Name: Sondeo de la mecánica del conjunto de miosina en haces de filamentos de actina utilizando pinzas ópticas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Aprende a medir la mecánica de conjuntos de miosina en haces de filamentos de actina utilizando pinzas ópticas. Este protocolo modular permite estudiar la dinámica de proteínas motoras con alta precisión en sistemas citoesqueléticos.

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Este trabajo es apoyado en parte por la Beca de Investigación del Consejo de Estudiantes Graduados de la Universidad de Mississippi (OA), la Universidad de Mississippi Sally McDonnell-Barksdale Honors College (JCW, JER), el Consorcio de Subvenciones Espaciales de Mississippi bajo el número de subvención NNX15AH78H (JCW, DNR) y la Asociación Americana del Corazón bajo el número de subvención 848586 (DNR).

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Se realizó un estudio in vitro utilizando pinzas ópticas combinadas con imágenes de fluorescencia para investigar la dinámica de los conjuntos de miosina que interactúan con los filamentos de actina. Los haces de actina-miosina-actina se ensamblaron utilizando miosina muscular II, actina rodamina en la parte inferior del haz y en la superficie del cubreobjetos, y filamentos de actina biotinilados marcados con 488 en la parte superior del paquete. La proteína de actina del músculo del conejo se polimerizó y estab...

Las proteínas motoras son esenciales para la vida, convirtiendo la energía química en trabajo mecánico 1,2,3. Los motores de miosina interactúan con los filamentos de actina dando pasos a lo largo de los filamentos similares a una pista, y la dinámica de las redes actina-miosina lleva a cabo la contracción muscular, la motilidad celular, el anillo contráctil durante la citocinesis y el movimiento de la carga dentro de la célula, entre otras tareas esenciales 3,4,5,6,7,8 . Dado que las miosinas tienen tantas funciones esenciales, la falla en la funcionalidad de la red miosina-actina puede conducir al desarrollo de enfermedades, como mutaciones en la cadena pesada de miosina que causan hipercontractilidad cardíaca en la miocardiopatía hipertrófica (MCH)9,10,11,12,13,14 . En la contracción muscular, los motores individuales de miosina cooperan entre sí trabajando como un conjunto para proporcionar la energía mecánica requerida que lleva a cabo el deslizamiento relativo de las FA 4,15,16,17,18. Los motores de miosina forman puentes cruzados entre los AF y utilizan cambios conformacionales debido a su ciclo mecanoquímico para moverse colectivamente hacia el extremo de púas de los filamentos alineados 17,18,19,20,21.
El desarrollo de ensayos cuantitativos de motilidad in vitro a nivel de SM utilizando técnicas como la captura óptica ha facilitado la recopilación de detalles sin precedentes sobre cómo funcionan los motores de miosina individuales, incluida la medición de la generación de fuerza SM y los tamaños de paso 22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Finer et al. desarrollaron el ensayo de atrapamiento óptico de "tres perlas" o "mancuernas" para sondear la mecánica de generación de fuerza de motores de miosina II23,31. Como la miosina muscular II trabaja en equipos para contraer AF pero no es procesiva a nivel SM, la orientación del ensayo de captura óptica tuvo que reorganizarse a partir del enfoque clásico de perlas ligadas al motor32. Para formar el ensayo de mancuernas, se utilizaron dos trampas ópticas para sostener un AF sobre un motor de miosina unido a un cordón adherido a un cubreobjetos, y la salida de fuerza del motor único se midió a través de los movimientos del AF dentro de la trampa23.
Sin embargo, las fuerzas SM y el uso de una orientación de ensayo de un solo motor / filamento único no dan una imagen completa sobre la generación de fuerza a nivel de sistema, ya que muchas proteínas motoras, incluida la miosina II, no funcionan de forma aislada y, a menudo, no funcionan como una suma de sus partes 15,16,17,32,33,34,35,36 . Son necesarias estructuras más complejas que incluyan más de un motor interactuando con más de un filamento para comprender mejor la sinergia de las redes de filamentos de miosina y actina15,32. La orientación del ensayo con mancuernas se ha explotado para investigar la generación de fuerza de conjuntos pequeños al tener múltiples miosinas unidas a un cordón o usar un filamento grueso de miosina unido a una superficie y permitir que los motores interactúen con el AF suspendido 4,23,34,37,38,39,40.
Otros ensayos de conjunto pequeño incluyen un ensayo de deslizamiento de filamentos in vitro en el que los motores de miosina están recubiertos sobre una superficie de cubreobjetos, y se utiliza un cordón unido a un AF para sondear la fuerza generada por el equipo de motores 4,35,36,38,39,40,41,42,43 . En ambos casos, las miosinas están unidas a una superficie rígida (perla o cubreobjetos) y utilizan un AF. En estos casos, los motores no son capaces de moverse libremente o comunicarse entre sí, ni tener miosinas rígidamente unidas refleja el ambiente jerárquico y compatible en el que los motores trabajarían juntos en el sarcómero32. Estudios previos han sugerido que la miosina II puede detectar su entorno y adaptarse en consecuencia a las cambiantes condiciones de concentración viscoelástica o motora alterando características como la generación de fuerza y la relación de trabajo41,44,45. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar un ensayo de captura óptica que fomente y capture la comunicación motora y el cumplimiento del sistema para pintar una imagen más realista de los fundamentos mecanicistas de la generación de fuerza del conjunto de miosina II.
Aquí, desarrollamos un método para acoplar la estructura jerárquica in vitro con la captura óptica formando haces de actomiosina o sándwiches que consisten en múltiples motores de miosina que interactúan entre dos filamentos de actina. Esta geometría de ensayo modular tiene la capacidad de sondear directamente cómo los factores moleculares y ambientales influyen en la generación de fuerza de miosina en conjunto. Además, la investigación de los mecanismos de generación de fuerza a través de estos conjuntos de actina-miosina tiene el potencial de ayudar a modelar y comprender cómo las tareas celulares a gran escala, como la contracción muscular, se propagan desde el nivel molecular 9,10,13.

<table><tbody><tr><td>Proteína de actina (biotina): músculo esquelético</td><td>Citoesqueleto</td><td>AB07-A</td><td>Proteína de actina biotinilada</td></tr><tr><td>Proteína de actina, músculo esquelético de conejo</td><td>Citoesqueleto</td><td>AKL99-A Proteína</td><td>de actina</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>estabilizador de actina y Alexa Fluor 488 tinción</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher scientific</td><td>BP413-25</td><td>Requerido para la actina Ensamblaje y motilidad de la miosina</td></tr><tr><td>Beta-D-glucosa</td><td>Fisher scientific MP218069110</td><td></td><td>Parte del sistema de eliminación de oxígeno utilizado para reducir el fotoblanqueo durante la obtención de imágenes de fluorescencia</td></tr><tr><td>Bloqueador de grado de transferencia (caseína)</td><td>Biorad</td><td>1706404</td><td>Se utiliza para bloquear la superficie de la unión inespecífica</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher scientific</td><td>C79500</td><td>Cloruro de calcio, proporciona el control necesario sobre la dinámica de la red de miosina de actina</td></tr><tr><td>Catalasa</td><td>Fisher scientific</td><td>ICN10040280</td><td>Parte del sistema de eliminación de oxígeno utilizado para reducir el fotoblanqueo durante la obtención de imágenes de fluorescencia</td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Fisher scientific</td><td>12544C</td><td>Se utiliza para fabricar celdas de flujo</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher scientific</td><td>AC327190010</td><td>Se utiliza para la preparación</td></tr> <tr><td>de tamponesEtanol</td><td>Fisher scientific</td><td>A4094</td><td>Regent utilizado para la limpieza de cubreobjetos</td></tr><tr><td>Glucosa oxidasa</td><td>Fisher scientific</td><td>34-538-610KU</td><td>Parte del sistema de eliminación de oxígeno utilizado para reducir el fotoblanqueo durante la obtención de imágenes de fluorescencia</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher scientific</td><td>P217-500</td><td>Se utiliza para la preparación de tampones</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher scientific</td><td>P250-1</td><td>Se utiliza para grabar cubreobjetos y ajustar tampón pH</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher scientific</td><td>M33-500</td><td>Se utiliza para la preparación de tampones</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher scientific</td><td>12-544-2</td><td>Se utiliza para fabricar células de flujo</td></tr><tr><td>Proteína de miosina II: músculo esquelético de conejo</td><td>Citoesqueleto</td><td>MY02</td><td>Proteína motora de miosina de longitud completa aislada del músculo esquelético de conejo</td></tr><tr><td>Nanotracker2</td><td>Bruker/JPK</td><td>NT2</td><td>Instrumento de captura óptica</td></tr><tr><td>Poly-l-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>Instalaciones adhesión de filamentos de actina sobre la superficie de vidrio del cubreobjetos</td></tr><tr><td>Rodamina Faloidina</td><td></td><td>Citoesqueleto PHDR1</td><td>Estabilizador de actina y tinción fluorescente de rodamina</td></tr><tr><td>Perlas de estreptavidina, 1 &mu; m</td><td>Spherotech</td><td>SVP-10-5</td><td>Mango de captura óptica</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher scientific</td><td>PR H5121</td><td>Se utiliza para la preparación de tampones</td></tr></tbody></table>

sondeo de la mecánica del conjunto de miosina en haces de filamentos de actina utilizando pinzas ópticas

Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers

Las miosinas son proteínas motoras que hidrolizan ATP para avanzar a lo largo de las pistas de filamentos de actina (FA) y son esenciales en procesos celulares como la motilidad y la contracción muscular. Para comprender sus mecanismos de generación de fuerza, la miosina II se ha investigado tanto a nivel de molécula única (SM) como como equipos de motores in vitro utilizando métodos biofísicos como el atrapamiento óptico.
Estos estudios mostraron que el comportamiento generador de fuerza de miosina puede diferir mucho cuando se mueve desde el nivel de una sola molécula en una disposición de tres perlas a grupos de motores que trabajan juntos en una superficie rígida de talón o cubreobjetos en una disposición de deslizamiento. Sin embargo, estas construcciones de ensayo no permiten evaluar la dinámica de grupo de la miosina dentro de la jerarquía estructural viscoelástica como lo harían dentro de una célula. Hemos desarrollado un método que utiliza pinzas ópticas para investigar la mecánica de la generación de fuerza por conjuntos de miosina que interactúan con múltiples filamentos de actina.
Estos paquetes de actomiosina facilitan la investigación en un entorno jerárquico y compatible que captura la comunicación motora y la salida de fuerza del conjunto. La naturaleza personalizable del ensayo permite alterar las condiciones experimentales para comprender cómo las modificaciones al conjunto de miosina, el haz de filamentos de actina o el entorno circundante dan como resultado diferentes salidas de fuerza.

Las células de flujo que contienen los sistemas de haz de actomiosina son de un diseño estándar, que consiste en un portaobjetos de microscopio y un cubreobjetos grabados separados por un canal hecho de cinta adhesiva de doble cara (Figura 1). Luego, el ensayo se construye desde el cubreobjetos utilizando introducciones escalonadas como se describe en el protocolo. El ensayo final consiste en filamentos de actina marcados con rodamina plantilla; la concentración de miosina deseada (se utiliz...

Se presenta y discute la formación de haces de actomiosina in vitro y la medición de la generación de fuerza del conjunto de miosina utilizando pinzas ópticas.

Sondeo de la mecánica del conjunto de miosina en haces de filamentos de actina utilizando pinzas ópticas

Myosins are motor proteins that hydrolyze ATP to step along actin filament (AF) tracks and are essential in cellular processes such as motility and muscle ...

La investigación del comportamiento de la actina utilizando este protocolo es importante porque permite al usuario sondear la dinámica del conjunto de proteínas motoras utilizando la precisión del atrapamiento óptico. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de medir la mecánica de la miosina dentro de la jerarquía estructural de actina, a diferencia de la orientación tradicional de un solo filamento de un solo motor utilizada en muchos experimentos de captura óptica. Otra ventaja de este protocolo es su naturaleza modular, que permite al usuario personalizar el ensayo al sistema de citoesqueleto jerárquico de su elección.Para comenzar, aplique dos piezas de cinta adhesiva de doble cara en el centro de un portaobjetos de microscopio a tres o cuatro milímetros de distancia entre sí. Luego rasgue o corte el exceso de cinta que cuelga del borde de la diapositiva. A continuación, agregue el deslizamiento de la cubierta recubierto con PLL en la parte superior de la cinta perpendicular al eje largo del portaobjetos del microscopio para formar un canal.Usando un pequeño tubo para comprimir el deslizamiento de la cubierta sobre la cinta y el microscopio, deslice completamente h

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Investigación

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Bioengineering

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Se trata de un paso a paso guía que muestra el propósito, el funcionamiento y los resultados representativos de la fuerza de la gravedad del espectrómetro novela.

Demostrando la Utilización del Espectrómetro de Novela de la Fuerza gravitacional para estirar y medir las proteínas fibrosas

Aquí se presenta un procedimiento para expresar y purificar la miosina 5a seguido de una discusión de su caracterización, utilizando ensayos basados en microscopía de fluorescencia in vitro de conjunto y molécula única, y cómo estos métodos pueden modificarse para la caracterización de la miosina 2b no muscular.

Adaptaciones específicas de miosina de ensayos de motilidad basados en microscopía de fluorescencia in vitro

Aquí se presenta un protocolo integral para realizar experimentos ultrarrápidos de abrazadera de fuerza en motores de miosina-5 procesuales, que podrían extenderse fácilmente al estudio de otras clases de motores de proceso. El protocolo detalla todos los pasos necesarios, desde la configuración del aparato experimental hasta la preparación de muestras, la adquisición de datos y el análisis.

Disección de las propiedades mecanoenzimáticas de miosinas procesivas con espectroscopia ultrarrápida de pinza de fuerza

Este protocolo presenta un flujo de trabajo experimental completo para estudiar las interacciones ARN-proteína utilizando pinzas ópticas. Se describen varias configuraciones experimentales posibles, incluida la combinación de pinzas ópticas con microscopía confocal.

Pinzas ópticas para estudiar las interacciones ARN-proteína en la regulación de la traducción

Aquí, presentamos un protocolo para investigar las propiedades mecánicas intracelulares de células embrionarias aisladas de pez cebra en confinamiento tridimensional con medición directa de la fuerza mediante una trampa óptica.

Mediciones directas de la fuerza de la mecánica subcelular en confinamiento utilizando pinzas ópticas

Aquí, presentamos un protocolo para reconstituir haces de microtúbulos in vitro y cuantificar directamente las fuerzas ejercidas dentro de ellos utilizando trampeo óptico simultáneo y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Este ensayo permite la medición a nivel nanométrico de las fuerzas y desplazamientos generados por los conjuntos de proteínas dentro de las redes de microtúbulos activos.

Medición directa de las fuerzas dentro de haces de microtúbulos activos reconstituidos

Presentamos protocolos para ensayos microfluídicos de filamentos de actina simples, en combinación con microscopía de fluorescencia, que permiten monitorear con precisión filamentos de actina individuales en tiempo real mientras se exponen secuencialmente a diferentes soluciones de proteínas.

Uso de microfluídica y microscopía de fluorescencia para estudiar la dinámica de ensamblaje de filamentos y haces de actina única

Este artículo presenta protocolos para la ingeniería y caracterización de redes compuestas tridimensionales sintonizables de filamentos de actina coentrelazados y microtúbulos. Los compuestos experimentan una reestructuración activa y movimiento balístico, impulsado por motores de miosina II y quinesina, y están sintonizados por las concentraciones relativas de actina, microtúbulos, proteínas motoras y reticulantes pasivos.

Reconstitución y caracterización de compuestos de actina-microtúbulos con dinámica y mecánica accionada por motor sintonizable

En este trabajo, se emplea un enfoque de reconstitución in vitro para estudiar la poroelasticidad de los geles de actomiosina en condiciones controladas. Se cuantifica la dinámica del gel de actomiosina y el disolvente incrustado, a través de la cual se demuestra la porosidad de la red. También discutimos los desafíos experimentales, las trampas comunes y la relevancia para la mecánica del citoesqueleto celular.

La mecánica de las redes de actomiosina contráctil (poro-)elástica como sistema modelo del citoesqueleto celular

Aquí, presentamos métodos para preparar ensamblajes de actina cuasi-bidimensionales (2D) entrelazados, reticulados y de cristal líquido a partir de proteínas purificadas.

Ajuste de los modos de contractilidad y deformación de ensamblajes activos basados en actina in vitro: de redes activas bidimensionales a gotas de cristal líquido

Aprende a medir la mecánica de conjuntos de miosina en haces de filamentos de actina utilizando pinzas ópticas. Este protocolo modular permite estudiar la dinámica de proteínas motoras con alta precisión en sistemas citoesqueléticos.

Sondeo de la mecánica del conjunto de miosina en haces de filamentos de actina utilizando pinzas ópticas

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