Espectroscopía de neutrones de alta resolución para estudiar la dinámica de picosegundos-nanosegundos de proteínas y agua de hidratación

La retrodispersión de neutrones mide la difusión global y la dinámica interna de las proteínas y el agua de hidratación sin daño por radiación. La espectroscopia de neutrones accede simultáneamente a las correlaciones espaciales y temporales a nivel molecular. En materia blanda y materiales biológicos, es particularmente interesante obtener información indirecta sobre el orden local en estos sistemas de desorden de largo alcance.

Por lo tanto, la retrodispersión de neutrones se puede usar para estudiar la dinámica en biología, química o sentido material. Otro campo fuerte es la energía, con estudios, por ejemplo, sobre baterías y pilas de combustible. La retrodispersión de neutrones se ha utilizado con éxito para estudiar la dinámica molecular de proteínas involucradas en enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer y el Parkinson.

Los resultados obtenidos nos ayudan a comprender mejor las características moleculares de estas patologías y pueden allanar el camino para desarrollar mejores diagnósticos. Para preparar el portamuestras, comience limpiando a fondo un soporte de muestra de aluminio plano y su sello de alambre de indio y tornillos con agua, seguido de etanol, y luego déjelo secar. Pese las diferentes partes del portamuestras, incluida la parte inferior, la tapa y el alambre de indio, por separado en una balanza de precisión.

Coloque el sello de alambre de indio de un milímetro en la ranura de la parte inferior del soporte de muestra, dejando una pequeña superposición donde se unen los dos extremos. Agregue alrededor de 100 miligramos de proteína liofilizada de modo que llene la superficie interna de la parte inferior del portamuestras. A continuación, coloque el portamuestras en un desecador con una placa de Petri que contenga polvo de pentóxido de fósforo durante 24 horas para secar completamente la proteína en polvo.

Pesar la parte inferior seca del portamuestras que contiene el sello de indio y el polvo seco para obtener la masa de la muestra seca. Retire el pentóxido de fósforo del desecador y coloque una placa de Petri con óxido de deuterio, así como la muestra en el interior para hidratar el polvo. Repita el secado y la hidratación tres veces para obtener un intercambio completo de hidrógeno a deuterio.

Mida la masa de polvo regularmente para verificar el nivel de hidratación y cuando la hidratación esté ligeramente por encima del nivel deseado, espere a que la masa disminuya lentamente. Una vez obtenida la hidratación deseada, coloque rápidamente la tapa en la parte inferior y cierre primero el portamuestras con cuatro tornillos para detener el intercambio de vapor. Coloque y apriete todos los tornillos restantes hasta que no haya espacio visible entre la parte inferior y la tapa.

Pese el portamuestras sellado para comprobar si hay una posible pérdida de hidratación por fugas después del experimento con neutrones. Para preparar la muestra en estado líquido, disuelva la proteína en el tampón deuterado. Usando agua, determine el volumen apropiado de líquido que se colocará en el portamuestras.

Antes de manipular cualquier material, asegúrese de que la dosis de radiación ionizante sea inferior a 100 microsieverts por hora. Luego, seque bien la barra de muestra y retire cualquier muestra anterior. Coloque la muestra en la barra de muestra, verifique el centrado adecuado en relación con el centro de la viga e inserte la barra de muestra en el horno criogénico.

Para adquirir datos en Nomad, vaya a la pestaña de ejecución y arrastre y suelte un controlador de criostato de horno en el launchpad. Ajuste la temperatura a 200 Kelvin. Utilice el modo rápido y un tiempo de espera de 30 minutos para que la temperatura tenga tiempo de estabilizarse.

Haga clic en el icono de actualización para ejecutar la rampa de temperatura en segundo plano para la adquisición de datos durante la disminución de la temperatura. Arrastre y suelte el controlador de configuración Doppler IN16 en el launchpad. Establezca el perfil de velocidad en velocidad precisa, el establecido en delta E máximo, el desplazamiento de energía en 0.00 micro electronvoltios y el número de canales en 128 para obtener una configuración de escaneos de ventana fija elástica.

Arrastre y suelte un controlador de conteo en el launchpad, complete el campo de subtítulos con un nombre que permita una fácil identificación de los datos y establezca escaneos de 30 segundos con 60 repeticiones. A continuación, arrastre y suelte el controlador de configuración Doppler IN16 en el launchpad. Establezca el perfil de velocidad para firmar, el conjunto por para velocidad con un valor de 4,5 metros por segundo y el número de canales para 2048 para obtener una configuración de dispersión de neutrones cuasielástica.

Arrastre y suelte un controlador de recuento y rellene el campo de subtítulos con un nombre que permita una fácil identificación de los datos. Establezca escaneos de 30 minutos con cuatro repeticiones. Para la rampa de temperatura, arrastre y suelte un controlador de criostato del horno, ajuste la temperatura a 310 Kelvin y ajuste la rampa al punto de ajuste con un delta de 0.05 Kelvin durante seis segundos.

Utilice un tiempo de espera de 200 minutos. Usa un bucle for con 65 repeticiones. En el interior, inserte un controlador de configuración Doppler IN16, seguido del controlador de conteo y configure un solo escaneo de 30 segundos.

Posteriormente, inserte los ajustes Doppler IN16 como se describió anteriormente, pero utilizando un desplazamiento de energía de 1.5 micro electronvoltios y 1024 canales. Luego, inserte el controlador de conteo y configure un solo escaneo de tres minutos. Para adquirir la última dispersión de neutrones cuasi elástica de 312 Kelvin, arrastre y suelte los ajustes Doppler IN16 y los controladores de conteo configurados como se demostró anteriormente.

A continuación, pulse el botón de inicio para ejecutar el script. Las exploraciones de ventana fija elástica e inelástica lisosómica mostraron un aumento en la señal a baja transferencia de momento y baja transferencia de energía, mientras que la señal a alta transferencia de energía y baja transferencia de momento disminuyó. El centro inicial del coeficiente de difusión de masa fue de 15 angstrom al cuadrado por nanosegundo, que luego disminuyó exponencialmente con el tiempo.

A temperaturas superiores a 220 Kelvin, el agua de hidratación alrededor de las fibras tau fue significativamente más móvil que alrededor de los monómeros tau. La fracción de moléculas de agua sometidas a movimiento de traslación y los coeficientes de difusión de traslación y rotación de las moléculas de agua se incrementaron alrededor de las fibras. La concentración de proteína debe ser de 2000 miligramos por ml o al menos 20 miligramos por ml para proteínas proteinadas debido a las limitaciones de dispersión de neutrones del flujo de neutrones o el fondo del tampón del soporte de la muestra.

La retrodispersión de neutrones se ha aplicado recientemente, por ejemplo, para comprender cómo el agua, que son las proteínas ambientales naturales, puede ser completamente reemplazada por un polímero sintético para aplicaciones biotecnológicas como, por ejemplo, la administración de fármacos.