos utilizando una prueba t de muestras independiente. Agregue 200 microlitros de tampón de lisis a la bolita celular e incube en hielo durante 30 minutos. Centrifugar los lisados a 12.000 RCF durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y aspirar el sobrenadante.Analice la concentración wsp del sobrenadante utilizando un kit de ensayo de proteína BCA, siguiendo las instrucciones del fabricante. Cargue cantidades iguales de proteína en un gel 15% SDS-PAGE. Transfiera la proteína a las membranas de nitrocelulosa y bloquee las membranas con leche desnatada al 5% durante dos horas a temperatura ambiente.Luego lave las membranas tres veces con TBST. Incubar las membranas durante la noche a 4 grados centígrados con 100 microlitros de anticuerpo policlonal anti-wsp preparado diluyendo el anticuerpo primario con leche desnatada al 5%. Lave el anticuerpo primario tres veces con TBST.Agregue 100 microlitros de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante a las membranas e incube en un agitador durante una hora a temperatura ambiente. Lave las membranas tres veces con TBST y mezcle 20 microlitros de solución A y 20 microlitros de solución B en el kit de detección de quimioluminiscencia en una proporción de uno a uno. Sumerja toda la membrana en la solución de luminiscencia simultáneamente y observe las señales utilizando un sistema de imágenes multifuncional.En una placa de Petri confocal láser, incube las células Aa23 y Aa23-T durante tres o cuatro días a 28 grados Celsius bajo un 5% de dióxido de carbono atmosférico. Cuando la célula alcance el 60 a 70% de confluencia, lave las células tres veces con PBS. Fije las células en un ml de paraformaldehído al 4% durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.Lave las células fijas con PBST durante cinco minutos y vuelva a lavar las células dos veces con PBS. Incubar la placa de Petri en un ml de albúmina sérica bovina al 3% durante una hora a 37 grados centígrados. Agregue 100 microlitros de anticuerpo policlonal anti-wsp de ratón y suero de ratón a los portaobjetos e incube durante la noche en una caja húmeda a cuatro grados centígrados.Retire la placa de Petri de la caja húmeda y devuélvala a temperatura ambiente. Lávelos tres veces con PBS y retire el PBS. Proteja los siguientes procedimientos de la luz.Incubar la placa de Petri con 100 microlitros de un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado alexa Fluor 488 a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Incubar la placa de Petri de muestra con 50 microlitros de DAPI diluidos en PBS a 10 microgramos/ml a 37 grados Celsius durante cinco minutos y luego lavarlos tres veces con PBS. Observe la inmunotinción bajo un microscopio confocal.Antes de detectar Wolbachia, se observaron células Aa23 y Aa23-T bajo un microscopio de luz para determinar las diferencias morfológicas entre las dos líneas celulares. Las células Aa23 y AA23-T tenían al menos dos morfologías celulares, pero no se observaron diferencias morfológicas aparentes entre los dos tipos de células. Utilizando los cebadores de diagnóstico 81F/691R, se detectó amplificación positiva del gen Wolbachia wsp en células Aa23 pero no en células Aa23-T.El análisis de la densidad de Wolbachia en las líneas celulares mostró una relación wsp/rps6 de 2,4 en las células Aa23, pero no Wolbachia en las células Aa23-T. El análisis de Western blot de extractos de proteínas mostró una fuerte señal wsp para Aa23, pero no se detectó ninguna señal para Aa23-T. El ensayo de inmunofluorescencia indirecta detectó la proteína wsp en las células Aa23, mientras que solo se detectó ADN teñido con DAPI en las células Aa23-T.Asegúrese de que los matraces de cultivo se incuban a 28 grados centígrados bajo un 5% de dióxido de carbono atmosférico durante cinco a siete días. Este procedimiento puede ser seguido por microscopía electrónica donde uno necesita prestar especial atención a la preparación y seccionamiento de la muestra. Los cuatro métodos experimentales utilizados en este estudio confirmaron la precisión de detección de la infección por Wolbachia en las células, que también es aplicable a otros tipos de células y tejidos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Wolbachia Infección bacteriana en Drosophila

Este video describe un método para la purificación de Wolbachia pipientis de una línea celular Anopheles gambiae y el cultivo de la endosimbionte en medio libre de células. Un ensayo de viabilidad de la bacteria se demuestra.

El mantenimiento de Wolbachia en medio libre de células

Los análisis de RNA-Seq son cada vez más importantes para identificar los fundamentos moleculares de los rasgos adaptativos en organismos no modelo. Aquí, se describe un protocolo para identificar genes expresados diferencialmente entre mosquitos Aedes albopictus en diapausa y no diapausa, desde la cría de mosquitos, hasta la secuenciación de ARN y análisis bioinformáticos de datos de RNA-Seq.

Un Experimental y Protocolo Bioinformática para análisis de ARN-ss de fotoperiódica diapausa en el Mosquito Tigre Asiático, Aedes albopictus

Los mosquitos Aedes aegypti infectados con Wolbachia están siendo liberados en las poblaciones naturales para suprimir la transmisión de arbovirus. Se describen métodos para posterior Ae. aegypti con Wolbachia infecciones en el laboratorio para los experimentos y la liberación del campo, tomar precauciones para reducir al mínimo la selección y adaptación de laboratorio.

Mantener los mosquitos Aedes aegypti infectados con Wolbachia

Este protocolo describe cómo establecer infección viral en vivo de Drosophila melanogaster utilizando el método de inyección de nano y técnicas básicas para analizar interacción virus-huésped.

Establecimiento de la infección Viral y análisis de la interacción huésped-Virus en Drosophila Melanogaster

Descrito es un método de ahorro de tiempo y espacio para contar los huevos y determinar las tasas de eclosión de mosquitos individuales utilizando 24 placas de cultivo de tejido de pozos, lo que puede aumentar sustancialmente la escala y la velocidad de los ensayos de fecundidad y fertilidad.

Ensayo mejorado de fecundidad y fertilidad para Aedes aegypti utilizando 24 placas de cultivo de tejidos de pozos (placas EAgaL)

Un protocolo para cultivar el parásito microsporidiano Edhazardia aedis. El parásito pasa de una generación de mosquitos Aedes aegypti a la siguiente a través de la transferencia horizontal en la etapa larval seguida de la transmisión vertical en la etapa adulta. Los esporoplasmos vivos sobreviven a largo plazo en huevos infectados.

Propagación del parásito microsporidiano Edhazardia aedis en mosquitos Aedes aegypti

Aquí, presentamos un protocolo para estudiar la competitividad de apareamiento del Aedes aegypti macho utilizando tinte fluorescente como marcador. Los mosquitos hembra están expuestos a machos marcados y no marcados para la cópula. Después del apareamiento, sus espermatozoides se examinan bajo un microscopio de fluorescencia para determinar su compañero de apareamiento.

Uso del colorante fluorescente, rodamina B, para estudiar la competitividad del apareamiento en mosquitos machos Aedes aegypti

La manipulación del ARN de interferencia (ARNi) presenta un desafío formidable en muchas especies de parasitoides con tamaño diminuto, como las avispas Trichogramma . Este estudio delineó un método eficiente de ARNi en Trichogramma denrolimi. La presente metodología proporciona un modelo robusto para investigar la regulación génica en avispas Trichogramma .

Interferencia de ARN en el parasitoide del huevo, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Las comunidades microbianas de los mosquitos son muy prometedoras para las estrategias de biocontrol de vectores. La mayoría de los simbiontes son incultivables, lo que requiere análisis metagenómicos. Describimos un método para diseccionar mosquitos hembra y separar los ovarios, el intestino medio y las glándulas salivales evitando la contaminación cruzada, facilitando los estudios del microbioma a nivel de órgano y mejorando la comprensión de las funciones de los microorganismos en la...

Disección de ovarios, intestino medio y glándulas salivales de mosquitos para análisis del microbioma a nivel de órganos

Las líneas celulares son útiles en estudios sobre organismos intracelulares que no pueden cultivarse fuera de sus células huésped. Aunque las líneas infectadas por Wolbachia han permitido muchos descubrimientos, la heterogeneidad dentro de estas líneas puede conducir a resultados experimentales variables. Presentamos un protocolo para la generación de clones unicelulares y cultivos continuos a partir de células JW18 infectadas con Wolbachia.

Generación de cultivos monoclonales a partir de la línea celular Drosophila melanogaster JW18 infectada por Wolbachia

Aprende a detectar Wolbachia en líneas celulares de Aedes albopictus usando cuatro métodos complementarios. Este protocolo mejora la precisión en la identificación de infecciones intracelulares para estudiar interacciones huésped-bacteria.

Detección de Wolbachia Strain wAlbB en líneas celulares de Aedes albopictus

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