Name: Cuantificación de las interacciones de unión entre cu(II) y residuos peptídicos en presencia y ausencia de cromóforos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Aprende a cuantificar la termodinámica de unión de Cu(II) a péptidos mediante espectroscopía de absorción electrónica y calorimetría de titulación isotérmica. Estas técnicas ortogonales permiten estudiar interacciones metal-péptido con precisión.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SC agradece a la Beca de Investigación de Verano de Whitehead. MJS agradece a los Startup Funds y al Fondo de Desarrollo Docente de la Universidad de San Francisco. MCH reconoce la financiación de los Institutos Nacionales de Salud (NIH MIRA 5R35GM133684-02) y la Fundación Nacional de Ciencias (NSF CAREER 2048265).

<ol><li>Waldron, K. J., Robinson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+bacterial+cells+ensure+that+metalloproteins+get+the+correct+metal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).</li>
<li>Puig, S., Thiele, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+copper+uptake+and+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of copper uptake and distribution.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).</li>
<li>Huffman, D. L., O'Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function%2C+structure%2C+and+mechanism+of+intracellular+copper+trafficking+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).</li>
<li>Kaplan, J. H., Lutsenko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+transport+in+mammalian+cells%3A+Special+care+for+a+metal+with+special+needs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).</li>
<li>Makowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+binding+of+Cu%28II%29+ions+to+a+fragment+of+the+A%CE%B2+%281-42%29+polypeptide+using+fluorescence+spectroscopy%2C+isothermal+titration+calorimetry+and+molecular+dynamics+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the Aβ (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations.</a> Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).</li>
<li>Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1H+NMR+studies+of+copper+binding+by+histidine-containing+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).</li>
<li>García, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopic+and+electronic+structure+studies+of+copper%28II%29+binding+to+His111+in+the+human+prion+protein+fragment+106%E2%88%92115%3A+evaluating+the+role+of+protons+and+methionine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106−115: evaluating the role of protons and methionine residues.</a> Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).</li>
<li>Jakab, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+histidine+containing+peptides+for+better+understanding+of+their+coordination+mode+toward+copper%28II%29+by+CD+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inorganic+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).</li>
<li>Keltner, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+characterization+and+activity+of+zinc-activated+proinsulin+C-peptide+and+C-peptide+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants.</a> Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).</li>
<li>Whittal, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Copper+binding+to+octarepeat+peptides+of+the+prion+protein+monitored+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).</li>
<li>Żamojć, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pentapeptide+with+tyrosine+moiety+as+fluorescent+chemosensor+for+selective+nanomolar-level+detection+of+copper%28II%29+ions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).</li>
<li>Beuning, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+interpeptidic+Cu+II+exchange+rate+constants+of+Cu+II+-amyloid-%CE%B2+complexes+to+small+peptide+motifs+by+tryptophan+fluorescence+quenching%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-β complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching.</a> Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).</li>
<li>Makowska, J., Żamojć, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzyński, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper%28II%29+complexation+by+fragment+of+central+part+of+FBP28+protein+from+Mus+musculus%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus.</a> Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).</li>
<li>Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+metal+effects+on+C-peptide+structure+and+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization.</a> ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).</li>
<li>Stevenson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+a+copper+binding+site+in+proinsulin+C-peptide+and+its+implications+for+metal-modulated+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity.</a> Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).</li>
<li>Magyar, J. S., Godwin, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectropotentiometric+analysis+of+metal+binding+to+structural+zinc-binding+sites%3A+Accounting+quantitatively+for+pH+and+metal+ion+buffering+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects.</a> Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).</li>
<li>Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28Un%29suitability+of+the+use+of+pH+buffers+in+biological%2C+biochemical+and+environmental+studies+and+their+interaction+with+metal+ions+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">(Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions - a review.</a> RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).</li>
<li>Sigel, H., Martin, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+properties+of+the+amide+bond.+stability+and+structure+of+metal+ion+complexes+of+peptides+and+related+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands.</a> Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metalloproteins+containing+cytochrome%2C+iron-sulfur%2C+or+copper+redox+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers.</a> Chemical Reviews. 114 (8), 4366(2014).</li>
<li>Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+isothermal+titration+calorimetry+in+bioinorganic+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).</li>
<li>Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiessler%2C+GL+%22Inorganic+Chemistry%22">Inorganic Chemistry</a>. , Pearson. (2014).</li>
<li>Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+direct+red+81+dye%2Fcopper%28II%29-phenanthroline+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system.</a> Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).</li>
<li>Kocyła, A., Pomorski, A., Krężel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molar+absorption+coefficients+and+stability+constants+of+Zincon+metal+complexes+for+determination+of+metal+ions+and+bioinorganic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inorganic+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).</li>
<li>Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEDPHAT+-+A+platform+for+global+ITC+analysis+and+global+multi-method+analysis+of+molecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions.</a> Methods. 76, 137-148 (2015).</li>
<li>NIST. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Critically+Selected+Stability+Constants+of+Metal+Complexes%2C+Version+8.0%22">Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0</a>. , (2004).</li>
<li>Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+measurement+of+protein+sulfhydryls+with+Ellman%27s+reagent+and+with+4%2C4%E2%80%B2-dithiodipyridine%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4′-dithiodipyridine.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
</ol>

Los autores no declaran intereses contrapuestos.

Este artículo proporciona un método robusto para cuantificar la afinidad y la termodinámica de la unión de Cu(II) a los péptidos. Los complejos con Cu(II) son ideales para monitorear la banda de absorción d-d en el sitio del metal debido a su configuración de electrones d9 . Aunque el coeficiente de extinción es pequeño, por lo que requiere mayores concentraciones del complejo para producir una señal confiable, las valoraciones de Cu (II) en péptido pueden proporcionar rápidamente información sobre la estequio...

La biología ha evolucionado para utilizar la diversa química de los iones metálicos necesarios para que la vida se adapte y sobreviva en su entorno circundante. Se estima que entre el 25% y el 50% de las proteínas utilizan iones metálicos para la estructura y la función1. El papel particular y el estado redox del ion metálico está directamente relacionado con la composición y la geometría de los ligandos biológicos que lo coordinan. Además, los iones metálicos redox-activos como Cu(II) deben estar estrechamente regulados para que no interactúen con agentes oxidantes a través de la química similar a Fenton para formar especies reactivas de oxígeno (ROS)2,3,4. Comprender los modos de unión y la afinidad que impulsan su bioquímica debería ayudar a dilucidar el papel biológico del ion metálico.
Muchas técnicas se utilizan para estudiar las interacciones de unión de metales y péptidos. Estas son en su mayoría técnicas espectroscópicas, pero también incluyen simulaciones por computadora utilizando dinámica molecular, como se ve a través de las interacciones Cu(II) con un fragmento de beta amiloide (Aβ)5. Una técnica espectroscópica ampliamente utilizada que es accesible para muchas universidades es la resonancia magnética nuclear (RMN). Utilizando la naturaleza paramagnética de Cu(II), Gaggelli et al. pudieron mostrar dónde se une el ion metálico en un pecíolo a través de la relajación de los núcleos cercanos6. La resonancia paramagnética electrónica (EPR) también se puede utilizar para sondear la ubicación y el modo de la unión de iones metálicos paramagnéticos7. Otras técnicas espectroscópicas como el dicroísmo circular (CD) pueden describir la coordinación sobre Cu(II) en sistemas como los sistemas tripéptidos8, y la espectrometría de masas puede mostrar estequiometría y a qué residuos se coordina el ion metálico a través de patrones de fragmentación 9,10.
Algunas de estas técnicas, como la RMN, no contienen etiquetas, pero requieren grandes concentraciones de péptidos, lo que plantea desafíos para el estudio. Otra técnica común llamada espectroscopia de fluorescencia se ha utilizado para relacionar la posición de una tirosina o triptófano con el enfriamiento de un Cu(II)11,12. Del mismo modo, esta técnica puede mostrar cambios estructurales como resultado de la unión Cu(II)13. Sin embargo, los desafíos con estos estudios de unión metal-péptido son que sondean aminoácidos cromofóricos como la tirosina que no todos los sistemas tienen, que el ion metálico se une bajo un modelo clásico y que la técnica puede no ser propicia en condiciones fisiológicas. De hecho, están surgiendo varios péptidos que no contienen tales aminoácidos cromofóricos ni se unen bajo modelos clásicos, lo que impide el uso de estas técnicas14,15. Este artículo detalla los enfoques para evaluar las propiedades de unión en estos escenarios en condiciones fisiológicamente relevantes.
Los ligandos biológicos pueden adoptar diferentes estados de protonación que pueden afectar la unión de iones metálicos, como el anillo de imidazol en la histidina. Si el pH no se mantiene de manera consistente, los resultados pueden ser enrevesados o contradictorios. Por esta razón, los tampones son un componente esencial en el estudio de las interacciones metal-proteína/péptido. Sin embargo, se ha demostrado que muchos tampones interactúan favorablemente con los iones metálicos16,17. Además de competir con la molécula biológica de interés, el tampón puede tener átomos de coordinación similares que pueden ser difíciles de distinguir de los átomos coordinadores del péptido o proteína. En este estudio, la atención se centra en la espectroscopia de absorción electrónica y la calorimetría de titulación isotérmica (ITC) como dos técnicas complementarias para estudiar las interacciones Cu(II)-péptido, con consideraciones especiales sobre la elección del tampón.
La espectroscopia de absorción electrónica es una técnica rápida y ampliamente accesible para estudiar las interacciones de unión a metales. La irradiación con luz en las longitudes de onda ultravioleta (UV) o visible puede conducir a la absorción de bandas d-d centradas en el metal, que proporcionan información valiosa sobre la clasificación de ligandos, las geometrías de los metales y las afinidades de uniónaparentes 18,19. Para estos complejos, las valoraciones directas de iones metálicos en soluciones proteicas o peptídicas pueden cuantificar las estequiometrías de unión y las afinidades de unión aparentes. En algunos casos, como las configuraciones de electrones d5 o d10, el complejo no absorbe la luz (es decir, es espectroscópicamente silencioso). En estos complejos de metales de transición espectroscópicamente silenciosos, estas limitaciones se pueden eludir mediante el uso de un ligando competidor que, al coordinarse con el ion metálico, produce bandas de transferencia de carga detectables. En cualquier caso, este enfoque se limita a cuantificar solo la estequiometría y la afinidad de unión aparente, y no se proporciona información sobre la entalpía de unión sin aproximaciones.
Complementando la información obtenida de la espectroscopia electrónica de absorción, el ITC es una técnica atractiva para la cuantificación directa y rigurosa de la entalpía de unión20. ItC mide directamente el calor liberado o consumido durante un evento de unión y, dado que la titulación tiene lugar a presión constante, el calor medido es la entalpía de todos los equilibrios (ΔHITC). Además, se cuantifican la estequiometría del evento de unión (n) y la afinidad de unión aparente (KITC). A partir de estos parámetros, se determinan la energía libre (ΔGITC) y la entropía (ΔSITC), proporcionando una instantánea termodinámica del evento de unión. Como no depende de la absorción de luz, itC es una técnica ideal para especies espectroscópicamente silenciosas, por ejemplo, complejos de iones metálicos d5 o d10 . Sin embargo, dado que la calorimetría mide el calor, cualquier sistema tampón sin igual y equilibrios no contabilizados puede afectar negativamente el análisis para determinar con precisión la termodinámica de unión a iones metálicos, y se debe tener mucho cuidado para abordar estos factores20. Si se realiza con el rigor adecuado, el ITC es una técnica robusta para determinar la termodinámica de los complejos metal-proteína/péptido.
Aquí, se utiliza un péptido de unión al cobre cromofóricamente silencioso, el péptido C, para demostrar el uso complementario de las dos técnicas. El péptido C es un producto de escisión de 31 residuos (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) formado durante la maduración de la insulina; carece de residuos cromofóricos, pero se ha demostrado que se une a Cu(II) con afinidad fisiológicamente relevante14,15. El sitio de unión de Cu(II) consiste en las cadenas laterales de un glutamato y un aspartato, así como el N-terminal del péptido14,15. Estos átomos de coordinación se parecen mucho a los de muchos sistemas amortiguados de uso común. Aquí, se muestra el uso en tándem de las bandas d-d y de transferencia de carga en la espectroscopia de absorción electrónica y el ITC en la cuantificación de la termodinámica de unión de Cu(II) al péptido C. El enfoque del estudio de la unión de Cu(II) al péptido C se puede aplicar a otros iones metálicos y sistemas de proteínas/péptidos.

<table><tbody><tr><td>1,10-fenantrolina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>131377-25G</td><td></td></tr><tr><td>tampón bis-Tris</td><td>Fisher</td><td>BP301-100</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de 0,45 micras con tapa de botella</td><td>Nalgene</td><td>296-4545</td><td>Cualquier sistema de filtración que elimine la resina sin introducir contaminantes es aceptable</td></tr><tr><td>Cloruro de cobre (II)</td><td>Alfa Aesar</td><td>12458</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro electrónico de absorción</td><td>Varian</td><td>Cary 5000</td><td>Otro espectrofotómetro sensible adecuado es</td></tr> la <tr><td>resina de alta afinidad</td><td>aceptable Sigma Aldrich</td><td>C7901-25G</td><td></td></tr><tr><td>Calorímetro de valoración isotérmica (ITC)</td><td>TA Instruments</td><td>Nano ITC Software</td> de análisis ITC de bajo volumen <td></td></tr><tr><td></td><td>TA Instruments</td><td>NanoAnalyze</td><td>SEDPHAT (Métodos. <fuerte>2015</fuerte>, 76: 137&ndash; 148) también se puede utilizar</td></tr><tr><td>el software ITC</td><td>TA Instruments</td><td>ITCRun</td><td></td></tr><tr><td>limpiador delicado de alta resistencia Kimwipe</td><td></td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de carga</td><td>Hamilton</td><td>Syr 500 uL, 1750 cubetas emparejadas TLL-SAL</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Starna Cells, Inc</td><td>16.100-Q-10/Z20</td><td>Asegúrese de que la ventana para la cubeta de pequeño volumen coincida con la altura del haz del espectrofotómetro</td></tr><tr><td>Tampón MOPS</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12914</td><td></td></tr><tr><td>software de espectrofotómetro</td><td>Cary</td><td>WinUV Scan</td><td></td></tr><tr><td>programa de hoja de cálculo</td><td>Microsoft</td><td>Excel</td><td>Cualquier programa de hoja de cálculo adecuado funcionará</td></tr><tr><td>jeringa de titulación</td><td>TA Instruments</td><td>5346</td><td></td></tr><tr><td>agua ultrapura</td><td>Millipore Sigma</td><td>Milli-Q</td><td>Cualquier agua está bien siempre que >18 M&Omega; resistencia</td></tr></tbody></table>

cuantificación de las interacciones de unión entre cu(ii) y residuos peptídicos en presencia y ausencia de cromóforos

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

El cobre (II) es un metal esencial en los sistemas biológicos, que confiere propiedades químicas únicas a las biomoléculas con las que interactúa. Se ha informado que se une directamente a una variedad de péptidos y desempeña funciones necesarias y patológicas que van desde la estructura mediadora hasta las propiedades de transferencia de electrones y la impartición de funciones catalíticas. La cuantificación de la afinidad de unión y la termodinámica de estos complejos de péptidos Cu(II) in vitro proporciona información sobre la fuerza impulsora termodinámica de unión, las competencias potenciales entre diferentes iones metálicos para el péptido o entre diferentes péptidos para Cu(II), y la prevalencia del complejo Cu(II)-péptido in vivo. Sin embargo, cuantificar la termodinámica de unión puede ser un desafío debido a una miríada de factores, incluida la contabilidad de todos los equilibrios competitivos dentro de un experimento de titulación, especialmente en los casos en que hay una falta de mangos espectroscópicos discretos que representen el péptido, el ion metálico del bloque d y sus interacciones.
Aquí, se proporciona un conjunto robusto de experimentos para la cuantificación precisa de la termodinámica del péptido Cu(II). Este artículo se centra en el uso de la espectroscopia de absorción electrónica en presencia y ausencia de ligandos cromofóricos para proporcionar el mango espectroscópico necesario en Cu(II) y el uso de calorimetría de titulación isotérmica sin etiquetas. En ambas técnicas experimentales, se describe un proceso para dar cuenta de todos los equilibrios en competencia. Si bien el enfoque de este artículo se centra en Cu (II), el conjunto descrito de experimentos puede aplicarse más allá de las interacciones Cu (II) -péptido, y proporcionar un marco para la cuantificación precisa de otros sistemas metal-péptido en condiciones fisiológicamente relevantes.

El objetivo fue cuantificar y corroborar la termodinámica de la unión de Cu(II) al péptido C utilizando las técnicas complementarias de espectroscopia de absorción electrónica e ITC. Debido a la naturaleza robusta de la espectroscopia de absorción electrónica, se realizó una titulación directa de Cu(II) en péptido C de 300 μM (Figura 1). La adición de 150 μM de Cu(II) causó un aumento inmediato en la banda a 600 nm, atribuido a la banda d-d de Cu(II), y continuó aumentando hasta que se agreg...

Este artículo se centra en el uso de la espectroscopia de absorción electrónica y la calorimetría de titulación isotérmica para sondear y cuantificar la termodinámica de la unión de Cu(II) a péptidos y proteínas.

Cuantificación de las interacciones de unión entre cu(II) y residuos peptídicos en presencia y ausencia de cromóforos

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...

Este método permitirá al investigador sondear sistemas difíciles de estudiar, como péptidos e iones de metales de transición de primera fila, los cuales generalmente son desafiantes utilizando aplicaciones más estándar. La principal ventaja aquí es el uso de técnicas ortogonales porque se complementan bien, y eso puede dar más información sobre el sistema y ayudarnos a no perdernos ningún fenómeno. El método detallado en este video es muy adecuado para estudiar otros sistemas.Aunque lo mostramos con Cu (II) y un péptido, se puede usar para muchas interacciones diferentes de péptidos metálicos y proteínas metálicas. Creo que la parte más difícil será encontrar una buena opción de tampón para su ion metálico y péptido. Consultaría la literatura para ver qué búferes han sido utilizados por otros antes.demostrando el procedimiento estará Sohee Choi, una estudiante graduada en mi laboratorio de investigación. Para comenzar, encienda el espectrofotómetro electrónico de absorción y deje que se caliente durante aproximadamente 15 a 20 minutos antes de usarlo. Luego inicie el software del espectrofotómetro y configure los parámetros, como el rango de escaneo de 200 a 900 nanómetros, el rango de escaneo de 200 nanómetros por segundo y la línea de base de doble haz corregida.A continuación, recoja una línea de base sin cubetas ni muestras en las trayectorias del haz. Usando dos cubetas emparejadas en el espectrofotómetro de doble haz, cargue una cubeta con 115 microlitros de agua ultrapura y la otra cubeta con 115 microlitros de la muestra de péptido, asegurándose de que no haya burbujas de aire en las cubetas, ya que interferirán con la señal. Después, coloque la cubeta con agua ultrapura en la viga de referencia y la cubeta con péptido en la viga de muestra.Luego recoja el espectro de absorción del péptido libre de metal. Agregue una cantidad subestequiométrica de la solución de Cu (II) en la cubeta con la muestra de péptido y registre el volumen para su análisis posterior. Canalice suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar la solución evitando la generación de burbujas de aire.Después de equilibrar durante cinco minutos, vuelva a colocar la cubeta en el soporte de la celda de muestra y registre el espectro de absorción. Luego repita la adición de Cu(II)alícuotas en la solución peptídica para varios equivalentes y registre el volumen total de Cu(II)añadido a la cubeta. Después de inicializar el software como se describió anteriormente, en dos cubetas emparejadas, cargue una cubeta con 115 microlitros de agua ultrapura y otra cubeta con 115 microlitros de la solución compleja cobre-fen.Coloque la cubeta con agua en la viga de referencia y la cubeta con solución compleja de cobre-phen en la viga de muestra. Luego recolecte el espectro de absorción del complejo de ligando metálico. Después, agregue una cantidad estequiométrica de péptido a la solución compleja de cobre-phen y canalice suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien mientras tiene cuidado de no introducir burbujas de aire.A continuación, incubar la solución durante cinco minutos para alcanzar el equilibrio. Vuelva a colocar la cubeta en el soporte de la celda de muestra y registre el espectro de absorción. Más tarde, repita la adición de alícuotas peptídicas en la solución compleja de cobre-phen para varios equivalentes, y registre el volumen de péptido agregado para que se pueda determinar la concentración diluida.Primero encienda el ITC e inicie el software ITC para ejecutar el instrumento. Después de la primera inicialización, vuelva a colocar la bureta y siga las instrucciones en pantalla. A continuación, retire la bureta y la cubierta de la celda de referencia.A continuación, retire el agua de la celda de referencia y enjuague tres veces con 450 microlitros de agua ultra pura desgasificada. Extraiga lentamente agua ultrapura hasta la marca de 450 microlitros de una jeringa de carga teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire en la jeringa. Luego inserte la jeringa de carga en la celda de referencia hasta que esté aproximadamente a un milímetro del fondo e inyecte lentamente parte de la solución hasta que queden 150 microlitros en la jeringa de carga.Después, mueva el émbolo de la jeringa de carga rápidamente hacia arriba y hacia abajo en aproximadamente 25 microlitros varias veces para desalojar cualquier burbuja en la superficie de la célula. Luego inyecte lentamente hasta que el émbolo alcance la marca de 100 microlitros en la jeringa de carga, dispensando así un total de 350 microlitros de agua ultrapura en la celda de referencia y reemplace la cubierta de la celda de referencia. Después de extraer cualquier solución residual de la celda de muestra, cargue 450 microlitros de EDTA 10 milimolares con una jeringa de carga y remoje durante 10 minutos para asegurarse de que se eliminen los iones de metales traza porque el EDTA se unirá a los metales traza.Después de retirar la solución de EDTA, enjuague bien la jeringa de carga con grandes cantidades de agua ultrapura. Limpie el ITC de acuerdo con las instrucciones del fabricante enjuagando la celda de muestra con agua ultrapura. Retire cualquier agua residual de la celda de muestra y luego acondicione la celda de muestra enjuagando con 450 microlitros de tampón al menos tres veces.A continuación, retire el tampón residual que está acondicionando la celda de muestra y cargue la solución peptídica en la celda de muestra utilizando la jeringa de carga. A continuación, enjuague la jeringa de valoración con 200 microlitros de la solución tamponada retirando primero el émbolo. Con una micropipeta, pipetear la solución tampón a través del orificio en la parte superior de la jeringa de valoración de vidrio a través de la jeringa y fuera de la aguja debajo.Más tarde, inserte completamente el émbolo en la jeringa de titulación. A continuación, sumerja la punta de la aguja de la jeringa de valoración en la solución metálica y tire lentamente del émbolo hacia arriba, lo que hace que la solución metálica llene la jeringa y dé como resultado un volumen vacío en la parte superior de la parte de vidrio de la jeringa de valoración. Para eliminar el volumen vacío, gire la jeringa de valoración paralela al suelo.Luego retire el émbolo e incline ligeramente la parte de vidrio hacia el piso. Agite suavemente la jeringa de valoración para que la solución se mueva a la parte de vidrio de la jeringa de valoración y llene la mayor parte del volumen vacío. Pero asegúrese de que queden de dos a tres microlitros de volumen vacío.Mientras mantiene la jeringa paralela al suelo, vuelva a insertar el émbolo. Luego sostenga la jeringa de valoración en posición vertical y sumerja la punta de la aguja nuevamente en la solución metálica. A continuación, empuje el émbolo hacia abajo hasta que el aire deje de salir de la aguja y cargue la jeringa de valoración tirando lentamente del émbolo justo por encima de la marca de 50 microlitros mientras mantiene la punta de la aguja en la solución.Inserte con cuidado la parte de vidrio de la jeringa de valoración en la bureta y atornille hasta que quede apretado el dedo. Después, con un limpiaparabrisas delicado de servicio ligero, absorbe la solución que sale de la jeringa de valoración debido a la compresión del émbolo sin tocar la punta de la aguja. A continuación, inserte la bureta con una jeringa de valoración en la celda de muestra y fíjela de forma segura.Para configurar los parámetros del software ITC, seleccione el Control del instrumento. Ajuste la velocidad de agitación y la temperatura. Luego, en Detalles del experimento, ingrese las concentraciones de jeringa y celda en unidades milimolares.A continuación, en la sección Método de experimento, seleccione Valoración incremental. Haga clic en Configuración y especifique 20 inyecciones de 2,5 microlitros y, si se requiere más resolución para observar el evento de unión, aumente el número de inyecciones y disminuya el volumen por inyección. Después, ingrese el espacio de tiempo entre cada inyección para que sea lo suficientemente largo como para que la señal se equilibre y regrese a la línea de base, generalmente 300 segundos.A continuación, haga clic en el botón Ejecutar para iniciar el experimento y especificar dónde se guardan los datos. La titulación de Cu(II) se realizó en C-Peptide demostrando que la adición de 150 micromolares de Cu(II) causó un aumento inmediato en la banda a 600 nanómetros atribuida a la banda d-d de Cu(II) y continuó aumentando hasta que se añadieron 300 milimolares Cu(II). La adición adicional por encima de 300 Cu (II) micromolares no aumentó la absorción de la prohibición d-d que indica saturación y que Cu (II) se une al péptido C en un complejo 1: 1 con un valor log K de más de seis.El péptido C se tituló en aproximadamente 10 micromolares del complejo cobre-phen y la absorción de la banda de transferencia de carga a 265 nanómetros disminuyó, lo que indica que el péptido C fue capaz de quelar Cu (II) del ligando fenantrolina con un valor log K de 7.4 a 7.8. El termograma ITC muestra la titulación de 1,4 milimolares Cu(II) en 154 micromolares C-péptido en 15 milimolares MOPS buffer. Se encontró que la afinidad de unión tenía un valor log K de ocho con un cambio en la entalpía de 8 kilojulios por mol.Gibbs energía libre como menos 46 kilojulios por mol, y cambio en entropía como 120 julios por mol por kelvin. Una titulación controlada de 1,4 milimolares Cu(II) en tampón MOPS 15 milimolares en ausencia de péptido C no muestra unión en el termograma. Yo diría que asegurarse de que todo esté limpio.Si hay iones metálicos o péptidos sobrantes de experimentos anteriores, puede afectar drásticamente la estequiometría y proporcionar una competencia desconocida en los experimentos de unión. El dicroísmo circular es otro método para estudiar las interacciones entre péptidos metálicos o proteínas metálicas porque analiza la quiralidad. La espectrometría de masas también puede interrogar estos complejos al observar los cambios en la masa.Este conjunto de técnicas ha sido utilizado por muchos laboratorios que estudian iones metálicos que interactúan con péptidos o proteínas.

quantifying-binding-interactions-between-cu-ii-peptide-residues

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Se determinó la estructura de la solución de RMN de un péptido modelo de metalochaperona con Cu (I), y se describe un protocolo detallado desde la preparación de la muestra y la recopilación de datos 1D y 2D hasta una estructura tridimensional.

Determinación de la estructura y coordinación de complejos péptido-metal mediante RMN 1D y 2D 1h

El cribado de matrices de péptidos es un ensayo de alto rendimiento para identificar los sitios de interacción proteína-proteína. Esto permite mapear múltiples interacciones de una proteína diana y puede servir como método para identificar sitios para inhibidores que se dirigen a una proteína. Aquí describimos un protocolo para el cribado y análisis de matrices de péptidos.

La identificación de sitios de interacción proteína-proteína utilizando péptido arrays

Este manuscrito describe cómo realizar ensayos basados en la Transferencia de Energía por Resonancia de Förster (FRET) (molécula única) para medir la dinámica de unión entre el receptor de antígeno de células T (TCR) y las moléculas MHC cargadas de péptidos antigénicos a medida que ocurren dentro de la sinapsis inmunológica de una célula T en contacto con una bicapa lipídica plana funcionalizada con soporte.

Medición de TCR-pMHC Encuadernación<em&gt; In Situ</em&gt; Usando un ensayo de microscopía basada en FRET

Este protocolo detalla los pasos importantes que se requieren para la bioconjugación de una cisteína que contiene proteína a una maleimida, incluyendo la purificación de reactivos, condiciones de reacción, purificación y caracterización bioconjugado bioconjugado.

Síntesis de Proteínas bioconjugados<em&gt; vía</em&gt; Química cisteína-maleimida

Describimos aquí un método para la identificación de proteínas de unión a moléculas pequeñas utilizando el marcaje de fotoafinidad. La ventaja de esta técnica es que la unión y el marcaje covalente de las proteínas diana se producen dentro del entorno celular vivo, lo que elimina el riesgo de alterar la estructura de la proteína nativa y las condiciones de unión durante la lisis celular.

Identificación de las pequeñas proteínas de unión a la molécula-celular en un entorno nativo de Células vivas marcado por fotoafinidad

La interacción entre los canales HCN y su subunidad auxiliar ha sido identificado como un objetivo terapéutico en el trastorno depresivo mayor. Aquí, un método basado en la polarización de fluorescencia para identificar inhibidores de molécula pequeña de esta interacción proteína-proteína, se presenta.

Método para la identificación de inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción proteína-proteína entre HCN1 y TRIP8b

Aquí presentamos una bicapa lipídica soportada en el contexto de una plataforma microfluídica para estudiar las interacciones proteína-fosfoinositido utilizando un método libre de etiquetas basado en la modulación del pH.

PIP-on-a-chip: un estudio sin etiquetas de las interacciones proteína-fosfoinositida

Aquí, la acumulación de iones cuprosas en un sulfato de cobre galjanoplastia solución en un experimento de modelo y un análisis basado en las medidas cuantitativas se describen. Este experimento reproduce el proceso de acumulación de los iones cuprosas en el baño de la galjanoplastia.

Acumulación y análisis de los iones cuprosas en un sulfato de cobre, solución de la galjanoplastia

Las técnicas de modelado molecular y espectrometría de masas de movilidad ión pueden caracterizar el rendimiento selectivo de quelantes metálicos de los péptidos de unión a metales diseñados y el péptido de unión de cobre methanobactin. El desarrollo de nuevas clases de péptidos quelantes metálicos ayudará a llevar a terapias para enfermedades asociadas con el desequilibrio de iones metálicos.

Técnicas de Espectrometría de Masa de Movilidad de Iones para Determinar la Estructura y Mecanismos de Reconocimiento de Iones Metálicos y Actividad Redox de Oligopéptidos de Unión De Metal

Este artículo describe un protocolo experimental que utiliza espectrometría de masas de movilidad de iones por electrospray, cálculos cuánticos semiempíricos y disociación inducida por colisión de umbral resuelta por energía para medir la termoquímica relativa de la disociación de complejos metálicos ternarios relacionados.

Estudios termoquímicos de complejos ternarios de Ni(II) y Zn(II) utilizando movilidad iónica-espectrometría de masas

Aprende a cuantificar la termodinámica de unión de Cu(II) a péptidos mediante espectroscopía de absorción electrónica y calorimetría de titulación isotérmica. Estas técnicas ortogonales permiten estudiar interacciones metal-péptido con precisión.

Cuantificación de las interacciones de unión entre cu(II) y residuos peptídicos en presencia y ausencia de cromóforos

Explorar más videos